脂肪干细胞
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图1｜细胞共培养模型
结果：将脂肪干细胞、血管内皮细胞以及成纤维细胞共培养分为以下4组：①脂肪干细胞组；②脂肪干细胞+血管内皮细胞共培养组(细胞比例1∶1)；③脂肪干细胞+成纤维细胞共培养组(细胞比例1∶1)；④脂肪干细胞+血管内皮细胞+成纤维细胞共培养组(细胞比例1∶1∶1)。将脂肪干细胞以每孔5×104的细胞密度接种于20块6孔板的Transwell小室中，血管内皮细胞和成纤维细胞按分组接种于6孔板中，通过孔径为0.4 μm的Transwell小室建立非接触共培养模型[5]，放入37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至一定数量时将血清体积分数降至2%维持培养，共培养2周时显微镜下观察记录。培养模型如图1所示。
图2｜脂肪干细胞形态和免疫荧光染色及成骨诱导鉴定(A，G，H标尺为50 μm，B标尺为100 μm，C-F标尺为200 μm)
结果：倒置相差显微镜下观察，稳定传至4周3代后可见大量梭形细胞和多角形细胞，胞体大，核居中，呈巢状生长，排列紧凑且规律。表面抗原鉴定显示：第3代脂肪干细胞免疫荧光检测CD90、CD105染色均为阳性表达[8]，CD133、vWF均阴性表达，阴性对照未发现阳性细胞；成骨诱导14 d时，碱性磷酸酶染色可见多数细胞呈阳性，细胞融合成团，蓝黑色颗粒状相互融合交错成网状排列；茜素红钙染色可见细胞部分融合，形成片状的钙化，呈大片红色钙结节影。染色结果证明其具有成骨分化能力，故判定所获细胞为脂肪干细胞[9]，见图2。
图3｜血管内皮细胞形态学观察及免疫荧光染色鉴定(A标尺为50 μm，B标尺为100 μm，C-E标尺为200 μm)
结果：倒置相差显微镜下观察，细胞增长数量多，形态呈多样化，有梭形和多角形混合生长，呈团、束状排列，亦单个散在分布。表面抗原鉴定显示：传代培养至3周时血管内皮细胞免疫荧光检测CD133、vWF染色均为阳性表达[10]，CD90染色为阴性表达，阴性对照未发现阳性细胞，见图3。
图4｜成纤维细胞形态学观察及免疫荧光染色鉴定(A标尺为50 μm，B标尺为100 μm，C，D标尺为200 μm)
结果：倒置相差显微镜下观，细胞数目较多，胞体大，多为梭形、纺锤形的扁平细胞，也有部分形态呈现不规则，细胞间以细长突起相互交联，呈漩涡状密集排列。传代培养至3周时成纤维细胞免疫荧光检测Vimentin(波形蛋白)染色为阳性表达[11]，Actin(肌动蛋白)染色为阴性表达，阴性对照未发现阳性细胞，见图4。
图5｜各组脂肪干细胞形态学观察(标尺为50 μm)
结果：各组脂肪干细胞培养至2周时，镜下观察细胞形态，见图5。
图7｜共培养各时间点各组脂肪干细胞茜素红染色(标尺为50 μm)
结果：第7天时各组细胞均呈阴性反应；第14天时，混合培养各组细胞均出现极少量红色阳性细胞；第21天，混合培养各组细胞红色阳性细胞增多，以脂肪干细胞+血管内皮细胞+成纤维细胞共培养组增加最为明显；第28天时，各组细胞均有红色阳性细胞，以脂肪干细胞+血管内皮细胞+成纤维细胞共培养组最多，呈红色灶状，脂肪干细胞+血管内皮细胞共培养组和脂肪干细胞+成纤维细胞共培养组较少，脂肪干细胞组最少，见图7。
图8｜共培养各时间点各组脂肪干细胞碱性磷酸酶染色(标尺为50 μm)
结果：第7天时除脂肪干细胞组呈阴性反应，其余各组均开始出现阳性颗粒，以脂肪干细胞+血管内皮细胞+成纤维细胞共培养组最多；第14天时，各组细胞均出现红色阳性颗粒，以脂肪干细胞+成纤维细胞共培养组、脂肪干细胞+血管内皮细胞+成纤维细胞共培养组较为明显；第21天，混合培养各组细胞红色阳性颗粒增多，以脂肪干细胞+血管内皮细胞+成纤维细胞共培养组增加最为明显；第28天时，除脂肪干细胞组仍不明显，其余各组细胞均有明显红色阳性颗粒，以脂肪干细胞+成纤维细胞共培养组、脂肪干细胞+血管内皮细胞+成纤维细胞共培养组最多，脂肪干细胞+血管内皮细胞共培养组较少，脂肪干细胞组最少，见图8。