异银杏素对破骨细胞分化的影响和机制

doi:10.12307/2026.552

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (6): 1348-1358.doi: 10.12307/2026.552

• 骨组织构建 bone tissue construction • 上一篇下一篇

异银杏素对破骨细胞分化的影响和机制

温广伟1，2，3，甄颖豪2，4，郑泰铿2，4，周淑怡2，莫国业2，周腾鹏2，3，李海山2，4，赖以毅2，3

1广州市番禺区化龙医院，广东省广州市 510405；2广州中医药大学，广东省广州市 510405；3广州市荔湾区骨伤科医院，广东省广州市 510405；4广州中医药大学岭南医学研究中心，广东省广州市 510405

收稿日期:2024-11-14 接受日期:2025-01-25 出版日期:2026-02-28 发布日期:2025-07-12
通讯作者: 赖以毅，硕士，副主任医师，广州中医药大学，广东省广州市 510405；广州市荔湾区骨伤科医院，广东省广州市 510405 并列通讯作者：李海山，博士，医师，广州中医药大学，广东省广州市 510405；广州中医药大学岭南医学研究中心，广东省广州市 510405
作者简介:温广伟，男，1989年生，广东省广州市人，汉族，主治医师，主要从事脊柱退行性疾病诊疗与骨质疏松疾病防治研究。
基金资助:
广州市卫生健康科技项目(20241A010093)，项目负责人：温广伟；荔湾区民生科技项目(20230713)，项目负责人：温广伟；
广东省中医药局科研项目(20241091)，项目负责人：莫国业；广州市卫生健康科技项目(20251A011106)，项目负责人：周腾鹏

Effects and mechanisms of isoginkgetin on osteoclastogenesis

Wen Guangwei1, 2, 3, Zhen Yinghao2, 4, Zheng Taikeng2, 4, Zhou Shuyi2, Mo Guoye2, Zhou Tengpeng2, 3, Li Haishan2, 4, Lai Yiyi2, 3

1Guangzhou Panyu District Hualong Hospital, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 2Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 3Guangzhou Liwan District Orthopedic and Traumatology Hospital, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 4Lingnan Medical Research Center, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China

Received:2024-11-14 Accepted:2025-01-25 Online:2026-02-28 Published:2025-07-12
Contact: Lai Yiyi, MS, Associate chief physician, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; Guangzhou Liwan District Orthopedic and Traumatology Hospital, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China Co-corresponding author: Li Haishan, PhD, Physician, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; Lingnan Medical Research Center, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
About author:Wen Guangwei, Attending physician, Guangzhou Panyu District Hualong Hospital, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; Guangzhou Liwan District Orthopedic and Traumatology Hospital, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
Guangzhou Municipal Health and Wellness Science and Technology Project, No. 20241A010093 (to WGW); Liwan District Livelihood Science and Technology Project, No. 20230713 (to WGW); Guangdong Provincial Bureau of Traditional Chinese Medicine Scientific Research Project, No. 20241091 (to MGY); Guangzhou Municipal Health and Wellness Science and Technology Project, No. 20251A011106 (to ZTP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
异银杏素：是一种来源于银杏提取物的黄酮类化合物，具有广泛的抗癌活性，并且能通过增强自噬来清除活性氧。
破骨细胞分化：破骨细胞是大型、多核的具有骨吸收功能的细胞，通过巨噬细胞集落刺激因子和核因子κB受体活化因子配体的刺激从髓系细胞分化而来。
活性氧：泛指氧来源的自由基和非自由基，在正常情况下，生理水平的活性氧能调控细胞内环境稳态、信号转导、增殖分化等生理活动，而高水平的活性氧则破坏氧化还原平衡，可致氧化损伤、功能障碍甚至细胞死亡。

背景：在骨重塑过程中，骨形成和骨吸收在空间和时间上是协调的，涉及破骨细胞和成骨细胞之间错综复杂的相互作用。异银杏素是在银杏中发现的一种黄酮类化合物，具有广泛的抗癌活性和抗活性氧活性，然而异银杏素对破骨细胞分化的影响尚不清楚。
目的：探讨异银杏素对破骨细胞分化的影响和作用机制。
方法：以小鼠骨髓来源巨噬细胞为研究对象，CCK-8细胞毒性实验检测不同浓度异银杏素对骨髓来源巨噬细胞活力的影响。使用巨噬细胞集落刺激因子和核因子κB受体活化因子配体诱导骨髓来源巨噬细胞向破骨细胞分化，网络药理学和分子对接、分子动力学模拟用于预测异银杏素对破骨细胞分化影响的进程和靶点；抗酒石酸酸性磷酸酶染色和F-actin染色检测异银杏素对破骨细胞分化和功能的影响；Western blot及RT-PCR检测异银杏素对破骨细胞分化、活性氧相关和PI3K/AKT通路基因、蛋白表达的影响；荧光探针检测细胞活性氧和线粒体活性氧水平；流式细胞术检测细胞活性氧水平。
结果与结论：①网络药理学结果显示异银杏素主要通过PI3K/AKT通路、细胞对药物和缺氧的反应影响破骨细胞分化，GSK3β、ESR1、MCL1及CCNA2等是关键靶点；②CCK-8和抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果表明异银杏素浓度为8 μmol/L时抑制破骨细胞分化的效果最显著，F-actin结果显示异银杏素以浓度依赖性地抑制破骨细胞骨架肌动蛋白环形成；③分子动力学模拟表明异银杏素与破骨细胞分化标志蛋白(NFATc1、c-Fos、CTSK和MMP9)存在较稳定的结合，Western blot和RT-PCR结果显示异银杏素抑制破骨细胞分化标志蛋白和基因(NFATc1、c-Fos、CTSK和MMP9)的表达；④Western blot结果显示异银杏素抑制PI3K、AKT、GSK3β的磷酸化水平，激活PI3K/AKT-GSK3β通路抑制破骨细胞分化；⑤活性氧检测结果显示异银杏素显著减少核因子κB受体活化因子配体诱导的细胞活性氧和线粒体活性氧的产生，抑制骨髓来源巨噬细胞向破骨细胞分化。
https://orcid.org/0009-0009-3643-0970(温广伟)；https://orcid.org/0009-0009-3643-0970(李海山)；https://orcid.org/0009-0001-5253-6486(赖以毅)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 异银杏素, 骨质疏松症, 骨髓来源巨噬细胞, 破骨细胞, 活性氧, PI3K, AKT, 工程化组织构建

Abstract: BACKGROUND: During bone remodeling, bone formation and bone resorption are spatially and temporally coordinated, involving intricate interactions between osteoclasts and osteoblasts. Isoginkgetin, a flavonoid found in Ginkgo biloba, has a wide range of anticancer activity and anti-reactive oxygen species activity; however, the effect of isoginkgetin on osteoclast differentiation is unknown.
OBJECTIVE: To study the effect and mechanism of action of isoginkgetin on osteoclastogenesis.
METHODS: In vitro studies were performed on mouse bone marrow-derived macrophages, and cell counting kit-8 cytotoxicity assay was used to detect the effect of isoginkgetin on cell viability of bone marrow-derived macrophages. Macrophage colony-stimulating factor and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand were used to induce the differentiation of bone marrow-derived macrophages to osteoclasts. Network pharmacology and molecular docking and molecular dynamics simulations were used to predict the processes and targets of the effects of isoginkgetin on the differentiation of osteoclasts. Tartrate-resistant acid phosphatase staining and F-actin staining were used to detect the effects of isoginkgetin on the differentiation and function of osteoclasts. Western blot and RT-PCR were used to detect the effects of isoginkgetin on the expression of genes and proteins related to osteoclast differentiation, reactive oxygen species, and PI3K/AKT pathways. Fluorescent probes were used to detect cellular and mitochondrial reactive oxygen species levels. Flow cytometry technology was used to detect reactive oxygen species levels in cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Network pharmacology results showed that isoginkgetin affected osteoporosis mainly through the PI3K-AKT pathway and cellular response to drugs and hypoxia, and GSK3β, ESR1, MCL1 and CCNA2 were the key targets. (2) Cell counting kit-8 and tartrate-resistant acid phosphatase staining results showed that isoginkgetin at 8 μmol/L had the most significant inhibitory effect on osteoclastogenesis in vitro, and F-actin results showed that isoginkgetin inhibited osteoclast cytoskeletal actin ring formation in a concentration-dependent manner. (3) Molecular dynamics simulations showed that isoginkgetin bound well to osteoclastogenesis marker proteins (NFATc1, c-Fos, CTSK, and MMP9). Western blot and RT-PCR results indicated that isoginkgetin inhibited the expression of osteoclastogenesis marker proteins and genes (NFATc1, c-Fos, CTSK, and MMP9). (4) Western blot results showed that isoginkgetin inhibited the phosphorylation level of PI3K/AKT/GSK3β and suppressed osteoclastogenesis by activating the PI3K-AKT-GSK3β pathway. (5) The results of reactive oxygen species assay showed that isoginkgetin significantly reduced receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand-induced cellular and mitochondrial reactive oxygen species production, and inhibited the differentiation of bone marrow-derived macrophages to osteoclasts.

Key words: isoginkgetin, osteoporosis, bone marrow-derived macrophages, osteoclast, reactive oxygen species, PI3K, AKT, engineered tissue construction

中图分类号:

温广伟, 甄颖豪, 郑泰铿, 周淑怡, 莫国业, 周腾鹏, 李海山, 赖以毅. 异银杏素对破骨细胞分化的影响和机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(6): 1348-1358.

Wen Guangwei, Zhen Yinghao, Zheng Taikeng, Zhou Shuyi, Mo Guoye, Zhou Tengpeng, Li Haishan, Lai Yiyi. Effects and mechanisms of isoginkgetin on osteoclastogenesis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(6): 1348-1358.

图/表（结果） 7

2.1 异银杏素作用骨质疏松症靶点筛选和蛋白互作网络构建通过检索Swiss Target Prediction数据库共获得骨质疏松症潜在靶点7 023个；通过Genecards、OMIM、TTD和DisGeNET数据库检索去重后得到121个破骨细胞分化相关靶点，韦恩图取交集后得到75个异银杏素干预骨质疏松症的潜在靶点(图1A)。将75个潜在的交叉靶点导入STRING数据库，获得蛋白互作网络图(图1B，C)；使用Cytoscape软件进行可视化，获得GSK3β、ESR1、MCL1及CCNA2等关键靶点(图1D)。
2.2 GO/KEGG富集分析功能富集分析结果发现异银杏素作用骨质疏松症在生物学过程主要涉及药物反应、肽基丝氨酸磷酸化和对缺氧的反应等，细胞组分主要涉及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物和蛋白激酶复合物等，分子功能主要涉及蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性和转录激活子结合等(图2A)。异银杏素作用骨质疏松症关联的通路主要是PI3K/AKT信号通路等(图2B)，这些结果表明异银杏素可能通过激活PI3K/AKT通路和细胞对药物、缺氧的反应影响骨质疏松症。
2.3 异银杏素抑制BMDM向破骨细胞分化图3A展示了异银杏素的CAS号和结构式。CCK-8结果显示异银杏素在10 μmol/L以下对BMDM增殖无明显细胞毒性(图3B)。用不同浓度的异银杏素干预BMDM并诱导其向破骨细胞分化，破骨细胞特异性抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果显示在没有异银杏素影响时，BMDM向破骨细胞分化显著，随着异银杏素浓度增加，BMDM向破骨细胞分化受到明显抑制，当异银杏素浓度为8 μmol/L时抑制效果最显著(图3C，D)。综上可见，异银杏素对BMDM增殖无明显细胞毒性影响，并且呈浓度依赖性抑制BMDM向破骨细胞分化。
2.4 异银杏素抑制细胞骨架F-actin环形成破骨细胞分化过程中伴随着细胞核的聚集和细胞形态的巨大化，F-actin环帮助重组细胞骨架，为破骨细胞的融合分化提供结构支持[5，11]。使用罗丹明鬼笔环肽染液探讨异银杏素对F-actin环的影响，荧光染色结果显示与4 μmol/L异银杏素相比，8 μmol/L异银杏素更加明显抑制F-actin环面积的扩大和环内细胞核的聚集(图4A，B)，从而抑制BMDM向破骨细胞分化。
2.5 异银杏素与破骨细胞分化靶点的分子动力学模拟众所周知，NFATc1是破骨细胞分化过程中的关键转录因子，NFATc1通过结合自身启动子来自我扩增，引起下游基因(如c-fos、CTSK和MMP9)表达上升[9]。通过分子动力学模拟探讨异银杏素对破骨细胞分化标志蛋白的直接结合情况，结果显示异银杏素-NFATc1和异银杏素-c-Fos复合物在整个分子动力学模拟过程中处于较稳定状态，而异银杏素-CTSK和异银杏素-MMP9复合物的结合稳定性较差(图5A-H)。分子动力学模拟结果表明异银杏素与NFATc1、c-fos、CTSK和MMP9均能直接结合，可能通过调控破骨细胞分化相关蛋白和基因来抑制破骨细胞分化。
2.6 异银杏素抑制破骨细胞标志蛋白和基因的表达 NFATc1的表达是破骨细胞发生的关键，而c-Fos能与NFATc1相互作用，引起破骨细胞基因的转录与表达，促进破骨细胞分化。CTSK和MMP9参与骨基质的降解，其表达在破骨细胞分化中明显升高[20]。通过Western blot检测异银杏素对破骨细胞分化相关蛋白(NFATc1、c-Fos、CTSK和MMP9)表达的影响，结果显示异银杏素在破骨细胞分化全程(第1-5天)抑制c-fos的表达(图6A，B)，在破骨细胞分化的中后期(第3-5天)抑制NFATc1、CTSK和MMP9的表达(图6C-E)。PCR检测结果以仅RANKL诱导为阳性对照，异银杏素呈浓度依赖性抑制c-fos、CTSK、MMP9和NFATc1的mRNA表达(图6F-I)。以上结果表明异银杏素通过降低破骨细胞分化蛋白和基因的表达抑制破骨细胞分化成熟。
2.7 异银杏素抑制PI3K/AKT通路激活进而抑制破骨细胞分化当RANKL与受体RANK结合时，会激活下游的PI3K/AKT信号通路，促进破骨细胞前体细胞的分化和成熟，而下游GSK3β的活性变化与破骨细胞分化相关蛋白MMP9、CTSK和NFATc1的表达水平有关[12]。结合2.1和2.2的网络药理学结果，采用Western blot检测异银杏素对PI3K/AKT通路及下游GSK3β的激活情况，结果显示异银杏素在RANKL激活破骨细胞早期分化的15-60 min内显著抑制了PI3K、AKT和GSK3β的磷酸化水平(图7A-D)。综上可见，PI3K/AKT通路确实是影响异银杏素抑制破骨细胞分化的主要信号通路。
2.8 异银杏素抑制RANKL诱导的活性氧产生在RANKL诱导破骨细胞分化中，细胞利用活性氧作为第二信使传递信号促进破骨细胞分化[21]，而线粒体是细胞产生活性氧的主要场所。通过使用细胞活性氧H2DCFDA探针和线粒体MitoSOX Red探针检测细胞活性氧和线粒体活性氧的产生情况[4]。荧光结果

表明RANKL诱导显著增加了细胞活性氧和线粒体活性氧的产生(图8A-C)，而异银杏素干预后明显减少了细胞活性氧和线粒体活性氧的产生，这可能与异银杏素抑制破骨细胞分化的作用有关。流式检测结果进一步验证了荧光探针检测结果(图8D，E)，异银杏素通过减少RANKL诱导的活性氧产生，抑制BMDM向破骨细胞分化。

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引言

在人口老龄化的背景下，骨质疏松症给社会带来了沉重的负担[1]。破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成相互协调维持骨代谢的平衡，相关机制研究发现骨代谢平衡破坏是由于破骨细胞的过度激活和募集[2]。破骨细胞是主要的骨吸收细胞，在各种因素引起的骨质流失中起主要作用[3]。在过去的几十年里，针对破骨细胞异常分化开发的药物显著增加[4-5]，但是当前治疗的“脱靶”效应导致寻找新的替代疗法显得尤为迫切[6]。通过深入了解破骨细胞的骨吸收机制以及调控破骨细胞发育和活动的细胞因子，可以为防治骨质疏松症提供潜在的治疗策略。
破骨细胞是由骨髓或单核细胞谱系前体细胞发育而成，这些前体细胞起源于骨髓并进入血液循环中[7]。核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL)是关键的破骨细胞生成激活剂[8-9]。当RANKL与核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor kappa-B，RANK)结合时，会触发各种通路[10]，包括丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)通路[11-12]。PI3K/AKT是一条细胞内信号转导通路，同时也响应细胞外信号，促进细胞增殖、代谢和生长，PI3K和AKT活性由一系列下游底物丝氨酸或苏氨酸残基的磷酸化介导[13]。活化T细胞核因子1(nuclear factor of activated T cells，cytoplasmic 1，NFATc1)是破骨细胞分化的重要参与者，最近多项研究发现抑制NFATc1可以抑制骨吸收以及破骨细胞分化[14]。因此，推测更有效的治疗骨质丢失的方法可能是抑制破骨细胞分化。
银杏(Ginkgo biloba L)是一种古老的裸子植物，被誉为植物界的“活化石”，银杏提取物在临床上用于治疗胸痹、心痛、脑卒中等血瘀引起的疾病[15]，还具有改善脑循环、增强记忆力、抗炎、抗氧化等多种药理作用[16]。现代药理研究表明银杏提取物EGb761通过NF-κB/p53信号通路抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，减轻肝损伤[17]。银杏叶提取物通过增强内皮细胞活性，抑制甲强龙诱导的细胞凋亡和功能丧失，对激素性股骨头坏死有潜在治疗作用[18]。
还有研究表明银杏叶提取物通过调节p38/MAPK和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)/MAPK信号传导，对骨髓间充质干细胞具有保护作用[19]。然而，关于异银杏素在骨质疏松症中的药理作用和分子机制尚不清楚。该研究旨在阐明异银杏素对RANKL诱导破骨细胞分化的作用和潜在的分子机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计以小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)为研究对象，通过体外应用含有RANKL和巨噬细胞集落刺激因子的完全培养基诱导BMDM向破骨细胞分化，加入异银杏素干预，探讨异银杏素对BMDM破骨分化的影响及潜在的分子机制。
1.2 时间及地点实验于2023年10月至2024年10月在广州中医药大学三元里校区的岭南医学研究中心完成。
1.3 材料 6-8周龄雌性C57BL/6小鼠20只，体质量(22±2) g，购买于广州中医药大学动物实验中心，许可证号：SCXK(粤)2018-0034，该研究已经通过广州中医药大学动物实验中心伦理委员会动物伦理审查备案，批准号：20230509002。
异银杏素(Isoginkgetin，CAS No. : 548-19-6，纯度 > 99%，MCE公司，美国)；α-MEM基础培养基、胎牛血清、0.25%胰酶和PBS (Gibco公司，美国)；巨噬细胞集落刺激因子(Protech公司，美国)；重组小鼠TRANCE/RANKL/TNFSF11(R&D公司，美国)，研究中RANKL工作质量浓度均为50 ng/mL；抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒(Sigma公司，美国)；罗丹明鬼笔环肽染液(赛默飞公司，美国)；其余试剂耗材、Western blot和免疫荧光所用一抗、二抗、仪器设备信息除文中标注外均在之前的研究中有详细说明[4，8]
1.4 实验方法
1.4.1 网络药理学分析从PubChem平台获取异银杏素的结构式代码，并将其输入到Swiss Target Prediction数据库中，以预测异银杏素的潜在靶标，结果以CSV格式导出，选择了“概率> 0”的数据。以“Isoginkgetin”和“Osteoporosis”为关键词，在Genecards、OMIM、TTD和DisGeNET数据库中搜索相关基因，然后合并和去重。利用Venny将之前获得的药物靶标和疾病靶标绘制成韦恩图，以识别交叉靶标，随后将交叉靶标数据重新组织并导入Cytoscape，以创建精细的“成分-靶标”网络图。为了构建蛋白互作网络，将交叉靶标导入STRING数据库进行蛋白互作分析，然后使用Cytoscape软件对潜在作用靶点数据进行可视化。将从蛋白互作网络中获得的交叉基因(不包括分离或游离基因)导入Metascape平台，进行GO功能和KEGG通路分析(颜色代表富集程度，颜色越红，富集程度越高且越显著，校正后的P值越小)，下载并整理TOP10的GO生物过程和TOP10的KEGG通路结果，然后使用微生物信息学平台制作气泡图。
1.4.2 分子对接和分子动力学模拟根据之前的研究方案[4]，从PubChem下载小分子配体的二维结构导入Chem3D进行结构优化，并导出为“mol2”文件。从Uniprot数据库中检索关键靶基因，从RCSB PDB数据库下载大分子受体的三维结构，然后使用PyMOL 2.5.5软件处理这些结构以去除水分子和任何现有的配体。使用AutoDockTools 1.5.7在靶标和活性成分之间进行分子对接以获得结合能，其中较小的值表示较强的结合亲和力。最后，使用PyMOL软件可视化和分析对接结果。为进一步阐明异银杏素与破骨细胞分化核心蛋白[c-fos/组织蛋白酶K(cathepsin K，CTSK)/基质金属蛋白酶9(matrix metallo proteinases-9，MMP-9)/NFATc1]的结合相互作用，对配体-受体复合物进行了额外的分子动力学模拟。利用Discovery Studio 2019软件的Simulation和Standard Dynamics Cascade模块建立配体和模拟过程的标准参数。在溶剂化模块计算中，受体-配体复合物被适当溶剂化，然后运行分子动力学模拟，并通过动画可视化构象变化。完成分子动力学计算后，利用轨迹模块分析分子动力学轨迹的结构特征，包括检查几何特性(距离、角度和二面角)，计算每个模拟框架中的非键相互作用的数量，计算不同构象之间的均方根偏差(RMSD)和均方根波动(RMSF)，以及检测异银杏素与破骨细胞分化核心蛋白之间形成的相互作用。
1.4.3 BMDM培养与纯化如先前的研究方案所述[4]，从C57BL/6J小鼠骨髓中获取BMDM，小鼠过量麻醉后于超净台中获取双下肢股骨，放入乙醇中转移至细胞超净台，切除两端骨骺，使用注射器冲洗骨髓腔，获得骨髓细胞悬液。将细胞悬液经过裂解红细胞处理后，用含有巨噬细胞集落刺激因子的完全培养基重悬于培养皿中，3 d后用无菌PBS清洗去除杂细胞，换液后继续培养，用第2代细胞进行后续实验。
1.4.4 CCK-8细胞毒性检测和抗酒石酸酸性磷酸酶染色实验将BMDM以8×103/孔密度接种于96孔板中，隔天将培养基换成含有不同浓度(0，2，4，6，8和10 μmol/L)异银杏素的培养基干预，2 d后在每个培养孔中加入CCK-8工作液，在避光下孵育2-4 h，全自动酶标仪(450 nm滤光片)测量吸光度值并统计分析实验结果。
确定异银杏素安全工作浓度后，设置RANKL组，RANKL+2 μmol/L异银杏素组，RANKL+4 μmol/L异银杏素组，RANKL+8 μmol/L异银杏素组。将BMDM按8×103/孔密度接种于96孔板后，按照分组同时加入含RANKL(50 ng/mL)和不同浓度异银杏素的培养基进行破骨细胞分化诱导，每隔48 h更换1次诱导培养基，诱导六七天，待RANKL组出现较多成熟破骨细胞后，弃培养基加入40 g/L多聚甲醛固定细胞
20 min，PBS清洗2次后加入抗酒石酸酸性磷酸酶染液进行染色，倒置显微镜(Leica，德国)观察，Image J软件进行定量分析。
1.4.5 鬼笔环肽F-actin环染色设置RANKL组，RANKL+4 μmol/L异银杏素组，RANKL+8 μmol/L异银杏素组，同1.4.4细胞种板、RANKL诱导、异银杏素干预处理，待RANKL组出现成熟破骨细胞后，弃培养基加入40 g/L多聚甲醛固定细胞，PBS清洗2次，加入鬼笔环肽染色工作液室温避光孵育1 h，弃掉染液加入DAPI染液孵育20 min，再次用PBS清洗，倒置荧光显微镜下获取荧光染色图像，使用Image J软件定量分析荧光强度。
1.4.6 细胞活性氧和线粒体活性氧荧光检测设置阴性对照组、RANKL组和RANKL+8 μmol/L异银杏素组，同1.4.4细胞种板、RANKL诱导、异银杏素干预处理，在干预2 d后弃培养基，用PBS清洗细胞，加入提前配置好的细胞活性氧H2DCFDA探针和线粒体MitoSOX Red荧光探针工作液，孵育完成后于488 nm和515-540 nm激发波长下在倒置荧光显微镜下拍摄荧光图像，Image J软件定量分析荧光强度。另外，将BMDM按1×105/孔密度接种于6孔板中，同前分组和干预条件，待细胞活性氧H2DCFDA探针孵育后，使用PBS将细胞收集于特定的流式管中，上流式细胞仪检测细胞活性氧荧光强度变化，Flow Jo软件定量分析荧光强度。
1.4.7 Western blot分析所用一抗和二抗明细详见先前的研究[4]，将BMDM以1×105/孔密度接种于6孔板后，设置仅用RANKL(50 ng/mL)干预的RANKL组和使用RANKL(50 ng/mL)+8 μmol/L异银杏素干预的给药组。干预0，15，30，45，60 min进行通路机制蛋白磷酸化检测，干预0，1，3，5 d进行破骨细胞功能相关蛋白检测，用RIPA裂解液(含蛋白酶、磷酸酶抑制剂)提取总蛋白，通过BCA法对蛋白浓度进行归一化处理，添加Loading buffer后蛋白变性，通过SDS-PAGE凝胶系统和Bio-Rad凝胶成像获得目的蛋白条带，用Image J软件进行条带灰度值分析(以β-actin为内参)。
1.4.8 RT-PCR实验检测方法和引物序列参考之前的研究方案[8]，设置阴性对照组(PBS)、RANKL组、RANKL+4 μmol/L异银杏素组、RANKL+8 μmol/L异银杏素组，干预4 d，使用SteadyPure通用型RNA提取试剂盒提取总mRNA，测定mRNA样品浓度和纯度后，用EVOM-MLV预混试剂盒将mRNA反转录成cDNA，根据扩增体系配置好反应样品后上Applied Biosystems PCR分析仪进行扩增。使用2-ΔΔCT方法对目的基因的表达进行分析(以β-actin为内参)。
1.5 主要观察指标 ①预测异银杏素影响骨质疏松症的主要作用通路和靶点；②不同浓度异银杏素对BMDM无毒性的安全浓度范围及BMDM向破骨分化的影响；③异银杏素对破骨细胞分化过程中PI3K/AKT通路磷酸化蛋白表达的影响；④异银杏素对破骨细胞分化过程中破骨细胞功能相关基因和蛋白表达的影响；⑤异银杏素对破骨分化过程中活性氧产生和抗氧化酶基因和蛋白表达的影响。
1.6 统计学分析使用SPSS 27.0和GraphPad Prism 8.0软件分别对统计结果进行分析和作图，结果数据以x±s表示。假设检验中，两组计量资料采用独立样本t检验，两组以上计量资料采用ANOVA方差分析。每个实验重复3次以上，以P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法已通过广州中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

在骨质疏松症、类风湿性关节炎、骨肿瘤转移等溶骨性骨病中观察到破骨细胞分化和骨吸收功能的过度激活，这些疾病常常伴有严重的不可逆的骨侵蚀甚至导致机体残疾[22-23]。在炎症性溶骨性疾病中，尽管现今有许多重大医学成就改善了炎症进程，但许多患者仍无法挽救或者恢复骨质破坏[7]。抑制破骨细胞分化仍是治疗溶骨性疾病的一种有前途的策略[24]，但目前临床上可选择的药物有限，且存在一些严重的不良反应[25]。最近，中医中药中的天然成分因治疗溶骨性疾病显示出巨大的潜力而越来越受到关注。异银杏素是来源于银杏的提取物，既往研究报道具有广泛的抗癌和良好的抗氧化作用[26]，预实验进一步肯定了异银杏素在抑制BMDM向破骨细胞分化中的作用。该研究首次报道了天然产物异银杏素可在体外抑制破骨细胞分化成熟，其机制可能是通过抑制破骨细胞骨架形成和减少活性氧产生，这将为临床骨质疏松症的替代治疗药物开发提供初步的实验依据。
近年来，网络药理学通过将药理学和药效学相结合，使研究人员能够通过对多种化合物的潜在多层次相互作用的评估来阐明它们的协同作用和潜在机制[27]。网络药理学结果表明异银杏素作用于破骨细胞分化的潜在靶点主要富集于PI3K/AKT等信号通路，该通路对于RANKL诱导的破骨细胞分化具有重要作用[28]。而分子动力学模拟表明异银杏素与NFATc1、c-Fos、CTSK、MMP9等破骨细胞分化关键靶点能直接结合，但结合稳定性不同，这可能与异银杏素抑制破骨细胞分化的潜能有关。体外实验证实了网络药理学的预测结果，异银杏素可显著抑制PI3K/AKT通路及下游GSK3β的激活，抑制破骨细胞分化和骨吸收相关蛋白、基因表达。
体外破骨细胞分化成熟的表型鉴定主要依靠抗酒石酸酸性磷酸酶染色[29]，研究发现异银杏素呈浓度梯度依赖性抑制RANKL诱导BMDM向破骨细胞分化。而判定功能性破骨细胞的有力证据是检测F-actin环的完整，这将用于衡量破骨细胞的细胞骨架形成和骨吸收功能的发挥[30]。在异银杏素干预后，破骨细胞的F-actin环形成和细胞融合受到明显阻碍。以上结果表明异银杏素在体外能抑制破骨细胞分化和细胞骨架F-actin环形成，这可能与影响破骨细胞骨吸收和分化过程中的信号传导密切相关。
NFATc1是调控破骨细胞形成和破骨细胞基因表达的主要开关和终端环节，可上调破骨细胞特异性基因和蛋白并促进破骨细胞分化成熟[31-32]。c-Fos与c-Jun构成破骨细胞分化过程中的转录因子AP-1，这对增强NFATc1的转录活性非常重要[33]，随后NFATc1的转录能激活下游基因启动，包括CTSK和MMP9，从而促进破骨细胞分化[20，34]。其中，MMP9在成熟破骨细胞中表达显著上升并介导破骨细胞的骨吸收功能[34]。在分子动力学结合模拟后，通过Western blot检测验证了异银杏素显著抑制NFATc1和c-Fos、CTSK、MMP9蛋白表达。PCR结果进一步表明异银杏素可抑制CTSK、c-Fos、MMP9、NFATc1等基因表达。综上，异银杏素可能通过抑制NFATc1的激活来抑制c-Fos、CTSK和MMP9表达，从而阻碍破骨细胞分化。
PI3K/AKT通路作为一种细胞代谢调节器，在RANKL诱导的破骨细胞分化中扮演着关键角色，研究发现PI3K/AKT还广泛参与促进细胞增殖和活化，并可由活性氧激活以调节细胞功能和代谢[13，35]。
MOON等[14]报道了AKT通过激活下游GSK3β/NFATc1信号级联促进破骨细胞生成，使用小干扰RNA构建AKT缺失细胞模型后，可抑制RANKL介导的破骨细胞形成。通过网络药理学预测了PI3K/AKT通路在异银杏素抑制破骨细胞分化中发挥显著作用，再结合实验验证了异银杏素能抑制PI3K/AKT及下游GSK3β的磷酸化水平。因此，PI3K/AKT-GSK3β通路和NFATc1信号激活，对于异银杏素抑制破骨细胞的分化成熟至关重要。
活性氧在炎症性疾病和骨质疏松症、类风湿性关节炎等骨骼疾病中起着调节作用[36]，许多由破骨细胞激活介导的骨病伴随着氧化还原失衡[37]。RANKL刺激后细胞内活性氧升高，从而促进破骨细胞分化和过度的骨吸收[22]。相反，用抗氧化剂处理后，活性氧产生和成熟破骨细胞数量均受到显著抑制[38-39]。因此，活性氧水平需要精细调控，以维持骨骼健康和骨转换的平衡。该研究首次报道了异银杏素对破骨细胞分化过程中活性氧的潜在调节作用，结果表明异银杏素有效减少了RANKL诱导的活性氧产生，特别是线粒体的活性氧产生，异银杏素可能是通过消减活性氧的产生实现对破骨细胞分化和活性的抑制。
综上可见，该研究首次发现异银杏素通过调控PI3K/AKT-GSK3β通路，减少RANKL诱导的活性氧产生和破骨细胞分化相关蛋白表达，对破骨细胞分化发挥抑制作用。聚焦临床上骨质疏松症治疗的“缺口”[40]，异银杏素很有希望作为破骨细胞分化抑制剂来进一步开发，凸显中药天然产物在相关补充替代疗法开发中的优势。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

异银杏素对破骨细胞分化的影响和机制

Effects and mechanisms of isoginkgetin on osteoclastogenesis

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