2.1  实验动物数量分析  参加实验动物数量为18只，进入结果分析数量为18只，中途并没有脱落。

2.2  4-羟基他莫昔芬给药量和Noggin过表达效率  采用CreER-LOXP系统条件性地对Noggin进行过表达，需要他莫昔芬的诱导，观察Noggin在不同时间点对毛囊生长的作用，见图1A。课题组曾用α-SMAcre雄鼠pMES-Noggin雌鼠进行交配，发现这样的母鼠无法怀孕分娩，其原因可能是α-SMAcre；pMES-Noggin胎儿发育不充分导致死亡，见图1B。因此该实验采用4-羟基他莫昔芬诱导方式条件性过表达Noggin进行研究。实验开始时采用出生后8，9，   10 d每天注射120 μL 4-羟基他莫昔芬的量，成年后观察实验小鼠生长状态不好，反应迟钝，体型消瘦，最后发现小鼠死亡，见图1C。作者猜测α-SMA广泛表达在心脏、血   管^[18]、肺等器官中^[19]，过量的他莫昔芬诱导可能导致这些器官发育异常，致使小鼠生长状态不好，乃至死亡。于是改变诱导方案，在出生后8，9 d注射他莫昔芬，成年后观察实验小鼠生长状态较好，见图1D。在后面的研究中都采用出生后8，9 d注射方案，确定了4-羟基他莫昔芬的给药量，还需要进一步确认在这个注射剂量下，是否能够检测到Noggin的过表达。对出生后28 d小鼠皮肤组织进行Noggin免疫组化染色，可以看出对照小鼠的真皮鞘中没有Noggin的表达(箭头所示真皮鞘细胞呈现梭状)，而在实验小鼠的真皮鞘中有Noggin的过表达，见图2，因此作者认为这个诱导方案是可行的。

2.3  真皮鞘中过表达Noggin发现毛囊皮下脂肪变薄  采用出生后8，9 d的注射方式对小鼠进行4-羟基他莫昔芬的诱导，然后分别取3个时间点小鼠：出生后21 d小鼠(小鼠毛囊处于静息期)、出生后23 d小鼠(小鼠毛囊处于生长期早期)、出生后28 d小鼠(小鼠毛囊处于生长期中期)，获取小鼠背部相同部分皮肤组织进行苏木精-伊红染色。结果发现，出生后21 d实验小鼠和对照小鼠的毛囊都处于静息期；出生后23 d小鼠毛囊进入生长期，此时实验鼠和对照鼠都处于生长早期；出生后28 d实验小鼠和对照小鼠都进入了毛囊生长中期；从苏木精-伊红染色结果可以看出Noggin过表达并没有对毛囊生长造成影响，并没有影响毛囊的起始和生长，见图3，也没有引起异位毛囊的生长。但是对照小鼠中毛囊皮下脂肪层明显比实验小鼠皮下脂肪层厚度更厚，可以看出实验小鼠毛囊皮下脂肪生长受到影响。测量实验小鼠和对照小鼠毛囊皮下脂肪层厚度，运用GraphPad Prism进行统计学分析，根据t 检验结果可以看出实验小鼠和对照小鼠脂肪层厚度差异有显著性意义，见图4。

2.4  过表达Noggin没有影响毛囊干细胞的激活和毛胚的增殖  作者猜想真皮鞘中大量Noggin蛋白可能会分泌到毛囊隆突干细胞处破坏毛囊干细胞的静息状态，促进其激活，从而加快毛囊发育过程。但该研究并没有发现毛囊表现出生长加快的表型，于是进一步检测了毛囊干细胞标记物K15，观察毛囊干细胞是否被特异性激活。结果发现在对照小鼠和实验小鼠K15染色没有明显差异，见图5A，不存在实验小鼠毛囊干细胞被特异性激活的情况，进一步说明在真皮鞘中过表达Noggin并没有影响毛囊干细胞的微环境。实验还检测了出生后23 d小鼠毛囊上皮细胞的增殖情况。结果发现实验小鼠毛囊上皮细胞增殖并没有上升，见图5B，因此在毛囊真皮鞘过表达Noggin并不影响毛囊干细胞的激活和毛囊上皮细胞的增殖分化。这些结果进一步确认了在真皮鞘中过表达Noggin不影响毛囊的正常生长。

2.5  BMP信号降低可能导致脂肪层变薄  研究表明毛囊皮下脂肪层厚度和毛囊周期是密切相关的^[20]，在毛囊生长期脂肪细胞迅速增殖分化，在毛囊退行期脂肪细胞开始减少，脂肪细胞是毛囊生长和毛囊干细胞的微环境，但同时毛囊可能也是脂肪细胞的微环境。脂肪前体细胞向脂肪细胞分化过程中BMP信号是必不可少的，在创伤过程中来自毛囊的BMP蛋白会促进成纤维细胞向脂肪细胞转化^[21]。对于该实验小鼠，作者猜测很可能是真皮鞘中的Noggin分泌到真皮层，抑制了真皮层BMP信号，导致了皮下脂肪细胞减少。实验检测了BMP信号通路的下游Smad 1/5/8分子的磷酸化状态(pSmad 1/5/8)，BMP激活则磷酸化加强，结果可以看出实验小鼠中pSmad 1/5/8信号显著下调，见图6。

Noggin基因是由科学家Smith在非洲瓜蟾中分离得到的^[1]。Noggin蛋白是BMP信号通路上的一个分子，可以和BMP2/4通过强亲和力形成复合物，从而使BMP2/4分子无法与细胞表面的受体相结合，阻断BMP信号通路，使BMP信号下游target基因无法表达^[2-4]。Noggin蛋白被认为是神经元再生的重要分子，有研究表明Noggin蛋白可以诱导神经元再生^{[ 5-7]}。在胚胎时期毛囊的形成过程中，Noggin蛋白在真皮毛乳头中表达并分泌到紧邻真皮毛乳头的毛囊上皮细胞，抑制BMP信号，从而激活毛囊上皮细胞增殖，诱导毛囊生长，Noggin缺失会导致毛囊数量的减少和毛囊周期的减慢^[8]。因此，在胚胎时期Noggin蛋白对于毛囊的形成必不可少。另外，在成熟毛囊上皮基质细胞中异位表达Noggin会导致毛干的形成受到严重阻碍^[9]。由此可见Noggin蛋白在毛发模式形成中也起到非常重要的作用。

毛囊结构可分为上皮和真皮两部分，毛囊上皮结构包括外根鞘、内根鞘和毛干，毛囊的真皮结构包括真皮毛乳头和结缔组织鞘即真皮鞘^[10]。真皮毛乳头位于毛囊的基部，真皮鞘是毛囊上皮与真皮间的一层连接鞘，通过茎部与真皮毛乳头的基部连接，同时也包裹着毛囊bulge隆突部(储存毛囊干细胞的重要结构)。真皮毛乳头和真皮鞘通过基底膜与毛囊的上皮部分分离。毛囊真皮鞘是一种毛囊间充质组织，能特异表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)^[11-12]。在毛囊生长周期中，真皮鞘被认为是真皮毛乳头细胞的细胞库^[13]，并且有研究表明真皮鞘和真皮毛乳头一样具有一定的毛发诱导能力^[14-16]。另外课题组在前期研究中发现毛囊真皮鞘中激活Wnt/β-catenin信号破坏了毛囊bulge微环境，并在原来毛囊旁边产生异位毛囊，导致小鼠真皮渐进性纤维化发生，尤其值得注意的是，激活Wnt/β-catenin信号的真皮鞘细胞中发现Noggin表达显著上升^[17]，结合前人对Noggin的研究结果，作者猜测真皮鞘细胞中Noggin的表达上升是否与异位毛囊再生有直接关系呢？因此，课题组在真皮鞘细胞特异表达的αSMA-CreERT2小鼠毛囊真皮鞘细胞中过表达Noggin蛋白，结果发现毛囊生长并没有受到影响，也没有引起异位毛囊的再生，但毛囊皮下脂肪组织生长发育受到严重影响，皮下脂肪层变薄，进一步研究发现毛囊中BMP信号减弱，推测可能是真皮鞘细胞中过表达的Noggin蛋白分泌到真皮层导致BMP信号下调，进而阻碍了脂肪细胞的发育和分化。这一发现拓展了人们对于真皮鞘细胞的认识，进一步了解Noggin在毛囊中的作用。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  探索性动物实验研究。

1.2  时间及地点  实验于2017年9月至2019年9月在上海交通大学Bio-X研究院马钢老师实验室完成。

1.3  材料  αSMA-CreERT2小鼠由Pierre Chambon教授惠赠，pMES-Noggin小鼠由福建师范大学张彦定教授提供，αSMAcre小鼠由军事医学科学院杨晓教授提供。用αSMA-CreERT2小鼠和pMES-Noggin小鼠交配得到实验组αSMA-CreER；pMES-Noggin小鼠和对照组αSMA-CreER小鼠，遵照实验动物规章制度将小鼠饲养于SPF级鼠房中。

1.4  实验方法

1.4.1  小鼠4-羟基他莫昔芬给药方法  用无水乙醇溶解4-羟基他莫昔芬粉剂，终质量浓度为20 g/L，37 ℃摇床约20 min，直至晶体全部溶解，加入9倍体积的玉米油，颠倒混匀，37 ℃摇床约10 min。出生后8，9 d按照120 μL进行小鼠腹腔注射给药。注射后用乙醇擦拭一下小鼠，防止母鼠受到4-羟基他莫昔芬气味影响。

1.4.2  苏木精-伊红染色  在给实验小鼠和对照小鼠注射4-羟基他莫昔芬后，于出生后21，23，28 d每个时间点每组取3只小鼠，在背部相同的部位获取皮肤组织，经40 g/L多聚甲醛在4 ℃摇床中浸泡过夜、梯度脱水、二甲苯透明、65 ℃烘箱包埋等处理，进行切片，取切片厚度为8-10 µm的组织进行苏木精-伊红染色，用普通光学显微镜拍照。

1.4.3  免疫组织化学染色  取诱导后14 d和19 d即出生后23 d和28 d的小鼠，在背部相同的部位获取皮肤组织进行石蜡组织包埋，将8-10 µm的石蜡组织脱蜡复水，使用   10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH值为6.0)在95 ℃水浴锅中热修复30 min，自然冷却至室温，快速用ddH₂O洗2遍，PBT洗2次，5 min/次，用封闭液(PBS+体积分数为10%胎牛血清+0.1% Triton-X 100)室温封闭30 min，将一抗用一抗稀释液(PBS+体积分数为10%胎牛血清)按照1∶50稀释之后，滴加到组织上，在湿盒中4 ℃孵育过夜，PBT洗6次，3 min/次，按照1∶500比例将二抗(Thermo Fisher公司)用二抗稀释液(PBS+体积分数为10%胎牛血清)稀释，滴加组织上孵育2 h，PBT清洗15 min，DAPI封固，最后用荧光显微镜拍照。免疫组化所用抗体：K15(Thermo Fisher Scientific，mouse 1∶50)、Noggin(R&D，1∶50)、PCNA(Santa Cruz，1∶50)、pSMAD1/5/8(Santa Cruz，1∶50)。

1.5  主要观察指标  毛发生长情况、毛囊皮下脂肪层厚度。

1.6  统计学分析  采用GraphPad Prism 7.0统计学软件对各组实验数据进行t 检验。

课题组前期研究提示在毛囊真皮鞘细胞中激活Wnt/β-catenin信号会诱导异位毛囊形成^[17]，意味着毛囊外根鞘细胞可能被来自真皮鞘组织中的信号分子所激活，同时发现突变鼠的真皮鞘细胞高表达Noggin蛋白，那么这个异位毛囊的形成是不是因为真皮鞘细胞中Noggin表达上升并分泌到毛囊上皮细胞中造成的呢？研究表明BMP信号对于维持毛囊上皮细胞的稳态非常重要，如果真皮鞘中表达的Noggin蛋白分泌出来到达毛囊上皮细胞处就有可能破坏毛囊上皮细胞的静息状态，促使其激活。于是作者提出这样的假设，真皮鞘细胞中高表达的Noggin分泌到毛囊上皮细胞中抑制了BMP信号对毛囊干细胞的静息态维持，促使毛囊干细胞被激活，从而导致异位毛囊的再生。但是该研究发现在真皮鞘中过表达Noggin并没有激活毛囊干细胞，也没有促进毛囊上皮细胞的的增殖，毛囊的生长毛发循环也没有受到影响。作者推测在真皮鞘细胞中过表达Noggin并不足以影响毛囊外根鞘上皮细胞和干细胞的微环境。另外，实验观察到突变小鼠的脂肪层变薄，提示脂肪细胞增殖分化受到影响，进一步研究发现真皮鞘中过表达Noggin使得真皮层间充质细胞的BMP信号被抑制，影响皮下脂肪细胞的增殖分化。

曾经有研究发现在毛发基质中过表达Noggin会发现毛干的丢失，次级毛囊发育异常^[9]。但是该研究在毛囊真皮鞘中过表达Noggin却发现毛发生长和循环基本正常，可能的原因是2个研究在不同位置过表达了Noggin，从而造成不同的表型，这也提示Noggin可能在毛囊不同部位的表达对毛囊生长的影响是不一样的。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

真皮鞘：毛囊真皮细胞包括2个部分，分别为真皮乳头和真皮鞘。真皮乳头位于毛囊的基部，真皮鞘是毛囊上皮与真皮间的一层连接鞘，通过茎部与真皮乳头的基部连接。在毛囊生长周期中，真皮鞘被认为是真皮乳头细胞的细胞库和毛囊干细胞的微环境。课题组在前期研究中发现毛囊真皮鞘中激活Wnt/β-catenin信号破坏了毛囊bulge微环境，并在原来毛囊上面产生异位毛囊，同时导致小鼠真皮渐进性纤维化发生，尤其值得注意的是，激活Wnt/β-catenin信号的真皮鞘细胞中发现Noggin表达显著上升。

Noggin：Noggin蛋白是一个抑制BMP信号通路的重要分子，可以与BMP2/4结合形成复合物，从而阻断BMP信号，影响生物有机体的正常发育过程。在早期研究中，Noggin蛋白在毛囊中的作用一直被认为是间充质细胞表达的毛囊诱导分子，但是研究并没有分析究竟是在真皮层起作用还是表皮层起作用。另外有研究证明在表皮中过表达Noggin也会诱导毛发增多，但是还没有小鼠模型研究真皮层Noggin的功能。该研究初步探索毛囊真皮鞘中Noggin的功能与作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

真皮鞘在皮肤学领域研究方兴未艾。研究证明在啮齿类动物模型中真皮乳头细胞能诱导新生毛发，但是真皮乳头细胞在人的异体移植过程中却不能诱导新生毛发，而真皮鞘细胞在人的异体移植过程中，在不引起免疫排斥的情况下能诱导新生毛发，另外真皮鞘细胞取材方便，不引起人体较大的疼痛并且不涉及到伦理问题，这些因素突显出了 真皮鞘在组织工程和临床应用中的巨大潜能。在未来的发展趋势中真皮鞘的研究也会越来越多，因为真皮鞘细胞不仅具有很强的诱导能力，而且还具有高度可塑性。在体外培养真皮鞘细胞会发现有一小部分真皮鞘细胞会自发地分化成为脂肪细胞和骨细胞。该实验立足于真皮鞘细胞的强诱导能力，探索了真皮鞘细胞过表达Noggin是否会影响毛囊的生长。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程