间充质干细胞归巢到大鼠肺气肿组织分化为肺血管内皮细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.02

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (29): 4728-4733.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.02

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间充质干细胞归巢到大鼠肺气肿组织分化为肺血管内皮细胞

赵晓建¹，卢彩平²，褚伟伟¹，张亚肖¹，张冰¹，甄强¹，王仁锋¹，刘家宝¹

河北省石家庄市第一医院，¹胸外科，²内分泌一科，河北省石家庄市 050000

修回日期:2017-05-06 出版日期:2017-10-18 发布日期:2017-11-08
通讯作者: 卢彩平，主治医师，河北省石家庄市第一医院内分泌一科，河北省石家庄市 050000
作者简介:赵晓建，男，1981年生，汉族，硕士，主治医师，主要从事胸外科疾病胸腔镜微创手术研究。
基金资助:
石家庄市科技支撑计划项目(121461793)

Mesenchymal stem cells homing to rat lung emphysema followed by differentiation into pulmonary vascular endothelial cells

Zhao Xiao-jian¹, Lu Cai-ping², Chu Wei-wei¹, Zhang Ya-xiao¹, Zhang Bing¹, Zhen Qiang¹, Wang Ren-feng¹, Liu Jia-bao¹

¹Department of Thoracic Surgery,²First Department of Endocrinology, First Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China

Revised:2017-05-06 Online:2017-10-18 Published:2017-11-08
Contact: Lu Cai-ping, Attending physician, First Department of Endocrinology, First Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China
About author:Zhao Xiao-jian, Master, Attending physician, Department of Thoracic Surgery, First Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China
Supported by:
the Science and Technology Supporting Plan of Shijiazhuang City, No.121461793

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
间充质干细胞移植治疗肺气肿的机制：已证明间充质干细胞能修复肺气肿病变组织，一旦间充质干细胞在肺组织毛细血管停留，在局部微环境诱导和周围组织细胞相互作用下，可逐步迁移到肺间质、肺泡壁、肺毛细血管壁和小气道并分化成相应的细胞来发挥作用。另外间充质干细胞还具有强大的免疫抑制和调节功能，移植入体内的间充质干细胞有可能是通过抑制体内T淋巴细胞的活化，或者是通过与肺组织局部细胞相互作用，抑制和减轻肺组织局部的炎症反应，同时为损伤肺组织的修复提供有利环境。

摘要
背景：间充质干细胞具有独特的归巢、免疫调节及抗炎作用，经静脉注射移植后能归巢到损害的靶器官及组织发挥其功能，修复受损组织。
目的：观察间充质干细胞移植后，肺气肿大鼠的肺组织病理改变。
方法：将24只雌性Wistar大鼠随机分为实验组、对照组、健康对照组，前两组应用烟熏加气管内滴入猪胰弹性蛋白酶的方法制作肺气肿模型，造模成功后，实验组尾静脉注射BrdU标记骨髓间充质干细胞，对照组注射PBS。14 d后，检测观察大鼠肺组织病理学变化，检测肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子α水平，肺泡壁细胞凋亡指数、抗CD34及抗BrdU免疫组织化学变化。
结果与结论：①与健康对照组比较，对照组肿瘤坏死因子α水平、肺泡壁细胞凋亡指数升高(P < 0.01)，抗Brdu及抗CD34相对面积减少(P < 0.01)；与对照组比较，实验组肿瘤坏死因子α水平、肺泡壁细胞凋亡指数降低(P < 0.01)，抗Brdu及抗CD34相对面积增加(P < 0.01)；②肺组织病理学检查显示，对照组及实验组均呈现肺气肿样改变，但实验组轻于对照组；③结果表明，间充质干细胞能抑制实验性肺气肿的炎症反应及细胞凋亡，改善肺气肿病理学变化且骨髓间充质干细胞可分化为肺血管内皮细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5137-8677(卢彩平)

关键词: 干细胞, 移植, 骨髓间充质干细胞, 肺气肿, 烟熏, 弹性蛋白酶, 模型, 炎症反应, 细胞凋亡, 免疫组化, 细胞示踪, 分化

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells have unique homing, immunoregulation and anti-inflammatory properties. After intravenous injection, mesenchymal stem cells can home to the damaged target organs and tissues, and function to repair damaged tissues.
OBJECTIVE: To observe the pathological changes of lung tissues in rats with emphysema after mesenchymal stem cells transplantation.
METHODS: Twenty-four female Wistar rats were randomly divided into experimental group, control group and healthy control group. In the first two groups, the model of pulmonary emphysema was established by the method of dropping porcine pancreatic elastase. BrdU-labeled mesenchymal stem cells were injected into the tail vein of the rats in the experimental group, and PBS was injected in the control group. After 14 days, the pathological changes of lung tissues were observed. Tumor necrosis factor-α level, alveolar wall apoptotic index, anti-CD34 and anti-BrdU immunohistochemical changes in the bronchoalveolar lavage fluid were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the healthy control group, the tumor necrosis factor-α level and apoptotic index of alveolar wall cells increased (P < 0.01), and the relative areas of anti-Brdu and anti-CD34 decreased (P < 0.01) in the control group. Compared with the control group, the level of tumor necrosis factor-α and apoptotic index of alveolar wall cells decreased (P < 0.01), and the relative area of anti-Brdu and anti-CD34 increased (P < 0.01) in the experimental group. The histopathological findings showed that both the control group and the experimental group showed emphysema-like changes, but these changes were milder in the experimental group than the control group. To conclude, mesenchymal stem cells can inhibit inflammatory response and apoptosis in experimental emphysema, improve the pathological changes of the lung, and moreover, bone marrow mesenchymal stem cells can differentiate into lung vascular endothelial cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Cell transplantation, Stem Cells, Mesenchymal stem cells, Pulmonary Emphysema, Bone marrow, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

赵晓建，卢彩平，褚伟伟，张亚肖，张冰，甄强，王仁锋，刘家宝. 间充质干细胞归巢到大鼠肺气肿组织分化为肺血管内皮细胞[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(29): 4728-4733.

Zhao Xiao-jian, Lu Cai-ping, Chu Wei-wei, Zhang Ya-xiao, Zhang Bing, Zhen Qiang, Wang Ren-feng, Liu Jia-bao. Mesenchymal stem cells homing to rat lung emphysema followed by differentiation into pulmonary vascular endothelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(29): 4728-4733.

图/表（结果） 1

2.1 培养的骨髓间充质干细胞形态及鉴定 细胞悬液中的间充质干细胞悬浮状态，呈圆形，24 h开始贴壁，72 h贴壁的细胞呈梭形、三角形、多角形，胞体饱满，可见2-4个突起，长短不一，胞浆半透明，胞核圆，核仁明显。培养7 d胞体增大，逐渐以梭形为主，细胞间连接更为紧密。传代细胞生长速度加快，更密集，汇流处细胞形态均一，多长梭形，呈旋涡状或平行排列生长，光性强。培养10-14 d细胞80%融合，见图1A，流式细胞仪检测细胞表面CD44表达率为85.32%，CD90表达率为91.45%，CD71表达率为69.34%，见图1B，C，CD45表达率为2.05%^[10]。Brdu标记的骨髓间充质干细胞，见图1D。

2.2 肺气肿模型造模情况 实验组与对照组大鼠均造模成功。

2.3 各组大鼠肺泡灌洗液细胞总数和细胞分类计数 与健康对照组比较，对照组大鼠肺泡灌洗液中细胞总数、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞百分比明显升高(P < 0.01)；与对照组相比较，实验组大鼠肺泡灌洗液中细胞总数明显降低(P < 0.01)，细胞分类计数无明显差异，见表1。

2.4 各组大鼠肺泡灌洗中肿瘤坏死因子α水平检测 与健康对照组比较，对照组大鼠肺泡灌洗中肿瘤坏死因子升高(P < 0.01)，表明肺气肿大鼠肺内炎症反应明显；与对照组比较，实验组肿瘤坏死因子水平降低(P < 0.01)，表明间充质干细胞明显降低肺内炎症反应，见表2。

2.5 各组大鼠肺组织形态学观察及测定结果 各组肺组织病理变化显示，对照组及实验组肺组织均呈现肺气肿样改变，但实验组较对照组为轻，见图2。

对照组和实验组肺组织平均内衬间隔及平均肺泡面积明显高于健康对照组(P < 0.01)，平均肺泡数明显低于健康对照组(P < 0.01)；对照组肺组织平均内衬间隔及平均肺泡面积明显高于实验组(P < 0.01)，平均肺泡数明显低于实验组(P < 0.01)，见表3。

2.6 各组大鼠肺组织肺泡壁凋亡细胞检测结果 TUNEL结果显示凋亡细胞的核染色质浓集、呈深棕褐色。对照组、实验组肺泡壁细胞凋亡数量增多，凋亡指数值显著高于健康对照组(P < 0.01)，实验组肺泡壁细胞凋亡数量及凋亡指数值显著低于对照组(P < 0.01)，见表2。

2.7 各组大鼠肺组织免疫组织化学检测结果 见图3。

健康对照组、对照组、实验组抗Brdu及抗CD34相对面积分别为(5.63±2.01)%、(0.86±0.49)%、(2.64±1.43)%，3组间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.01)。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年1至11月在河北省石家庄市第一医院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：8周龄Wistar雌性大鼠24只，体质量(180± 20) g，由河北医科大学实验动物中心提供，随机分为健康对照组、对照组、实验组，每组8只；6周龄雄性Wistar大鼠1只，体质量约150 g，由河北医科大学实验动物中心提供。

主要试剂与仪器：猪胰弹性蛋白酶(常州千红生化制药厂生产)；Percoll分离液(Pharmacia)；L-DMEM培养液(Hyclone)；胎牛血清(Gibco)；5-溴脱氧尿尿嘧啶核苷(博士德公司)；CD44抗体、CD45抗体、CD71、CD90、脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)凋亡细胞检测试剂盒(Santa Cruz)。

1.4 实验方法

1.4.1 制作大鼠肺气肿模型^[9] 将实验组、对照组大鼠放入实验性被动吸烟装置，每次10支香烟，熏40 min，1次/d，每周烟熏6 d，5周以后所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg麻醉，固定于自制实验台，大鼠头部后仰70°，用强光灯照射颈部，钳子轻轻夹大鼠舌头拉伸，可显露大鼠气管开口，用静脉留置针的塑料套管插入气管约1 cm，缓慢注射猪胰弹性蛋白酶，每100 g体质量给予50 U并加9 g/L氯化钠至0.5 mL，随后注入少量空气，以确保药液全部进入肺内，然后不断摇动并改变其体位，尽可能使药液在肺内分布均匀，待其清醒后放回笼中，继续饲养，继续烟熏3个月，模型成功。健康对照组大鼠气管内注入同体积9 g/L氯化钠，不烟熏，饲养3个月。

1.4.2 间充质干细胞的分离、纯化及扩增 取6周龄Wistar雄鼠1只，腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg麻醉后，断颈处死，取出其双侧股骨及胫骨，注意无菌操作，避免污染，取5 mL L-DMEM培养液(含1×10⁴ U肝素)冲洗骨髓腔，吸管充分吹打后制成单细胞悬液，离心机1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，PBS重新悬浮细胞，加至60% Percoll的工作液面之上，离心机1 500 r/min离心30 min，吸出白细胞层，PBS溶液稀释后，离心机1 500 r/min离心10 min，L-DMEM培养液重新悬浮细胞，分瓶后在温度为37 ℃、体积分数5%的CO₂恒温培养箱内培养，48 h换液，弃去未贴壁细胞，倒置显微镜观察，每3 d换培养液，细胞融合80%-90%时，开始1∶2传代，继续培养，第3代细胞应用流式细胞仪检测其表面蛋白CD44、CD45、CD90、CD71及细胞周期。

1.4.3 BrdU标记间充质干细胞 细胞传至第3代后，待贴壁 6 h，加入终浓度为10 μmol/L的BrdU。在37 ℃、体积分数5%CO₂孵育箱内继续培养，每3 d换液1次，等细胞融合80%时，标记完成。

1.4.4 间充质干细胞移植 取BrdU 标记的间充质干细胞进行细胞移植，细胞浓度为2×10⁹ L^-¹。造模成功后，实验组尾静脉注射间充质干细胞悬液200 μL(细胞总数为2×10⁶)；对照组及健康对照组尾静脉注射PBS 200 μL。细胞移植后第14天断颈处死大鼠。实验获得动物伦理委员会批准，均严格按照政府及国际准则的标准执行。

1.5 主要观察指标

1.5.1 肺泡灌洗液的收集、检测及肺组织处理 断颈处死大鼠，打开胸腔，迅速取出心肺，剔除心脏。3 mL PBS经气管注入肺内，压力维持在1.96 kPa，反复灌洗3次，回收灌洗液。回收率大于80%为合格标本，灌洗液200目筛网过滤后，收集离心管内，血细胞计数板计数细胞总数，最后将灌洗液2 000 r/min离心5 min后，分装上清液。抗体夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子α质量浓度(按照试剂盒说明进行ELISA检测，根据标准曲线计算浓度)。余上清液保存于-70 ℃冰箱。大鼠气管结扎后，经气管注入体积分数4%甲醛溶液至肺复张状态，压力维持在1.96 kPa，体积分数4%甲醛溶液中固定24h，常规石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色。

1.5.2 肺组织病理组织学检测 每只大鼠随机抽取5张肺组织切片，每张切片随机取10个视野(×100)，避开支气管及大、中血管。显微镜下图文分析系统计数及计算肺组织平均内衬间隔、单位面积平均肺泡数及平均肺泡面积。

每个视野中心划“十”字，测量“十”字线总长度(L)，计数经此“十”字线的肺泡间隔数(N)。平均内衬间隔=L/N，其反映视野内平均肺泡的直径。

每个视野计数肺泡总数(N)，测出该视野面积(M)，单位面积平均肺泡数=N/M，其反映视野内单位面积内肺泡数目。

每个视野内计数总肺泡数(N)，测出该视野面积(M)，再测出苏木精-伊红染色阳性区域(肺实质)面积(P)，平均肺泡面积=(M-P)/N，其反映视野内平均肺泡面积大小。

1.5.3 肺组织细胞凋亡检测 TUNEL法检测，切片常规脱蜡，蛋白酶K(20 mg/L)消化，PBS清洗，加50 μL TUNEL反应混合液，湿盒37 ℃孵育1 h，再次PBS清洗，加50 μL转化剂POD，DAB显色，显微镜观测。不加TdT作阴性对照，棕黄色细胞核为阳性细胞。

每只大鼠随机抽5张切片检测，每张切片随机观测10个视野(×400)，避开大、中血管及支气管，计数阳性细胞数及总细胞数。

凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.5.4 抗BrdU及抗CD34免疫组织化学测定

切片防脱：①切片于烤箱内60 ℃烤40 min，使切片紧密黏附；②常规脱蜡至水；③体积分数30%H₂O₂ 1份+蒸馏水10份均匀混合，室温8 min灭活内源性酶，蒸馏水洗3次，每次3 min；④热抗原修复：切片浸入pH值为6的0.01 mol/L枸橼酸钠溶液中，微波炉加热至沸腾3 min后停止加热，10 min后再煮沸1次，反复3次，室温冷却后PBS洗2次；⑤封闭：5% BSA 的封闭液，放入湿盒室温20 min，用力甩去封闭液，不洗；⑥分别加一抗(Mouse-Auti-Brdu 1∶100)及(Mouse-Auti-CD34 1∶100)，使一抗溶液完全覆盖组织片，放置湿盒中4 ℃冰箱过夜，以孵育抗体，PBS洗3次，每次2 min；⑦生物素标记: 加入山羊抗大鼠IgG孵育30 min，PBS洗3次，每次2 min；⑧滴加试剂SABC(链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物)室温孵育20 min，PBS洗4次，每次5 min；⑨DBA显色：1 mL蒸馏水加入试剂盒A，B，C试剂各1滴混匀，加至切片。室温下显色，显微镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤；⑩苏木精轻度复染：常规脱水，透明，PBS洗3次，每次2 min，滴甘油，盖玻片封固。

显微镜观察：棕黄色扁平细胞为BrdU标记细胞及CD34阳性细胞。显微镜采集图像(×250)，计算机图文分析系统测量。每只大鼠随机抽5张切片观测，避开支气管及大、中血管，每张切片随机取10个视野，测量每个视野总面积及细胞染色阳性区域面积，平均阳性面积=细胞染色阳性区域面积/视野总面积。

1.6 统计学分析 所有数据以x(_)±s表示，采用SPSS 19.0统计软件处理，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验，显著性检验水准P < 0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

肺气肿作为一种常见的慢性进展性疾病，是炎症反应、细胞凋亡、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、氧化-抗氧化失衡、细胞外基质损伤与修复综合作用的结果，病程一旦启动是不可逆转的^[11]。肺气肿作为一种中老年人常见的慢性阻塞性肺疾病，目前尚无行之有效的治疗方法^[12]，内科治疗以预防呼吸道感染、改善患者呼吸功能、控制并发症为主。虽然起到一定的疗效，但仍不阻止病情的加重进展，对于终末期肺气肿的治疗无明显效果^[13-14]。由于慢阻肺的发病机制复杂，病理改变可引起小气道结构重塑、肺泡结构破坏及肺毛细血管床减少，且肺组织无再生能力，无法达到完全修复，导致病情进行性加重^[15]。通过几十年发展，肺减容手术已成为肺气肿外科治疗的主要方法，然而患者体质差，风险高，手术并发症多，大约也只有20%肺气肿患者能够得到有效治疗^[16]，而且这种方法并未去除肺气肿的病因，肺气肿病变还在继续进展，随着时间的推移，患者肺功能又会下降，因此目前急需要找到一种有效治疗肺气肿的方法^[17]。如果能找到某方法能够修复受损的肺部组织结构，逆转肺气肿病变进展，恢复正常肺泡形态，重建肺功能，将具有极其重要的意义。

肺气肿病变是由多种有害因素造成的肺组织及肺毛细血管损伤，机体自身无法完全修复，病程启动后，即使去除掉原发致病因素，炎症反应、酶学失衡还将继续进展，导致肺泡上皮细胞持续凋亡、肺泡壁结构持续破、肺泡融合、肺毛细血管床持续减少和终末支气管及肺细胞外基质蛋白质成分的分解，损伤持续性加重，机体无法自行修复^[13^，^18]。如果移植外源性细胞能够帮助或参与机体肺组织结构的修复，并且减轻炎症反应，恢复到原有正常肺肺组织结构及功能，且机体不会出现排斥反应，将会是一种最为有效的方法。骨髓间充质干细胞具有自我复制更新和多向分化成为多种组织细胞的潜能^[19-20]。不同诱导条件下，间充质干细胞可改变分化方向，分化形成3个胚层来源的细胞^[21-22]。在一定条件下可分化成为血管内皮细胞、心肌细胞、支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞等多个胚层来源的细胞^[23]。间充质干细胞在适宜的微环境里还可分化为成年人身体中几乎每一个主要的细胞类型^[24]。这种多胚层的分化能力，使得间充质干细胞为器官及组织修复提供了广阔前景，而且其在退行性疾病及组织器官损伤等研究方面的潜力令人期待^[25]。间充质干细胞还具有独特的“归巢”、免疫调节及抗炎作用，经静脉注射移植后，能归巢到“损害”的靶器官及组织发挥其功能，能抑制和减轻症反应，能参与免疫调节，修复受损组织^[26]，外源性间充质干细胞参与肺组织损伤修复的作用机制，到目前为止并没有完全明确^[22^，^27-28]，但作者的前期实验已证明其能修复肺气肿病变组织。一旦间充质干细胞在肺组织毛细血管停留，在局部微环境诱导和周围组织细胞相互作用下，可逐步迁移到肺间质、肺泡壁、肺毛细血管壁和小气道并分化成相应的细胞来发挥作用^[27^，^29]。另外间充质干细胞还具有强大的免疫抑制和调节功能^[30]，移植入体内的间充质干细胞有可能是通过抑制体内T淋巴细胞的活化，或者是通过与肺组织局部细胞相互作用，抑制和减轻肺组织局部的炎症反应，同时为损伤的肺组织的修复提供了有利的环境，这可能就是其改善肺气肿病变的机制^[31]。

实验观察到Brdu标记的骨髓间充质干细胞移植后，肺泡壁细胞凋亡受到抑制，炎症反应减轻，且Brdu标记的骨髓间充质干细胞分化成了抗CD34阳性细胞，说明其进入机体后产生了一系列的作用，参与了肺泡壁细胞的修复和再生，最终减轻了肺气肿的病理改变，延缓了肺气肿的病理进程，为细胞移植治疗肺气肿提供了大量理论基础，为肺气肿治疗找到了一种新的方法，有必要在细胞移植方面及基因改造方面继续研究，下一步继续研究的重点在于不同间充质干细胞移植数量的作用及其在肺组织内的分布及具体分化情况、抗炎作用机制、免疫调节机制，为间充质干细胞治疗肺气肿的应用提供理更充分的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

间充质干细胞归巢到大鼠肺气肿组织分化为肺血管内皮细胞

Mesenchymal stem cells homing to rat lung emphysema followed by differentiation into pulmonary vascular endothelial cells

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