吡格列酮联合内皮祖细胞移植改善糖尿病肾功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.013

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
内皮祖细胞：内皮祖细胞在血管内皮损伤后自身修复过程中发挥重要作用。目前公认内皮祖细胞表面标记有3种：CD133、CD34和VEGFR-2(KDR)，其中CD133⁺、CD34⁺、KDR⁺的内皮祖细胞主要存在于骨髓中，位于外周血中内皮祖细胞表达CD133减少，但继续表达CD34，并开始表达KDR。
吡格列酮：可以增强机体对胰岛素的敏感性，也是一种γ型过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂，能够特异性激活内皮祖细胞表面相应受体并发挥生物效应。近几年来，越来越多的学者注意到其在糖尿病治疗方面的重要意义。

摘要
背景：研究表明，吡格列酮可促进内皮祖细胞增殖活化，抑制内皮祖细胞凋亡。作者推测，吡格列酮干预和内皮祖细胞移植联合治疗可能会更有效地缓解高血糖症状，修复糖尿病肾脏损伤。
目的：观察吡格列酮联合内皮祖细胞移植对糖尿病大鼠肾功能的改善作用。
方法：①体外复苏人内皮祖细胞并进行CM-Dil标记，移植前备用；②从75只Wistar大鼠中随机选15只不做任何处理作为正常对照组，余60只连续5 d腹腔注射40 mg/kg 链脲佐菌素柠檬酸钠溶液建立1型糖尿病大鼠模型，造模4周后随机分为糖尿病组、吡格列酮组、内皮祖细胞移植组和联合治疗组，经尾静脉注射内皮祖细胞悬液和/或20 mg/kg吡格列酮灌胃，连续治疗4 d；③治疗8周后测定各组大鼠血糖、血清胰岛素、血肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白水平，荧光显微镜观测CM-Dil标记的内皮祖细胞存活及分布情况，TUNEL法检测肾细胞凋亡情况，并计算肾质量/体质量比值。
结果与结论：①与糖尿病组比较，内皮祖细胞组、吡格列酮组大鼠血糖、血肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白水平明显降低，血清胰岛素明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，联合治疗组大鼠血糖、血肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白水平降低更明显(P < 0.01)，血清胰岛素升高更明显(P < 0.01)；②内皮祖细胞组、吡格列酮组大鼠肾质量/体质量比值低于糖尿病组(P < 0.05)，联合治疗组低于内皮祖细胞组、吡格列酮组(P < 0.05)；③联合治疗组大鼠CM-Dil标记阳性细胞明显多于内皮祖细胞移植组；④正常对照组细胞凋亡数最少，糖尿病模型组细胞凋亡数最多，与糖尿病模型组比较，内皮祖细胞移植组和吡格列酮组凋亡细胞数明显减少，联合组进一步减少；⑤结果表明，吡格列酮联合内皮祖细胞移植能够有效降低大鼠血糖、肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白水平，升高血清胰岛素水平，减少肾组织细胞凋亡，在一定程度上改善糖尿病大鼠肾功能紊乱。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0003-3698-266X(王松)

关键词: 干细胞, 移植, 内皮祖细胞, 吡格列酮, 细胞移植, 大鼠, 糖尿病, 肾功能

Abstract:

BACKGROUND: Pioglitazone is a common hypoglycemic drug capable of improving proliferation and activation, and inhibiting apoptosis of endothelial progenitor cells (EPCs). We speculated that the combined use of pioglitazone and EPCs transplantation could have significant improving effects on hyperglycemia and kidney function after diabetes mellitus.
OBJECTIVE: To investigate the improving effect of EPCs transplantation combined with pioglitazone treatment on the kidney function of diabetic rat models.
METHODS: The 15 of 75 Wistar rats were randomly selected and served as normal control group (no treatment). Animal models of type 1 diabetes mellitus were made in the rest 60 rats through the intraperitoneal injection of 40 mg/kg streptozotocin for continuous 5 days. The human EPCs (labeled by CM-Dil) were recovered, cultured and preserved until transplantation. After 4 weeks of modeling, the 60 rat models were randomly divided into model group (PBS injection), pioglitazone group, EPCs transplantation group and combined treatment group, followed by tail vein injection of EPCs suspension and/or intragastric administration of 20 mg/kg pioglitazone for continuous 4 days. After 8 weeks of treatment, the levels of glucose, insulin and creatinine in serum, urea nitrogen and urine protein during 24 hours were determined. The number and distribution of EPCs labeled by CM-Dil were detected by fluorescence microscope, the apoptosis in kidney cells was tested by TUNEL method, and the kidney weight/body weight ratio in rats was calculated.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, the blood glucose and serum creatinine levels and the urea nitrogen and urine protein concentrations during 24 hours were significantly decreased (P < 0.05), and the serum insulin level was significantly increased (P < 0.05) in the pioglitazone and EPCs transplantation groups. These biochemical indexes in the combined treatment group were more significantly altered compared with the model group (P < 0.01). The kidney weight to the body weight ratio was lowest in the combined treatment group and lower in the pioglitazone and EPCs transplantation groups followed by the model group (P < 0.05). The order of apoptotic kidney cells labeled by TUNEL was as follows: model group > pioglitazone group > EPCs transplantation group > combined treatment group (P < 0.05). To conclude, the EPCs transplantation combined with pioglitazone treatment can decrease the blood glucose and serum creatinine levels and urea nitrogen and urine protein concentrations, improve the serum insulin level, reduce cell apoptosis in the kidney, and remit the kidney dysfunction of diabetic rats to a certain extent.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Endothelial Cells, Thiazolidinediones, Cell Transplantation, Diabetic Nephropathies, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王松，郑喜胜，王杉，房芳. 吡格列酮联合内皮祖细胞移植改善糖尿病肾功能[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(17): 2702-2707.

Wang Song, Zheng Xi-sheng, Wang Shan, Fang Fang. Co-treatment of endothelial progenitor cells and pioglitazone improves kidney function in diabetic rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(17): 2702-2707.

图/表（结果） 1

2.1 内皮祖细胞形态 接种后4-6 d，部分细胞开始贴壁增殖，随着时间延长贴壁细胞明显增多并且体积变大，细胞呈现类圆形、纺锤形或多边形，见图1A；7-14 d时，贴壁细胞开始膨胀，呈现为大圆形，部分贴壁细胞生长呈“铺路石”样外观，见图1B。当细胞满铺80%时进行传代。细胞复苏后存活率大约85%。复苏传代后的细胞形态与未冻存的细胞无明显差异。

2.2 各组大鼠血糖、胰岛素、血肌酐、尿素氮?24 h尿蛋白水平 如表1所示，与正常对照组相比，糖尿病组血糖、尿素氮、血肌酐、24 h尿蛋白含量均显著升高，而胰岛素含量则显著降低。与糖尿病模型组比较，内皮祖细胞组、吡格列酮组大鼠血糖、尿素氮、血肌酐、24 h尿蛋白水平明显降低，血清胰岛素含量明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；联合治疗组大鼠血糖、尿素氮、血肌酐、24 h尿蛋白水平降低更明显(P < 0.01)，血清胰岛素浓度升高更明显(P < 0.01)；尽管联合治疗组大鼠的生化指标仍未得到完全恢复，并与正常对照组相比差异仍有显著性意义，但可见恢复趋势。

2.3 大鼠体质量?肾质量变化 与其他各组相比，正常对照组肾质量/体质量比值最低(P < 0.05)。与糖尿病模型组大鼠相比，内皮祖细胞组、吡格列酮组、联合治疗组显著降低(P < 0.05)；联合治疗组肾质量/体质量比值明显低于内皮祖细胞组和吡格列酮组(P < 0.05)，见表2。

2.4 CM-Dil标记的内皮祖细胞存活及分布情况 治疗8周后，正常对照组、糖尿病模型组和吡格列酮组未见有CM-Dil标记阳性细胞。内皮祖细胞移植组和联合治疗组大鼠肾组织中可见明显的CM-Dil标记的内皮祖细胞；联合治疗组大鼠CM-Dil标记阳性细胞明显多于内皮祖细胞移植组，见图2。

2.5 各组肾组织细胞凋亡情况 如表3、图3所示，正常对照组细胞凋亡数最少，糖尿病模型组细胞凋亡数最多，与糖尿病模型组比较，内皮祖细胞移植组和吡格列酮组凋亡细胞数明显减少(P < 0.05)，联合治疗组进一步减少(P < 0.01)。

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引言

目前，全世界糖尿病患者已经突破3.8亿人次，中国患者有近1.3亿，糖尿病已经成为威胁人类健康的洪水猛兽^[1-3]。糖尿病主要是由胰岛素分泌不足或作用障碍引发，其临床表现为血糖升高，并伴随体质量减轻^[4-6]。1型糖尿病是因胰岛素β细胞自身免疫性损伤诱发的高血糖疾病，其常常会引发诸多并发症状。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最主要的微血管并发症之一，随着糖尿病发病人数的逐年攀升，糖尿病肾病已经成为了引起终末期肾病的首要原因^[7-10]。现阶段，降血糖药物并不足以缓解肾脏损伤，故而寻求更为有效的手段尤显重要^[11-13]。

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)是与血管新生有关的骨髓干细胞亚群，国内外诸多研究已经表明，内皮祖细胞在重建血供、促进缺血性组织血管新生、向心肌细胞和内皮细胞等细胞分化、缓解内皮功能障碍等方面有卓越表现^[14-16]。在1型糖尿病进程中，内皮祖细胞发挥着重要作用，其可趋化迁移至组织损伤或缺血部位，定向分化为血管内皮细胞的前体细胞，参与血管新生和自身修复^[17-20]。然而，在1型糖尿病发展过程中，内皮祖细胞的增殖和黏附分化能力均显著降低，其与高血糖和胰岛素毒性、一氧化氮合成障碍以及高血糖引起的氧化应激有关^[21-24]。吡格列酮是用于治疗糖尿病的胰岛素增敏剂。尽管目前吡格列酮用于治疗2型糖尿病的研究较多，但庞烨峰等^[25]研究表明其对1型糖尿病大鼠也有较为理想的治疗效果。此外，研究表明，吡格列酮可促进内皮祖细胞增殖活化，抑制内皮祖细胞的凋亡^[26-27]。故而作者推测，吡格列酮干预和内皮祖细胞移植联合治疗可能会更有效地缓解高血糖症状，修复糖尿病肾脏损伤。实验旨在探讨吡格列酮联合内皮祖细胞移植治疗对1型糖尿病大鼠肾脏功能的影响，以期为临床治疗糖尿病肾病提供借鉴和支持。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年7月至2015年12月在郑州大学实验动物中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康Wistar大鼠(2.5月龄左右，雄性) 75只，体质量300-350 g，由郑州大学实验动物中心提供，实验动物室内温度25 ℃，湿度50%-80%，SPF环境下自由饮水和采食。

1.3.2 主要细胞、试剂和仪器 原代内皮祖细胞(中国医学科学院)；胰蛋白酶(美国Sigma公司)；EBM-2培养基?胎牛血清和PBS(Hyclone公司)；细胞培养箱(Heraeus Sepatech公司)；Trizol试剂盒(Invitrogen公司)；超净工作台(艺斯高上海贸易有限公司)；台式离心机(德国SIGMA有限公司)；ht2型Biocell酶标仪(郑州博赛生物公司)；-70 ℃冰箱(日本SANYO公司)。

1.4 方法

1.4.1 建立1型糖尿病大鼠模型及实验分组 取75只健康Wistar大鼠随机分为正常对照组?糖尿病模型组、吡格列酮组、内皮祖细胞移植组、联合治疗组，每组15只。除正常对照组外，余60只Wistar大鼠连续5 d腹腔注射40 mg/kg链脲佐菌素柠檬酸钠溶液建立1型糖尿病大鼠模型。每周测定血糖，如大鼠出现多饮、多食、多尿等症状且血糖浓度>16.7 mmol/L则判定为造模成功。

1.4.2 体外复苏并培养人内皮祖细胞 将原代内皮祖细胞置于60 ℃恒温水浴箱，30 s内进行快速复苏，融化之后迅速转入EP管并加入EBM-2培养基，小心吹打细胞使其均匀分布，随后离心弃上清液，用EBM-2完全培养基调整为1×10⁹ L^-¹的细胞浓度，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱培养，待内皮祖细胞汇合度达80%以上时，胰蛋白酶溶液消化两三分钟，终止消化，离心弃上清，重悬细胞，调整细胞浓度至1×10⁹ L^-¹，培养7 d，再次离心去上清，将内皮祖细胞浓度调整为8×10⁸ L^-¹，随后向细胞悬液中加入5 μL CM-DiL进行标记，置于培养箱中孵育25-30 min，离心弃上清，PBS重悬，重复标记2次，显微镜下观察细胞标记情况。

1.4.3 治疗方法 在建立1型糖尿病模型4周之后，对60只模型大鼠进行内皮祖细胞移植和吡格列酮干预治疗。内皮祖细胞移植组大鼠经尾静脉注射100 μL CM-Dil标记好的内皮祖细胞悬液，使用灌胃针注射20 mg/kg PBS；吡格列酮组大鼠经尾静脉注射100 μL PBS，使用灌胃针注射20 mg/kg吡格列酮；联合治疗组大鼠经尾静脉注射100 μL CM-Dil标记好的内皮祖细胞悬液，使用灌胃针注射20 mg/kg吡格列酮；正常对照组大鼠经尾静脉注射100 μL PBS，使用灌胃针注射20 mg/kg PBS，各组连续给予吡格列酮或PBS治疗4 d之后，经尾静脉注射1次内皮祖细胞悬液或PBS。

1.4.4 各组大鼠血糖、血清胰岛素、血肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白水平 治疗8周后采集大鼠尾静脉血液，全自动生化分析仪检测大鼠血糖、胰岛素、血肌酐、尿素氮水平。采血当天，留取晨尿以及24 h尿液，全自动生化分析仪检测24 h尿蛋白含量。

1.4.5 大鼠体质量和肾质量测定 治疗8周后，将所有实验动物处死，取右侧肾脏，吸干肾脏表面的水和血液，称取肾脏鲜质量，并计算出肾质量/体质量比值。

1.4.6 荧光显微镜观测CM-Dil标记的内皮祖细胞存活及分布情况 治疗8周后，每组取3只大鼠左侧肾脏，制作肾脏损伤组织冰冻切片并进行4’，6-二脒基-2苯基吲哚染色。显微镜下随机选取每张切片的3个视野进行拍照记录；假设每张照片的总亮度为1，每张照片选取一个光亮度点，利用ACDsee5.0软件确定其坐标值。

1.4.7 TUNEL法检测肾细胞凋亡情况 治疗8周后，每组随机取3只大鼠肾脏组织，每只大鼠制备5张石蜡切片，石蜡切片常规脱蜡至水，滴加1滴复合消化液(蛋白酶K与胃蛋白酶)，25 ℃孵化20 min，洗涤后滴加TUNEL标记反应混合液50 μL，在湿盒中37 ℃孵育1 h，滴加POD2转化液50 μL，湿盒37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，DAB显色；苏木精复染，显微镜下分析图像，棕黄色细胞核的细胞为凋亡细胞，计数凋亡细胞数。

1.5 主要观察指标 ①内皮祖细胞形态；②大鼠血糖、胰岛素、血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白水平；③大鼠肾质量/体质量比值；④内皮祖细胞存活及分布；⑤肾组织细胞凋亡数。

1.6 统计学分析 将所有数据输入Excel 2010表格中，去除异值，用生物统计学软件SPSS 16.0进行统计分析；组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，计量数据用x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

1型糖尿病是一种机体自身免疫性疾病，环境条件、基因遗传、自身免疫等诸多因素皆有可能诱发1型糖尿病^[28-30]；1型糖尿病特异性损伤机体分泌胰岛素的胰岛β细胞，从而导致机体血糖浓度升高。研究显示，高血糖可以引发肾脏的一系列病理学变化，诸如肾小球过滤功能障碍、肾脏细胞损伤以及氧化应激等。1型糖尿病诱发的高血糖还会通过激活细胞凋亡信号转导通路，引起糖尿病患者肾脏足细胞损伤和凋亡^[31-32]。此外长期使用胰岛素会导致1型糖尿病患者对胰岛素敏感性下降，是引发1型糖尿病肾病的重要原因之一。研究表明，内皮祖细胞不仅可直接生成内皮细胞，也可通过旁分泌作用生成多种细胞因子发挥作用；在糖尿病肾病进程中，内皮祖细胞参与内皮细胞修复和血管新生^[30^，^33-34]。Yuen等^[35]发现内皮祖细胞可以显著改善慢性肾脏疾病大鼠的肾脏功能，减少尿蛋白，提高肾脏中的毛细血管密度，缓解肾小球和肾小管的组织硬化和间质纤维化。这些研究均提示内皮祖细胞在糖尿病肾病患者治疗中可能具有重要作用。但是目前就内皮祖细胞移植对1型糖尿病肾病肾脏功能影响的研究较少。

实验结果显示，单纯内皮祖细胞移植显著降低了1型糖尿病模型大鼠血糖、血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白含量，显著提高了血清胰岛素水平。此外，内皮祖细胞治疗显著降低了肾质量/体质量指数并缓解了肾脏细胞凋亡。这一结果表明，内皮祖细胞移植对1型糖尿病肾病有显著的改善作用，并明显缓解了因糖尿病导致的肾脏细胞凋亡。研究表明，1型糖尿病引发的高血糖、细胞炎症和氧化应激等因素均会迫使内皮祖细胞增殖活化和黏附能力降低，严重影响了1型糖尿病的恢复^[36-37]。吡格列酮是一种降血糖药物，庞烨峰等^[25]研究显示吡格列酮通过激活过氧化物酶增殖体激活受体PPAR-γ，增强机体对胰岛素敏感性，进而促进组织对血糖摄取和肝糖合成，抑制胰岛炎症发生，保护胰岛β细胞，维持了机体胰岛素的分泌水平，以达到缓解胰岛素抵抗并降低血糖浓度的目的。实验结果显示吡格列酮灌胃处理显著提高了大鼠肾脏功能和细胞存活。吡格列酮灌胃和内皮祖细胞移植联合治疗方法更为显著地提高了大鼠肾脏功能，缓解了糖尿病诱发的肾脏细胞凋亡和损伤。研究表明吡格列酮可在体外促进内皮祖细胞增殖活化，在体内促进糖尿病大鼠内皮祖细胞的增殖^[26-27]。Redondo等^[38]研究显示，吡格列酮是PPAR-γ受体高选择性的人工配体，PPAR-γ受体的激动可以实现对内皮祖细胞的激动和活化。此外，Sorrentino等^[39]认为，PPAR-γ受体激动剂降低了氧化酶活性，进而提高内皮祖细胞形成新生血管的能力，这可能是吡格列酮灌胃和内皮祖细胞移植联合治疗显著提高糖尿病肾病大鼠肾脏功能的作用机制。

实验通过吡格列酮灌胃和内皮祖细胞移植相联合，更为显著地提高了大鼠肾脏功能，缓解了糖尿病诱发的肾脏细胞凋亡和损伤，这一措施为1型糖尿病肾病的治疗提供了借鉴和支持。