Runx2基因高表达对脐血间充质干细胞成骨分化相关基因表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.024

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (9): 1444-1449.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.024

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Runx2基因高表达对脐血间充质干细胞成骨分化相关基因表达的影响

周大凯¹，李慧宁¹，马珊珊²，程田³

¹新乡市中心医院脊柱外科，河南省新乡市 453000；²郑州大学生命科学学院，河南省郑州市 450001；³郑州大学第一附属医院，河南省郑州市 450052

出版日期:2017-03-28 发布日期:2017-03-31
通讯作者: 程田，博士，主治医师，郑州大学第一附属医院，河南省郑州市 450052
作者简介:周大凯，男，1982年生，河南省新乡市人，汉族，2008年南方医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事干细胞与脊髓损伤的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(U1404313)，课题名称：HDAC1双向调控在脐带MSCs向神经元样细胞定向分化过程中的作用和机制研究

Runx2 over-expression effect on expression of osteogenesis related genes in osteogenic differentiation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells

Zhou Da-kai¹, Li Hui-ning¹, Ma Shan-shan², Cheng Tian³

¹Department of Spinal Surgery, Xinxiang Central Hospital, Xinxiang 453000, Henan Province, China; ²School of Life Science, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan Province, China; ³First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China

Online:2017-03-28 Published:2017-03-31
Contact: Cheng Tian, M.D., Attending physician, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
About author:Zhou Da-kai, Master, Attending physician, Department of Spinal Surgery, Xinxiang Central Hospital, Xinxiang 453000, Henan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. U1404313

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
Runx2：属于转录因子Runx家族成员，是骨形态发生蛋白下游的重要调节因子，在骨形态发生蛋白诱导的骨再生中发挥重要作用。Runx2的表达受到多种参与成骨分化的因子调控。
脐血间充质干细胞：研究表明，脐血间充质干细胞在体外培养过程中不表达 CD14，CD34 和 CD45，而表达CD106，CD54，SH2，SH3 和 SH4。电子光学显微镜下观察可以看到脐血间充质干细胞中某些间质标记物表达阳性，如 SMA、波形蛋白、巢蛋白及结蛋白。脐血间充质干细胞还表达一种特殊的标记HOX，尤其是HOXA9，HOXB7，HOXC10及HOXD8，被称为间充质干细胞的“生物学指纹”，这是从脐血中分离间充质干细胞的特异性标记之一。

摘要
背景：Runx2在成骨分化的信号途径中起核心作用，在诱导干细胞成骨分化及促进骨愈合方面具有重要的研究意义。
目的：观察Runx2基因高表达对脐血间充质干细胞成骨分化的影响。
方法：①扩增Runx2基因，利用腺病毒载体构建Runx2重组腺病毒(pAd-Runx2)，检测病毒滴度后用重组腺病毒感染脐血间充质干细胞，并于荧光显微镜下观察荧光表达变化；②感染后1，3，7，14 d采用实时荧光定量PCR及Western blot检测脐血间充质干细胞Runx2、BMP-2、OCN、ALP的mRNA和蛋白表达。
结果与结论：①成功制备pAd-Runx2重组腺病毒，病毒滴度为1.7×10¹⁰ pfu/L；②Runx2重组腺病毒感染脐血间充质干细胞后细胞形态呈成骨样细胞改变，对照组细胞无明显变化；③感染组细胞Runx2、BMP-2、OCN、ALP mRNA和蛋白的表达量随感染时间的增加均有不同程度的上调；④结果表明，高表达Runx2基因腺病毒感染脐血间充质干细胞，能够上调BMP-2、OCN、ALP基因的表达，从而促进脐血间充质干细胞的成骨分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0003-2247-1922(程田)

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐血间充质干细胞, 腺病毒载体, Runx2基因, 成骨分化, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Runx2 plays a central role in osteogenic differentiation, which is of important significance in new bone formation.
OBJECTIVE: To observe the effect of Runx2 over-expression on osteogenic differentiation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells.
METHODS: Runx2 was generated by RT-PCR and the recombinant adenovirus (pAd-Runx2) was constructed. The viral titer was determined by air dilution method. After being transfected into human umbilical cord blood mesenchymal stem cells, the green fluorescence was observed under fluorescence microscope. Real-time fluorescent quantitative PCR and western blot were used to detect mRNA expression changes of osteogenesis related genes, Runx2, OCN, BMP-2, ALP, in human umbilical cord blood mesenchymal stem cells at 1, 3, 7 and 14 days after transfection.
RESULTS AND CONCLUSION: The recombinant adenovirus was successfully constructed and the titer was 1.7×10¹⁰ pfu/L. After infection by pAd-Runx2, human umbilical cord blood mesenchymal stem cells expressed green fluorescence protein clearly under the fluorescence microscope. Cells in the transfected group differentiated into osteoblast-like cells, and those in the control group stayed the same as pre-infected. The expression of Runx2, OCN, BMP-2 and ALP in the transfected group increased over time to some extent, but these changes were not detected in the control group. These findings indicate that Runx2 over-expression can promote the osteogenic differentiation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells.

Key words: Cord Blood Stem Cell Transplantation, Core Binding Factor Alpha 1 Subunit, Adenoviridae, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

周大凯，李慧宁，马珊珊，程田. Runx2基因高表达对脐血间充质干细胞成骨分化相关基因表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(9): 1444-1449.

Zhou Da-kai, Li Hui-ning, Ma Shan-shan, Cheng Tian. Runx2 over-expression effect on expression of osteogenesis related genes in osteogenic differentiation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(9): 1444-1449.

图/表（结果） 2

2.1 重组腺病毒pAd-Runx2的构建 提取的RNA具有清晰的18 S和28 S条带，能够满足实验要求。PCR扩增出大小为1 500 bp的特异性条带，测序结果经BLAST比对与GenBank中的Runx2全序列大小一致(图1A)。pAdTrack-CMV-Runx2质粒与pAdEasy1在BJ5183菌体内同源重组后，PacⅠ酶切得到1条约23 kb的片段和1条4 500 bp的片段(图1B)。

2.2 pAd-Runx2的滴度 见图2。利用空斑法测定pAd- Runx2的滴度为1.7×10¹⁰ pfu/L。

2.3 pAd-Runx2感染脐血间充质干细胞 pAd-Runx2腺病毒进入脐血间充质干细胞并在细胞中成功表达。见图3。

2.4 pAd-Runx2感染脐血间充质干细胞后镜下观察成骨分化情况 感染组细胞体积变大，呈鳞片状，细胞核增大。细胞中成骨样细胞数量随培养时间的延长而增加。对照组细胞呈脐血间充质干细胞的典型形态，呈漩涡状生长或呈束生长，形状类似于成纤维细胞，未见成骨样改变(图4)。

2.5 实时荧光定量PCR检测结果 感染组Runx2基因的表达量从第3天开始增加，14 d时表达量达到最大值，与对照组比较差异均有显著性意义(P < 0.05，图5A)；感染组OCN基因的表达量从第3天开始增加，14 d时达最大值，但是3，7 d的表达量与对照组比较差异无显著性意义，14 d时明显高于对照组(P < 0.05，图5B)；感染组BMP-2基因的表达量在第1天时无明显变化，3 d时开始增加，7 d时持续增加，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，14 d时达到最大，明显高于对照组(P < 0.05，图5C)；感染组ALP基因的表达量在1，3 d时均无明显变化，7 d时有所增加，14 d时与对照组比较表达量明显增加(P < 0.05，图5D)。

2.6 Western blot检测结果 对照组中各时间点成骨相关基因均未见表达，感染组中成骨相关基因随时间推移表达量均有不同程度的上升，其中Runx2和BMP-2表达量的增加最为显著，见图6。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 于2014年7月至2015年12月在新乡医学院基础医学院完成。

1.3 材料 实验所用的脐血标本来源于新乡市中心医院妇产科，产妇及其家属均知情同意。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Omega 公司，美国)；DMEM/F12培养基(赛默飞世尔生物公司，中国)；胰蛋白酶(Solarbio公司，美国)；qRT-PCR试剂盒、反转录试剂盒(TaKaRa公司，日本)；Runx2、BMP-2、OCN、ALP引物(上海生工生物公司，中国)；Western 试剂盒(郑州森斯科贸公司，中国)；腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV(普如汀生物公司，中国)；大肠杆菌感受态(鼎国生物公司，中国)；生物安全柜、CO₂恒温培养箱(Thermo公司，美国)；高速冰冻离心机(Eppendorf公司，德国)；恒温摇床(哈尔滨市东联公司)；ABI Fast 7500 real time system(Gene 公司，美国)。骨肉瘤细胞系以及293细胞系为郑州大学干细胞实验室惠赠。

1.4 实验方法

1.4.1 Runx2重组腺病毒的构建及包装 从骨肉瘤细胞系提取总RNA，反转录为cDNA。通过RT-PCR扩增得到Runx2基因序列(上游引物：5’-ACT AGA TGC TTT ATT GGA TCC GGT ACC ATG GCA TCA AAC AGC CTC TTC AG-3’；下游引物：5’-AGC TGG GTT GCG GCC GCA CTC GAG CTA ATA TGG TCG CCA AAC AGA TTC AT- 3’)，插入到穿梭质粒pAdTrack-CMV，测序验证正确后提取质粒并转化入大肠杆菌BJ5183感受态细胞中与腺病毒骨架质粒同源重组以获得重组腺病毒载体pAd-Runx2，然后转染至293细胞包装重组腺病毒(pAd-Runx2)。

1.4.2 重组腺病毒的扩增 吸取10 μL包装好的腺病毒，感染85%融合的293细胞，常规培养5-7 d，当293细胞出现明显的细胞病变时，收集细胞，在液氮和37 ℃水中反复冻融五六次，每次10-15 min，12 000 r/min离心1 min后得到的上清液即为在293细胞中扩增的腺病毒，反复感染可大量获得腺病毒。

1.4.3 重组腺病毒的滴度测定 根据文献[13]采用空斑法测定病毒滴度。使用DMEM/高糖培养基以10倍依次梯度稀释pAd-Runx2腺病毒原液，取各个浓度病毒20 μL分别感染85%融合的293细胞，加稀释液时反复吹打使之与细胞充分接触，每组做3个复孔，然后置于37 ℃的CO₂培养箱中孵育1 h，弃去培养液，每孔注入1 mL琼脂培养基使其均匀覆盖细胞，待培养基充分凝固将细胞培养板置于培养箱中继续孵育培养，每日定时观察各孔中空斑形成情况并计数，待空斑数目稳定时停止计数(此过程需五六天)；根据细胞发生完全病变孔中的细胞数目来计算腺病毒的滴度。

1.4.4 脐血间充质干细胞培养及传代方法 无菌条件下取新乡市中心医院正常足月剖腹产胎儿的脐血40-80 mL，20 U/mL肝素抗凝，采集后12 h内分离淋巴细胞。将新鲜取得的脐血与预冷的PBS等体积充分混匀、稀释，稀释脐血以1∶1体积叠加于淋巴细胞分离液上(密度为1.077 g/mL)，室温下1 500 r/ min离心15 min。此时离心管中液体分为4层，吸取血清层和分离液层之间的白色云雾状有核细胞层，800 r/min离心5 min，以PBS洗涤2次，少量培养基悬浮细胞并计数。调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-¹接种于人脐血血清包被过的塑料培养瓶(少量体积分数为5%人脐血血清包被，室温下30-60 min，4 ℃保存或立即使用)，培养基采用含体积分数为10%人脐血血清、5 µg/L粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、15 µg/L白细胞介素3的DMEM/F12，调整pH为7.2-7.4，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度环境下培养，3 d后首次换液，去除未贴壁细胞，以后每隔1 d换液1次。当培养瓶中的细胞生长到80%左右融合时，用2.5 g/L胰酶加EDTA混合液消化，按1∶1传代培养。传代过程中每2 d半量换液，直至贴壁细胞80%融合。

1.4.5 pAd-Runx2感染脐血间充质干细胞 用MOI为10的Runx2重组腺病毒感染第4代脐血间充质干细胞，并将此细胞作为感染组，将正常培养的第4代脐血间充质干细胞作为对照组，每组做3个复孔。两组细胞置于37 ℃的CO₂培养箱中培养48 h，倒置相差显微镜和倒置荧光显微镜下观察细胞形态变化及荧光表达。

1.4.6 实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Runx2、BMP-2、OCN及ALP的mRNA表达 收集感染后1，3，7，14 d的各组细胞，提取细胞总RNA，反转录为cDNA后按照TaKaRa公司的RT-PCR试剂盒说明书于ABI Fast 7500系统进行实时荧光定量PCR，以GAPDH为内参，反应结束后观察熔解曲线及扩增曲线。根据Ct值计算法计算出基因的相对表达量^[14]。实验所用引物序列见表1。

1.4.7 Western blot检测两组细胞中Runx2、OCN、BMP-2、ALP的蛋白表达 分别取感染组和对照组细胞，各组样品加入适量蛋白裂解液充分裂解蛋白后离心收集上清，BCA法测量蛋白浓度。取适量蛋白进行SDS-PAGE电泳分离。转膜后置于5%的脱脂奶粉溶液中封闭1.5 h；加入Runx2、OCN、BMP-2、ALP蛋白一抗(1︰500稀释)，于4 ℃孵育过夜；TBST充分洗5次，用HRP标记的二抗孵育1.5 h后充分洗膜，然后ECL发光成像，扫描结果用Image J软件进行蛋白灰度分析。以目的蛋白条带与GAPDH条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.5 主要观察指标 ①测序检测重组腺病毒pAd-Runx2的构建是否成功；②空斑法测定pAd-Runx2的滴度；③普通光倒置相差显微镜下观察两组细胞的形态，荧光倒置显微镜下观察感染组细胞荧光表达；④qRT-PCR和Western blot检测Runx2、OCN、BMP-2、ALP的mRNA和蛋白表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0软件行统计分析，感染后各组中成骨相关基因的mRNA及蛋白表达差异采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

讨论

疾病及创伤造成的大面积骨缺损给患者及家人带来极大痛苦^[15]，也一直是创伤骨科的治疗难题。在骨缺损修复过程中，从修复效果、免疫排斥、疾病传播等方面来考虑，自体骨移植是最优化选择，但其来源有限且取骨区有产生并发症的可能，因此其临床应用具有很大局限性^[16]。

脐血间充质干细胞具有多分化潜能、调节炎症因子作用以及造血支持等特点。在成骨分化方面，脐血间充质干细胞取材简便，具低免疫原性，易于诱导分化为软骨细胞、成骨细胞^[17]，被认为是一种用于骨再生和修复的比较理想的骨组织工程种子细胞^[8]。成骨诱导培养基中含有如抗坏血酸、甘油磷酸钠、地塞米松等化学药物以及Runx2、IGF-2、骨形态发生蛋白2等生物因子等^[18]。由于体内环境的限制，这些方法有很大的局限性，如地塞米松在体内作用时间较短，且有不良反应，所以其在体内促成骨作用较小。骨形态发生蛋白2在体内促成骨分化过程中起着重要作用，但是其进入体内后易被降解。因此，寻求外源性活性因子长期稳定作用于骨缺损的方法成为骨组织工程的研究重点。实验利用腺病毒表达系统，将具有促成骨分化作用的Runx2基因转染至脐血间充质干细胞中，并使其稳定表达Runx2基因，解决了在体内脐血间充质干细胞成骨分化问题。脐血间充质干细胞诱导后成骨分化的鉴定方法目前主要有以下几种：①细胞形态学变化：细胞由梭形变为多角形，细胞体积变大等；②成骨相关标志基因的表达变化：Runx2、BMP-2、OCN等；③特异性蛋白表达变化：ALP、COL1等；④矿化结节的形成。核心结合因子Runx2属于runt基因家族，是成骨特异性转录因子。Enomoto等^[19]经目的基因敲除研究发现，Runx2基因缺失小鼠不能有效分化出成骨细胞，因而未能发生膜内和软骨内成骨。实验采用实时荧光定量PCR和Western blot检测感染Runx2重组腺病毒后不同时间细胞中Runx2、BMP-2、OCN、ALP基因和蛋白的表达水平。结果发现，感染重组腺病毒3 d开始成骨相关基因表达有不同程度的增加，以Runx2的表达最为显著，BMP-2次之，14 d时达到最大值，说明Runx2能够上调脐血间充质干细胞中各相关基因的转录、翻译，并使其定向分化。BMP-2是转化生长因子超家族成员，属于促成骨分化因子，能够促进骨损伤修复^[20-24]。有研究表明，BMP-2可通过旁分泌和自分泌的途径加速细胞增殖，促进间充质干细胞的成骨分化^[25-26]，是干细胞成骨分化的关键因子^[27]。实验结果显示，Runx2重组腺病毒感染脐血间充质干细胞后3 d，BMP-2的mRNA及蛋白表达均出现上调，并随感染时间的延长表达量增加。OCN是成骨细胞合成的结构蛋白，经过翻译后加工生成羧化骨钙素而参与骨骼发育，被认为是经典的骨形成指标。ALP是成骨细胞分化早期和中期的一个标志性蛋白，此外，ALP作为一种细胞内酶，活性越高说明前成骨细胞向成熟成骨细胞分化越明显，因此其可作为成骨细胞功能状态的一个重要指标来衡量间充质干细胞向成骨细胞方向分化的程度^[28]。

为了使目的基因更好的整合到靶细胞，载体的选择尤为重要。实验以腺病毒基因组为基础，与普通质粒相比，具有宿主范围广，低致病性，高滴度等特点^[29]。在此表达系统中，共用到2个质粒，即携带GFP的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-cmv和腺病毒骨架质粒pAdEasy1。通过PCR扩增目的基因Runx2后连接至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上，经过PmeI线性化酶切回收，转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞，在BJ5183菌体内与腺病毒骨架质粒pAdEasy1进行同源重组，获得重组腺病毒表达载体pAdTrack-CMV-Runx2- Easy1，简称pAdRunx2，pAdRunx2经过PacⅠ酶切后，将其转染至293细胞中包装出较高滴度的重组腺病毒。pAdEasy1质粒缺失了腺病毒复制所必备的E1功能区，因此，重组腺病毒在靶细胞中无复制能力，避免了其对靶细胞的伤害。除此之外，在靶细胞中，重组腺病毒携带的外源基因不会整合到靶细胞基因组，不会发生突变的情况。实验成功构建了Runx2的重组腺病毒载体，并利用腺病毒包装系统成功获得了较高滴度的高表达Runx2重组腺病毒，并成功感染脐血间充质干细胞用于研究Runx2基因调控干细胞的成骨分化。

综上，高表达Runx2可上调成骨相关基因的表达进而促进脐血间充质干细胞成骨分化，该实验结果为骨组织工程提供一个初步的实验依据。实验所涉及到的具体分子机制，将在后续实验过程中进一步探讨。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Runx2基因高表达对脐血间充质干细胞成骨分化相关基因表达的影响

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