人羊膜间充质干细胞移植联合百令胶囊改善大鼠肾功能及血液高凝状态

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.024

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (1): 133-139.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.024

• 干细胞移植 stem cell transplantation • 上一篇下一篇

人羊膜间充质干细胞移植联合百令胶囊改善大鼠肾功能及血液高凝状态

郭志伯¹，张晨洁²，马李娜³，高大维⁴，周芳⁵，李娜娜⁶，周俊雪⁷，张娜⁸

保定市第二中心医院，¹血肾科，²透析科，³妇产科，⁴检验科，⁵肾内科，河北省保定市 072750；⁶保定市第三中心医院肾内科，河北省保定市 071000；定州市人民医院，⁷泌尿外科，⁸普外科，河北省定州市 073000

出版日期:2017-01-08 发布日期:2017-03-15
作者简介:郭志伯，男，1982年生，河北省隆尧县人，汉族，2007年河北医科大学毕业，医师，主要从事肾脏内科、急、慢性肾炎、尿毒症方面的研究。
基金资助:
保定市科学技术研究与发展指导计划(16ZF184)

Effect of corbrin capsule combined with human amniotic mesenchymal stem cell transplantation on rat renal function and hypercoagulability

Guo Zhi-bo¹, Zhang Chen-jie², Ma Li-na³, Gao Da-wei⁴, Zhou Fang⁵, Li Na-na⁶, Zhou Jun-xue⁷, Zhang Na⁸

¹Department of Hematology and Nephrology, ²Department of Dialysis, ³Department of Gynecology and Obstetrics, ⁴Clinical Laboratory, 5Department of Nephropathy, Baoding Second Central Hospital, Baoding 072750, Hebei Province, China; ⁶Department of Nephrology, Baoding Third Central Hospital, Baoding 071000, Hebei Province, China; ⁷Department of Urinary Surgery, ⁸Department of General Surgery, People’s Hospital of Dingzhou, Dingzhou 073000, Hebei Province, China

Online:2017-01-08 Published:2017-03-15
About author:Guo Zhi-bo, Physician, Department of Hematology and Nephrology, Baoding Second Central Hospital, Baoding 072750, Hebei Province, China
Supported by:
the Scientific Research and Development Plan of Baoding City, No.16ZF184

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
肾病综合征：是临床上较普遍的慢性肾病之一。最直观的病理表现为患者多为蛋白尿，因此造成体内蛋白大量流失，破坏机体营养平衡，长期引起营养不良，同时血浆蛋白含量下降，人体内血浆渗透压降低，可能会引起部分或全部机体水肿。目前，并不能明确其发病机制，但已有研究证实可能与淋巴细胞，足细胞的免疫调节和免疫介导有关。
百令胶囊：可降低肾切除及庆大霉素致肾损伤大鼠血清肌酐、尿素氮及尿蛋白含量，减少组织病理学损伤。

摘要
背景：百令胶囊的主成分是虫草酸，主要功效为免疫调节、改善血脂和保护肾脏等。人羊膜间充质干细胞是一种比骨髓间充质干细胞分化潜能更强的干细胞，但是目前其对肾损伤后的修复及改善尚缺乏研究。
目的：观察人羊膜间充质干细胞移植联合百令胶囊对肾病综合征大鼠大鼠肾功能及凝血的影响。
方法：体外培养人羊膜间充质干细胞，并制备其细胞悬液并进行CM-Dil标记。50只SD大鼠随机分为5组(n=10)。正常组不予任何处理；余40只大鼠静脉注射阿霉素建立阿霉素肾病大鼠模型，均分为4组，模型组不作处理，人羊膜间充质干细胞组连续3 d尾部静脉注射干细胞、百令胶囊组连续12周灌胃百令胶囊，联合组连续3 d尾静脉注射人羊膜间充质干细胞，同时连续12周灌胃百令胶囊。实验12周时检测各组大鼠血肌酐、尿素氮、凝血指标、24 h尿蛋白水平；苏木精-伊红染色观察肾组织病理变化；荧光显微镜观测CM-Dil标记人羊膜间充质干细胞的存活及分布；TUNEL法检测肾脏细胞凋亡情况。
结果与结论：①人羊膜间充质干细胞组、百令胶囊组血肌酐和尿素氮、24 h尿蛋白水平高于联合组，明显低于模型组，大鼠的血液高凝状态有所缓解，差异有显著性意义(P < 0.05)；联合组凝血指标低于人羊膜间充质干细胞组、百令胶囊组(P < 0.05)；②模型组的肾脏病理没有改善甚至恶化，联合组的病理改善情况优于人羊膜间充质干细胞组和百令胶囊组；③荧光显微镜观测CM-Dil标记的人羊膜间充质干细胞，联合组多于人羊膜间充质干细胞组；④模型组凋亡细胞面积最大，人羊膜间充质干细胞组、百令胶囊组可见细胞凋亡，联合组细胞凋亡面积较小，组间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；⑤结果提示，人羊膜间充质干细胞移植联合百令胶囊能够改善肾病综合征大鼠的肾功能及血液高凝状态，减少蛋白尿程度，改善组织病理损伤程度，减少肾组织细胞凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3224-4459(郭志伯)

关键词: 干细胞, 移植, 人羊膜间充质干细胞, 百令胶囊, 大鼠, 肾病综合征, 肾功能, 凝血, 高凝状态, 蛋白尿, 病理损伤

Abstract:

BACKGROUND: As the main component of cordycepic acid, corbrin capsule mainly functions to improve blood lipids and protect the kidneys. Human amniotic mesenchymal stem cells are a kind of stem cells that have stronger differentiation potential than bone marrow mesenchymal stem cells. However, there are less reports on renal injury repair and post-repair functional improvement.
OBJECTIVE: To observe the effect of human amniotic mesenchymal stem cell transplantation with corbrin capsule on blood coagulation and renal functions of rats with nephrotic syndrome.
METHODS: Human amniotic mesenchymal stem cells were cultured in vitro and made into cell suspension labeled with with CM-Dil. Fifty Sprague-Dawley were randomly divided into five groups (n=10 per group): normal control group with no intervention, model group, cell transplantation group, corbrin capsule group and combined treatment group. Except the normal control groups, rats in all the groups were used to make nephropathy models by rats by intravenous injection of adriamycin. After modeling, rats in the latter three groups were given intravenous injection of human amniotic mesenchymal stem cells for 3 days, intragastric administration of corbrin capsule for 12 weeks, and the combination of cell transplantation and corbrin capsule, respectively. Twelve weeks later, serum creatinine, blood urea nitrogen, blood coagulation index, and 24-hour urine protein levels were detected. Pathological changes of the renal tissues were observed by hematoxylin-eosin staining. Survival and distribution of CM-Dil labeled human amniotic mesenchymal stem cells were observed by fluorescence microscope. Apoptosis in renal tissues was detected using TUNEL method.
RESULTS AND CONCLUSION: Serum creatinine, blood urea nitrogen and 24-hour urine protein levels in the cell transplantation and corbrin capsule groups were significantly decreased compared with the model group, but still higher than that in the combined treatment group (P < 0.05). Coagulation indexes in the combined treatment group were significantly lower than those in the cell transplantation and corbrin capsule groups (P < 0.05). The hypercoagulable state of rats was relieved in the three treatment groups. Pathological changes of the renal tissues were deteriorated in the model group, and improved in the three treatment groups, especially in the combined treatment group. Under the florescence microscope, the number of CM-Dil-labeled human amniotic mesenchymal stem cells was higher in the combined treatment group than the cell transplantation and corbrin capsule groups. Compared with the model group, the cell apoptosis in the renal tissue was relieved in the three treatment groups, especially in the combined treatment (P < 0.05). To conclude, human amniotic mesenchymal stem cell transplantation with corbrin capsule can improve renal function and hypercoagulable state of nephrotic syndrome rats, by reducing the degree of proteinuria, improving the degree of pathological damage and reducing renal cell apoptosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Amnion, Mesenchymal Stem Cells, Nephrosis, Lipoid, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

郭志伯，张晨洁，马李娜，高大维，周芳，李娜娜，周俊雪，张娜. 人羊膜间充质干细胞移植联合百令胶囊改善大鼠肾功能及血液高凝状态[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(1): 133-139.

Guo Zhi-bo, Zhang Chen-jie, Ma Li-na, Gao Da-wei, Zhou Fang, Li Na-na, Zhou Jun-xue, Zhang Na. Effect of corbrin capsule combined with human amniotic mesenchymal stem cell transplantation on rat renal function and hypercoagulability[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(1): 133-139.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 纳入50只大鼠，分为5组，取10只为正常组，余40只大鼠随机分为4组，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 人羊膜间充质干细胞的形态观察 人羊膜间充质干细胞复苏后在体外培养五至六天可传代，传代后24 h内即可呈贴壁生长，形态多样，呈梭形、纺锤形、星形或多边形。

P2代的人羊膜间充质干细胞贴壁速度加快，呈长梭形集落生长，均一性较好，显微镜下可见胞浆含有中间丝及高尔基复合体等。P3的人羊膜间充质干细胞形态单一，纯度较好，细胞排列紧密，呈漩涡状分布。

第3代的人羊膜间充质干细胞见图1。

2.3 各组大鼠血肌酐、尿素氮、凝血指标、24 h尿蛋白水平比较 人羊膜间充质干细胞组、百令胶囊组血肌酐和尿素氮、24 h尿蛋白水平均高于联合组，但明显低于模型组，大鼠的血液高凝状态有所缓解，差异有显著性意义(P < 0.05)；联合组血生化指标低于人羊膜间充质干细胞组、百令胶囊组(P < 0.05)。各组大鼠血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白水平检测结果见表1及图2，各组大鼠凝血指标检测结果见表2及图3。

2.4 肾组织病理学变化 苏木精-伊红染色结果显示，联合组的病理改善情况优于人羊膜间充质干细胞组和百令胶囊组，模型组的肾脏病理没有改善甚至恶化，人羊膜间充质干细胞组和百令胶囊组稍有改善，但不及联合组。各组大鼠的病理学变化比较见图4。

2.5 CM-Dil标记羊膜间充质干细胞存活及分布情况 荧光显微镜观测CM-Dil标记人羊膜间充质干细胞的存活情况，与人羊膜间充质干细胞组比较，联合组CM-Dil标记的人羊膜间充质干细胞明显增多，见图5。

2.6 各组大鼠肾脏细胞凋亡情况 模型组阳性细胞凋亡面积最大，人羊膜间充质干细胞组、百令胶囊组可见阳性细胞凋亡，联合组细胞凋亡面积较小，组间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表3及图6。

参考文献

[1] Audard V, Lang P, Sahali D. [Minimal change nephrotic syndrome: new insights into disease pathogenesis]. Med Sci (Paris). 2008;24(10): 853-858.

[2] Asanuma K,Yanagida-Asanuma E,Faul C,et al.Synaptopodin orchestrates actin organization and cell motility via regulation of RhoA signalling. Nat Cell Biol. 2006;8(5):485-491.

[3] Mustafa G, Khan PA, Iqbal I, et al. Simplified quantification of urinary protein excretion in children with nephrotic syndrome. J Coll Physicians Surg Pak. 2007;17(10): 615-618.

[4] Marshall SM. The podocyte: a potential therapeutic target in diabetic nephropathy. Curr Pharm Des. 2007;13(26):2713-2720.

[5] Cunard R, Kelly CJ. T cells and minimal change disease. J Am Soc Nephrol. 2002;13(5): 1409-1411.

[6] Grimbert P, Audard V, Remy P, et al. Recent approaches to the pathogenesis of minimal-change nephrotic syndrome. Nephrol Dial Transplant. 2003;18(2): 245-248.

[7] Bruno S, Grange C, Deregibus MC, et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. J Am Soc Nephrol. 2009;20(5):1053-1067.

[8] Oh J,Kemper MJ.Minimal change (steroid sensitive) nephrotic syndrome in children: new aspects on pathogenesis and treatment. Minerva Pediatr. 2012;64(2):197-204.

[9] 陆晓东.百令胶囊治疗慢性肾衰的动物实验研究[J].实用中医内科杂志. 2004,18(6):507-508.

[10] 方敬爱,邓安国,周明群,等.百令胶囊对糖尿病肾病大鼠生化指标及肾组织病理学改变的影响[J].中国中西医结合肾病杂志,2005, 6(11):629-632.

[11] 黄勤,何俊卿.百令胶囊联合苯那普利治疗IgA肾病33例的临床观察[J].贵阳中医学院学报,2011,33(1):29-31.

[12] 龚圆渊.六味地黄丸联合bFGF诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究[D].成都中医药大学,2012.

[13] 孔根现. VEGF分别与bFGF、aFGF联合诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞[D].南方医科大学,2013.

[14] Asanuma K,Anagida-Asanuma E,Faul C, et al. Synaptopodin orchestrates actin organization and cell motility via regulation of RhoA signalling. Nat Cell Biol. 2006;8(5): 485-491.

[15] Mustafa G, Khan PA, Iqbal I, et al. Simplified quantification of urinary protein excretion in children with nephrotic syndrome. J Coll Physicians Surg Pak. 2007;17(10): 615-618.

[16] 李保春,刘先峰,张懿,等.骨髓干细胞参与小鼠急性肾小管坏死修复的实验研究[J].中华肾脏病杂志,2006,22(11):664-668.

[17] Lin F. Stem cells in kidney regeneration following acute renal injury. Pediatr Res. 2006;59(4 Pt 2): 74R-8R.

[18] 李慧,孙凌云.间质干细胞的免疫调节及免疫治疗作用研究进展[J].中华医学杂志,2006,86(7):501-503.

[19] 温凯棋,张跃蓉.人羊膜间充质干细胞分离培养的研究进展[J].世界临床医学,2016,10(9):133-134.

[20] 袁博,陈昆仑,张岚, 等.大鼠骨髓间充质干细胞对RH-35肝癌细胞侵袭能力的影响[J].西安交通大学学报,2014,35(4):455-459.

[21] 邹毓华.骨髓间充质干细胞对阿霉素肾病大鼠的保护作用及机制的研究[D].福建医科大学，2012.

[22] 杨焕丹,董晨,关凤军,等.骨髓间充质干细胞移植对嘌呤霉素氨基核苷肾病大鼠足细胞修复作用的研究[J].中国当代儿科杂志, 2010,12(6):483-487.

[23] Turnbull IR, Clark AT, Stromberg PE, et al. Effects of aging on the immunopathologic response to sepsis. Crit Care Med. 2009;37(3): 1018-1023.

[24] Liu WH, Hei ZQ, Nie H, et al. Berberine ameliorates renal injury in streptozotocin-induced diabetic rats by suppression of both oxidative stress and aldose reductase.Chin Med J (Engl). 2008;121(8): 706-712.

[25] 施勇,周梁,田洁, 等.携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子基因慢病毒载体的构建及转染[J].中国眼耳鼻喉科杂志,2008, 8(5): 283-285.

[26] 张文高,杨学军. SPIO在非吞噬细胞成像中的应用及研究进展[J].国际医学放射学杂志,2008,31(06):473-475.

[27] 彭伟,刘郑荣,任昊,等.骨髓间充质干细胞促进大鼠IgA肾病修复[J].中华肾脏病杂志,2008,24(10):743-750.

[28] 连梓敏,曹定睿,王泓源,等.丙泊酚对Wistar大鼠肝癌模型中Bax与Bcl-2表达的影响[J].中国医学创新,2014,(12):28-30.

[29] 马晓燕,曹定睿.舒芬太尼对大鼠肝癌肝细胞Bax和Bcl-2的影响[D].山西医科大学,2014.

[30] 钟文旗,戴宪国,冯彩琴,等.氟伐他汀联合百令胶囊防治肾小球硬化实验研究[J].疑难病杂志,2006,5(3):167-169.

[31] 钟文旗,杨芦蓉,倪娜,等.氟伐他汀联合百令胶囊治疗原发性肾病综合征临床分析[J].医学文选,2005,24(5):671-672.

[32] 黄国东,许健,姜云,等.复方仙草颗粒对IgA肾病肾小球硬化大鼠TGF-β/Smads信号通路的影响[J].时珍国医国药,2010, 21(11): 2822-2824.

[33] 刘江,杨敏,杨金国,等.百令胶囊在肾移植受者慢性排斥中的作用[J].现代中西医结合杂志,2005,14(12);1583-1583.

[34] 刘大伟.百令胶囊联合厄贝沙坦治疗糖尿病肾病微量蛋白尿的临床观察[J].医学信息,2015,10:275-275.

[35] Togel F,Cohen A,Zhang P,et al.Autologous and allogeneic marrow stromal cells are safe and effective for the treatment of acute kidney injury. Stem Cells Dev. 2009;18(3):475-485.

[36] Morigi M,Rota C,Montemurro T,et al.Life-sparing effect of human cord blood mesenchymal stem cells in experimental a-cute kidney injury. Stem Cells. 2010;28(3):513-522.

[37] Chade AR,Zhu X,Lavi R, et al. Endothelial progenitor cells re-store renal function in chronic experimental renovascular disease. Circulation. 2009;119(4):547-557.

[38] Iwasaki M, Adachi Y, Minamino K, et al. Mobilization of bone marrow cells by G-CSF rescues mice from cisplatin-induced renal failure, and M-CSF enhances the effects of G-CSF.J Am Soc Nephrol. 2005;16(3):658-666.

[39] Patschan D, Krupincza K, Patschan S, et al.Dynamics of mobilization and homing of endothelial progenitor cells after acute renal ischemia：modulation by ischemic preconditioning. Am J Physiol Renal Physiol. 2006;291(1): 176-185.

[40] Iwasaki M,Adachi Y,Minamino K,et al.Mobilization of bone marrow cells by G-CSF rescues mice from cisplatin-induced Renal failure,and M-CSF enhances the effects of G-CSF. Am Soc Nephrol. 2005;16(3):658-666.

[41] Siegel N,Rosner M,Unbekandt M,et al.Contribution of human amniotic fluid stem cells to renal tissue formation depends on mTOR. Human Molecular Genetics.2010;19(17):3320-3331.

[42] Togel F,Cohen A,Zhang P,et al.Autologous and allogeneic marrow stromal cells are safe and effective for the treatment of acute kidney injury. Stem Cells Dev. 2009;18(3):475-485.

[43] Tsuda H,Yamahara K,Ishikane S,et al. Allogenic fetal membrane derived mesenchymal stem cells contribute to renal repair in experimental glomerulonephritis. Am J Physiol Renal Physiol. 2010;299(5):1004-1013.

[44] Skak K,Kragh M,Hausman D, et al. Interleukin 21: combination strategies for cancer therapy.Nat Rev Drug Discov. 2008;7(3):231-240.

[45] Bianco P, Robey PG, Simmons PJ. Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays. Cell Stem Cell. 2008; 2(4): 313-319.

引言

慢性肾病已成为威胁人们健康的杀手之一，而肾病综合征是临床上较普遍的慢性肾病之一。最直观的病理表现为患者多为蛋白尿^[1-4]、因此造成体内蛋白大量流失，破坏机体营养平衡，长期引起营养不良^[4]，同时血浆蛋白含量下降，人体内血浆渗透压降低，可能会引起部分或全部机体水肿。目前，并不能明确其发病机制，但已有研究证实可能与淋巴细胞^[5-7]、足细胞的免疫调节和免疫介导有关^[7-8]。西医治疗肾病综合征周期较长、难以根除、且对身体有损伤。中医学对免疫性疾病有很好的治疗效果^[9]。冬虫夏草为传统的中草药，经低温深层发酵后可制成中药百令胶囊，已知百令胶囊的主成分是虫草酸^[10-11]，主要功效为免疫调节、改善血脂和保护肾脏等。

20世纪90年代初，基因治疗已进入新的研究领域，已从基础实验室研究迈向临床研究，为遗传性疾病、免疫缺陷及恶性肿瘤提供了新的研究手段。人羊膜间充质干细胞来源广泛，对产妇及新生儿几乎没有影响，且其分化、增殖能力具有独特的优势^[12-13]，未出现传代后衰老的现象，并有特有的胎盘屏障，其中的间充质干细胞已成为越来越多的研究者关注的对象。

近年来，学者不断挖掘干细胞的作用，越来越多的学者致力于干细胞治疗各种肾病。已有研究者建立了肾小管坏死模型，并移植骨髓间充质干细胞，荧光标记干细胞后，检测出在其肾小管上皮细胞中含有一定数量的干细胞^[14-15]。采用基因修饰的方法改造脐血间充质干细胞，并用于恶性肿瘤、血液病、内分泌疾病、肾病等，具有重大意义，全世界治疗的病例已达到上千例。未来，治疗肾脏相关疾病的手段中，移植骨髓间充质干细胞不失为一种有效的治疗方法^[16]。细胞形态与骨髓间充质干细胞类似的人羊膜间充质干细胞是一种比骨髓间充质干细胞分化潜能更强的干细胞^[17-18]，但是，目前其对肾损伤后的修复及改善尚缺乏研究。

因此，实验采用人羊膜间充质干细胞移植于阿霉素肾损伤大鼠，同时对大鼠进行纯中药百令胶囊灌胃，观察两者联合使用对肾损伤的修复作用。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2014年3月至2015年12月在河北医学院动物实验室完成。

1.3 材料

实验动物及分组：成年健康级SD大鼠50只，雌雄不限，由河北医学院动物实验室提供，体质量300 g左右，依照随机数字表分为5组：正常组、模型组、人羊膜间充质干细胞组、百令胶囊组和联合组(n=10)。

对正常组大鼠普通环境饲养，其余4组大鼠尾部静脉注射阿霉素建立阿霉素肾病大鼠模型。建模完成后，对模型组进行普通环境饲养，对人羊膜间充质干细胞组和联合组大鼠的尾部静脉注射人羊膜间充质干细胞，持续3 d。百令胶囊组大鼠和联合组大鼠，连续12周灌胃一定量的百令胶囊。12周时对各组大鼠进行血生化、病理分析、细胞凋亡等研究。

所有大鼠的饲养条件为23-27 ℃，恒温，湿度为50%-70%，喂养饲料：颗粒型普通大鼠饲料及消毒无菌水，让其自由饮水和进食，实验前1 d禁食不禁水。

试剂及来源：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠购于连云港市德邦精细化工有限公司，百令胶囊购于杭州中美华东制药有限公司，L-DMEM培养基、胎牛血清和混合抗生素(青霉素、链霉素)购自GIBCO公司，胰蛋白酶和CM-Dil购于Sigma公司，阿霉素购于美罗华。

仪器设备：全自动生化仪购自日立公司(型号7170S)，原位细胞凋亡检测(TUNEL)购于贝克曼库尔特公司，细胞培养瓶和培养皿购于上海百研生物科技有限公司，CO₂培养箱购于上海人和科技有限公司，紫外分光光度计购于上海奥析原，荧光显微镜购于上海仪器厂，冷冻切片机购于Leica CM 1900，凝胶成像系统购于Bio-Rad，Gel doc RX。

1.4 方法

1.4.1 体外培养人羊膜间充质干细胞 取正常足月剖腹产婴儿的羊膜(保定市第二中心医院提供，产妇知情同意)，用无菌手术刀将间质组织切割成面积约1 mm²大小切片。放置于无菌操作台中，室温下放置0.5 h，随即用20%的磷酸盐缓冲液洗涤，37 ℃下，0.25%胰酶消化0.5 h，连续消化2次^[19]，20%PBS中和，吸取细胞悬浮液，加至预先配置好的1∶10倍稀释的L-DMEM培养基(胎牛血清与青霉素、链霉素混合抗生素按10∶1的比例配置)。

接种于培养瓶中，并将培养瓶并放置于37 ℃、体积分数5%CO₂的饱和湿度培养箱中^[18]。每2 d更换培养液，除去未贴壁细胞，至细胞融合85%时，去除培养基，吸取贴壁细胞，加至培养皿中，3 g/L胰酶消化5 min，用已配置的等体积的10%胎牛血清低糖培养基终止消化，细胞吹打到成悬液，1 500 r/min，离心5 min，弃去上清非贴壁细胞，在新配置的无菌培养基中调节浓度，依照上述方法进行培养。第3代P3供于该研究^[20]。

1.4.2 建立大鼠肾病综合征模型及细胞移植 正常组大鼠一次性注射生理盐水，剂量为5 mg/kg；其余4组大鼠均于尾部一次性注射注射用盐酸阿霉素，剂量为5 mg/kg，生理盐水溶解^[21]。模型组大鼠前3 d，每天注射1 mL新鲜培养基。人羊膜间充质干细胞组大鼠尾部静脉注射体外培养的人羊膜间充质干细胞悬液，浓度为1×10⁷个细胞，注射3 d。百令胶囊组大鼠灌胃百令胶囊，剂量为2.5 g/(kg•d)，连续灌胃12周。联合组大鼠尾部静脉注射人羊膜间充质干细胞悬液，浓度为1×10⁷个细胞，连续注射3 d；同时灌胃百令胶囊2.5 g/(kg•d)连续12周^[22]。各组大鼠分笼饲养。

1.4.3 检测大鼠血清血肌酐、尿素氮、凝血指标和24 h尿蛋白水平 实验12周，用乙醚麻醉各组大鼠，毛细血管眼眶取血，取眼眶内静脉血样，室温下，迅速离心，5 000 r/min，离心3 min，保留血清移去沉渣，-80 ℃冷冻保存，备用。

肌酐测试(苦味酸不除蛋白法）试剂盒和尿素氮(OPA法)试剂盒分别用来测定血清肌酐和尿素氮^[23]。肌酐测试(苦味酸不除蛋白法)试剂盒原理是样本中的肌酐在碱性溶液中与苦味酸反应生成有色复合物，其生成速率可反映样本中肌酐的含量。肌酐测试(苦味酸不除蛋白法)试剂盒组成为：R1：氢氧化钠0.2 mol/L，苦味酸25 mmol/L。尿素氮(OPA法)试剂盒原理组成为：R1：HADH、叠氮钠；R2：α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、尿酸、叠氮钠^[24]。凝血指标用全自动生化仪检测。实验第12周，收集各组大鼠24 h尿液，混匀，用移液枪各取尿量5 mL，5 000 r/min，离心3 min，吸取上清液，放入全自动生化仪，检测各组大鼠24 h的尿蛋白水平。

1.4.4 采用苏木精-伊红染色法进行肾组织病理学观察 实验12周，大鼠腹腔麻醉后，取左右双肾组织，多聚甲醛固定，冷冻切片机横向切片，明胶包被盖玻片，将厚度为8 μm的切片贴于盖玻片上，-20 ℃保存^[25]。盖玻片完全浸没于无水乙醇，静止0.5 h，放入PBS，漂洗3次，浸入苏木精染液，15 min后，多次浸入蒸馏水，标本为深蓝色。浸入1%HCl，静止片刻，分色后，脱去多余蓝色浮色，标本此时转为淡紫红色，而细胞质为无色或灰蓝色。蒸馏水多次浸洗，15 min后，浸入淡氨水(2滴氨水加入到400 mL蒸馏水中)，10 min后，出现淡蓝色。蒸馏水再次浸洗15 min，浸没伊红染液，染色15 min，蒸馏水浸洗1次，体积分数95%乙醇脱水2次，无水乙醇脱水3次，2次滴入二甲苯，均浸入1 min，最终用中性树胶封盖^[26]。

荧光显微镜400倍镜下观察细胞分布情况，储存数字图像，经Image-Pro Plus 6.0组织切片图像分析软件，计算比较阳性反应面积^[25]。

1.4.5 荧光显微镜观测CM-Dil标记的羊膜间充质干细胞存活及分布情况 病理学研究的基本方法之一是荧光显微镜观察细胞情况，观察过程中保持低温，保留组织微结构完整。因此，将上述已取得的左右肾组织，多聚甲醛固定，冷冻切片机横向切片，明胶包被盖玻片，将厚度为8 μm的切片贴于盖玻片上，每组细胞各至少制作3片细胞切片，用移液枪想切片一侧滴加CM-Dil溶液，另一侧用滤纸吸出，如此反复2次，4 ℃静置5 h，用新鲜配置的PBS洗切片2次，室温下自然烘干^[27]。

荧光显微镜下，每切片随机选取10个视野，观察CM-Dil标记的羊膜间充质干细胞的情况。参照目前国内外普遍认可的5级法对荧光强度进行分级^[27]：4+为高倍镜观测刺眼；+++高倍镜耀眼，低倍镜清晰；++为高低倍镜均可见；+高倍镜可见，低倍镜模糊可见；-高倍镜下模糊似乎可见。

1.4.6 采用TUNEL法观察大鼠肾脏细胞的凋亡情况 实验12周，检测大鼠肾脏细胞凋亡情况，需严格按照贝克曼库尔特公司试剂盒说明书进行操作，标记dUTP缺口末端，该末端以脱氧核苷酸转移酶为介导。分别从5组已处死的大鼠中，剥离已损伤的肾脏组织，多聚甲醛固定，切片，并将切片于室温下放置2 h，浸泡于二甲苯溶液中，浸润15 min后，换新鲜二甲苯溶液，继续浸泡15 min，分别在无水乙醇、体积分数95%，90%，80%，70%乙醇溶液中，放置5 min，后用蒸馏水水化，完成切片的脱蜡水化，加入高压氧使抗原得以修复，加入甲醛灭活内源性过氧化物酶。每片标本加入5 μL/片的TUNEL混合液，和50 μL的POD转化剂，将各组标本片放置于37 ℃湿盒中，30 min，PBS冲洗3次，每次五至六分钟。DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固，光学显微镜下观察^[28]，棕黄色为凋亡细胞核，深蓝色为未凋亡细胞核，肾组织的凋亡情况由凋亡指数表示^[29]。

1.5 主要观察指标 观察检测各组大鼠血清血肌酐、尿素氮、凝血指标和24 h尿蛋白水平；苏木精-伊红染色法对肾组织进行病理学观察；荧光显微镜观测CM-Dil 标记羊膜间充质干细胞的存活及分布情况；TUNEL法观察大鼠肾脏细胞的凋亡情况。

1.6 统计学分析 所有计量数据以x(_)±s表示，成组设计的均数之间采用t 检验方法，多组间的数据比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。实验数据的分析软件为应用SPSS 13.0。

讨论

文章建立在阿霉素诱导肾病综合征模型基础上，对各组大鼠进行血生化、病理分析、细胞凋亡等研究。阿霉素诱导的肾病是一种典型的肾病模型，阿霉素诱导小鼠的肾脏损伤与人微小型肾脏病变相似^[30]。虫草菌是具有免疫调节功能的真菌，通过低温发酵制成的纯中药百令胶囊与天然虫草菌成分基本一致^[31]，因此也具有抗炎、调节免疫，减轻细胞脂质氧化的作用^[32-33]，同时还具备细胞修复、促肾小管细胞增殖和减弱肾小球代偿性肥大的功效^[34]。已有研究表明干细胞不仅对肾损伤有一定的修复功能^[35-37]，对肾小球、肾小管、肾间质的机构有改善作用^[38]。有研究者发现同种异体的胎膜间质干细胞可以修复肾脏，且是通过旁分泌来对肾脏组织进行修复的^[39-40]，其中原因可能是间充质干细胞对肾小球的系膜细胞增殖有促进作用、降低巨噬细胞的滤过作用^[41-42]，对肾小球系膜基质的积聚有一定的调节作用，影响肾小球炎性介质(转化生长因子β1等)的表达等^[43]。

目前人羊膜间充质干细胞移植与中药制剂百令胶囊联合应用治疗肾病综合征尚缺乏研究。本文中人羊膜间充质干细胞组和百令胶囊组大鼠血清的血肌酐和尿素氮、24 h尿蛋白水平较高于联合组，但是与模型组相比明显降低，大鼠的血液高凝状态有所缓解，差异有显著性意义(P < 0.05)，可见人羊膜间充质干细胞和百令胶囊对大鼠肾脏损伤细胞有一定的修复功能。联合组的血生化指标更低，与人羊膜间充质干细胞组、百令胶囊组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。可见对改善肾脏功能的方面，联合应用二者优于单一的方法。

对建模成功12周的大鼠肾脏进行苏木精-伊红染色病理学观察，联合组的病理改善情况优于人羊膜间充质干细胞组和百令胶囊组，模型组的肾脏病理情况没有改善反而有恶化现象，人羊膜间充质干细胞组和百令胶囊组稍有改善，但不及联合组。荧光显微镜观测到CM-Dil标记的人羊膜间充质干细胞，联合组多于人羊膜间充质干细胞组。由此可以猜测百令胶囊作为治疗肾病的辅助药物，对人羊膜间充质干细胞的存活起到一定的保护作用。对阳性凋亡细胞的检测，不予治疗的模型组出现大面积细胞凋亡数目较多，人羊膜间充质干细胞组、百令胶囊组可见一定数目的阳性细胞凋亡，联合组细胞凋亡数目明显减少，正常组细胞凋亡数目最轻，各组之间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。可见移植人羊膜间充质干细胞的大鼠在进行中药制剂百令胶囊治疗后，肾脏微观结构明显比单一治疗的结构完整性好。这可能与间质干细胞分泌物可调节细胞周围微环境^[44-45]，并且其本身具有强大的增殖和自我更新能力有关。

实验从多个方面检测，观察人羊膜间充质干细胞移植联合百令胶囊对肾病综合征大鼠肾功能及凝血的影响。人羊膜间充质干细胞移植联合中药制剂百令胶囊可以改善大鼠的肾功能，对大鼠肾病综合征有较好的治疗作用，同时可以改善大鼠血液高凝状态，减弱蛋白尿程度，改善肾脏组织病理损伤情况，减少肾脏细胞凋亡。

人羊膜间充质干细胞移植联合百令胶囊改善大鼠肾功能及血液高凝状态

Effect of corbrin capsule combined with human amniotic mesenchymal stem cell transplantation on rat renal function and hypercoagulability

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 2

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	项鑫健, 柳芳, 吴亮亮, 贾大平, 陶越, 赵政男, 赵宇. 高剂量维生素C促进大鼠自体脂肪移植成活[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1242-1246.
[2]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[3]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[4]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[5]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[6]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[7]	轩娟娟, 白鸿太, 张继翔, 王耀权, 陈国勇, 魏思东. 调节性T细胞亚群在肝移植中的作用及临床应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1143-1148.
[8]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[9]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[10]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[11]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[12]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[13]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[14]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.
[15]	朱兵兵, 邓江华, 陈晶晶, 慕晓玲. 白细胞介素8受体可提高脐带间充质干细胞迁移和向损伤内皮的黏附[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1045-1050.