生肌玉红膏对增生性瘢痕的抑制作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.33.004

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (33): 4890-4898.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.33.004

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生肌玉红膏对增生性瘢痕的抑制作用

孙桂芳1，张晓芬1，李红昌1，潘丽芸1，陈亚峰1，徐可2，奉典旭1

上海市普陀区中心医院，1普外科， 2中心实验室，上海市 200062

收稿日期:2016-05-28 出版日期:2016-08-12 发布日期:2016-08-12
通讯作者: 奉典旭，博士，主任医师，教授，博士生导师，上海市普陀区中心医院普外科，上海市 200062
作者简介:孙桂芳，女， 1984年生，河南省新郑市人，汉族，上海中医药大学在读博士，主要从事外科创面管理的研究。
基金资助:
上海中医药大学创新团队(B-X-75)；上海市普陀区高层次人才科研创新项目(普人才2014-A-24)

Shengjiyuhong ointment inhibits hypertrophic scar formation

Sun Gui-fang1, Zhang Xiao-fen1, Li Hong-chang1, Pan Li-yun1, Chen Ya-feng1, Xu Ke2, Feng Dian-xu1

1Department of General Surgery, 2Central Laboratory, Shanghai Putuo District Central Hospital, Shanghai 200062, China

Received:2016-05-28 Online:2016-08-12 Published:2016-08-12
Contact: Feng Dian-xu, M.D., Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of General Surgery, Shanghai Putuo District Central Hospital, Shanghai 200062, China
About author:Sun Gui-fang, Studying for doctorate, Department of General Surgery, Shanghai Putuo District Central Hospital, Shanghai 200062, China
Supported by:
the Fund for Creative Research Groups of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, China, No. B-X-75; the Foundation for High-level Talents in Shanghai Putuo District, China, No. PT 2014-A-24

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
增生性瘢痕：临床上增生性瘢痕几乎均继发于深达真皮网状层的皮肤损伤，如皮肤外伤或Ⅱ-Ⅲ度烧伤。病理特征主要表现为肌成纤维细胞的过度增殖及细胞外基质尤其是胶原的过度沉积，致使愈合后的组织过度挛缩，从而导致增生性瘢痕形成。不仅影响美观，还影响器官和组织功能，给患者带来巨大的身心痛苦。
α-平滑肌肌动蛋白：组织受损后，创面边缘的成纤维细胞被激活并分化成为表达α-平滑肌肌动蛋白的肌成纤维细胞，α-平滑肌肌动蛋白显著增加了肌成纤维细胞和胶原晶格的收缩力，可加速创面愈合，促进创面重塑，该过程主要受转化生长因子β1/Smads信号通路调节。

摘要
背景：文献研究和临床使用中均发现生肌玉红膏具有减轻瘢痕的作用。
目的：进一步验证生肌玉红膏对增生性瘢痕的作用。
方法：36只日本大耳白兔，每只兔耳造4个直径1 cm圆形全层皮肤和软骨膜缺损创面，共288个创面随机分为6组，分别为模型组，基质组(不含生药)，生肌玉红膏低浓度组(生药浓度为8.39%)，中浓度组(生药浓度为25.18%)，高浓度组(生药浓度为75.54%)和重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用溶液阳性对照组。造模后除模型组不予处理外，其余分别给予相应药物涂抹或喷于整个创面，2次/d，直至创面愈合。造模后20，30 d根据温哥华瘢痕量表进行评分；瘢痕标本在显微镜40倍下测量并计算瘢痕增生指数，荧光定量PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原、结缔组织生长因子、纤连蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的mRNA表达，Western bloting检测Ⅰ、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达，免疫荧光染色检测α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达。
结果与结论：①各组的温哥华瘢痕量表评分和瘢痕增生指数均于30 d显著上升(P < 0.05)。与模型组比较，中、高浓度组和阳性对照组温哥华瘢痕量表评分和瘢痕增生指数显著改善(P < 0.05，P < 0.01)，并显著低于基质组和低浓度组(P < 0.05，P < 0.01)；②中浓度组和阳性对照组均显著抑制α-平滑肌肌动蛋白和Ⅰ、Ⅲ型胶原、结缔组织生长因子和纤连蛋白的mRNA表达，及α-平滑肌肌动蛋白和Ⅰ、Ⅲ型胶原的蛋白表达(P < 0.01)；③结果表明，生肌玉红膏可抑制肌成纤维细胞增殖，减少胶原沉积，从而减轻瘢痕增生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-6385-6285(孙桂芳)

关键词: 组织构建, 组织工程, 生肌玉红膏, 增生性瘢痕, 肌成纤维细胞增殖, 胶原沉积

Abstract:

BACKGROUND: Shengjiyuhong ointment has been reported to inhibit hypertrophic scarring.
OBJECTIVE: To verify the effects of Shengjiyuhong ointment on hypertrophic scarring of in a rabbit ear model.
METHODS: Each ear of thirty-six Japanese rabbits was used to make four 1-cm-diameter circular full-thickness skin wounds with the entire perichondrium removed. Finally, 288 wounds were made and randomly divided into 6 groups: model, negative control (no drugs were administered), low-, moderate-, high-crude herbal dose drugs (Shengjiyuhong ointment was administered topically at concentrations of 8.39%, 25.18%, and 75.54%), and positive control (recombinant bovine basic fibroblast growth factor was administered topically). Shengjiyuhong ointment was administered twice daily till wound healing. The wounds were evaluated by the Vancouver scar scale (VSS). Scar elevation index (SEI) of scar specimens was calculated under a microscope at 40× magnification. mRNA expression levels of type I and III collagen, connective tissue growth factor, fibronectin, and α-smooth muscle actin (α-SMA) were determined by fluorescent quantitative PCR. Protein expression levels of type I and III collagen and α-SMA were detected by western blot assay. α-SMA immunoreactivity was determined by immunofluorescent staining.
RESULTS AND CONCLUSION: VSS scores and SEI were significantly increased in each group at 30 days (P < 0.05). VSS scores and SEI were significantly decreased in the moderate- and high-crude herbal dose drug groups and positive control groups compared with the model, negative control, and low-crude herbal dose drug groups (P < 0.05 or P < 0.01). mRNA expression levels of type I and III collagen, connective tissue growth factor and fibronectin, and protein expression levels of type I and III collagen and α-SMA were significantly inhibited after moderate-crude herbal dose Shengjiyuhong ointment and positive drug treatment (P < 0.01). These findings suggest that Shengjiyuhong ointment can reduce hypertrophic scars by inhibiting fibroblast proliferation and collagen deposition.

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Key words: Drugs, Chinese Herbal, Cicatrix, Collagen Type I, Collagen Type III

中图分类号:

R318

孙桂芳，张晓芬，李红昌，潘丽芸，陈亚峰，徐可，奉典旭. 生肌玉红膏对增生性瘢痕的抑制作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(33): 4890-4898.

Sun Gui-fang, Zhang Xiao-fen, Li Hong-chang, Pan Li-yun, Chen Ya-feng, Xu Ke, Feng Dian-xu. Shengjiyuhong ointment inhibits hypertrophic scar formation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(33): 4890-4898.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析实验选用白兔36只，分为6组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 对瘢痕的温哥华瘢痕量表评分的影响同一组内，与20 d相比较，各组30 d温哥华瘢痕量表评分均显著升高(P < 0.01)。同一时间内，与模型组相比较，基质组和低浓度组均无显著差异(P > 0.05)，中、高浓度组和阳性对照组均显著降低(P < 0.01，P < 0.001)；与基质组比较，生肌玉红膏低浓度组无显著变化(20 d：P=0.885，30 d：P=0.940)，中、高浓度组及阳性对照组均显著降低(P < 0.01，P < 0.001)；生肌玉红膏各浓度组相比较，温哥华瘢痕量表评分随浓度升高逐渐降低，中、高浓度组均较低浓度组(P < 0.01，P < 0.001)，但中、高浓度组相比较无显著差异(20 d：P=0.083，30 d：P=0.118)；与阳性对照组相比较，生肌玉红膏低浓度组显著升高(P < 0.001)，中、高浓度组均无显著差异(20 d：中浓度P=0.061，高浓度组P=0.885；30 d：中浓度组P=0.087，高浓度组P=0.881)。表明生肌玉红膏低浓度组无效，中、高浓度组和阳性对照组均具有显著的改善温哥华瘢痕量表评分疗效，中、高浓度组无显著差异，且与阳性对照组无显著差异，见表2。

2.3 对兔耳瘢痕增生的影响

2.3.1 对瘢痕增生指数的影响同一组内，30 d与20 d相比较，各组瘢痕增生指数均显著升高(P < 0.05，P < 0.01)，表明兔耳瘢痕在30 d内处于增生期，生肌玉红膏对时间延长引起的增生无影响。同一时间内，与模型组相比较，基质组和低浓度组均无显著差异(20 d：基质组P=0.526，低浓度组P=0.241；30 d：基质组P=0.566，低浓度组P=0.243)，中、高浓度组和阳性对照组均显著降低(P < 0.01，P < 0.001)；与基质组比较，生肌玉红膏低浓度组无显著变化(20 d：P=0.589，30 d：P=0.551)，中、高浓度组显著降低(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)；生肌玉红膏各浓度组相比较，瘢痕增生指数随浓度升高逐渐降低，中、高浓度组均较低浓度组显著降低(P < 0.05，P < 0.01)，但中、高浓度组相比较无显著差异(20 d：P=0.187，30 d：P=0.195)；与阳性对照组相比较，低浓度组显著升高(P < 0.001)，中、高浓度组均无显著差异(20 d：中浓度组P=0.082，高浓度组P=0.670；30 d：中浓度组P=0.073，高浓度组P=0.614)。表明生肌玉红膏低浓度组无效，中、高浓度组和阳性对照组均具有显著的改善瘢痕增生指数疗效，中、高浓度组无显著差异，且与阳性对照组无显著差异，见表3。

2.3.2 对瘢痕肌成纤维细胞增殖和转分化的影响同一组内，与20 d相比较，各组α-平滑肌肌动蛋白的mRNA表达30 d均显著升高(P < 0.001)，模型组、基质组和中浓度组30 d的α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达亦显著升高(P < 0.01，P < 0.001)，而阳性对照组无显著差异(P=0.051)。同一时间内，与模型组比较，基质组mRNA和蛋白表达无显著下降(mRNA 20 d：P=0.094，30 d：P=0.085；蛋白20 d：P=0.859，30 d：P=0.727)，中浓度组和阳性对照组的α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达均显著下降(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)；与基质组相比，中浓度组亦显著下降(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)；与阳性对照组比较，中浓度组无显著差异 (mRNA：20 d：P=0.220，30 d：P=0.337；蛋白：20 d：P=0.572，30 d：P=0.229)，表明生肌玉红膏显著抑制

了瘢痕成纤维细胞的增殖，见图1、表4和图2。

2.4 对细胞外基质沉积的影响

2.4.1 对细胞外基质mRNA表达的影响生肌玉红膏显著减少了细胞外基质的mRNA表达。同一组内，与20 d相比较，各组30 d细胞外基质的 mRNA表达均显著升高(P < 0.01，P < 0.001)，表明兔耳瘢痕于30 d内处于增生期，细胞外基质沉积增多，生肌玉红膏和贝复济对时间延长引起的细胞外基质沉积增多均无效。同一时间内，与模型组相比，基质组无显著变化(Ⅰ型胶原20 d： P，30 d：P =0.193； Ⅲ型胶原20 d：P=0.240， 30 d：P=0.427；结缔组织生长因子20 d：P=0.544，30 d：P=0.120；纤连蛋白20 d：P=0.076，30 d：P= =0.225

0.154)，中浓度组和阳性对照组20 d和30 d均极显著地降低了Ⅰ、Ⅲ型胶原，结缔组织生长因子和纤连蛋白的mRNA表达(P < 0.001)。与基质组相比，中浓度组20 d和30 d均显著下调了Ⅰ、Ⅲ型胶原，结缔组织生长因子和纤连蛋白的mRNA表达(P<0.001)。与阳性对照组相比，中浓度组20 d和30 d Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA表达无显著差异(Ⅰ型胶原20 d：P=0.160，30 d：P=0.201； Ⅲ型胶原20 d：P=0.055，30 d：P=0.343)，但结缔组织生长因子和纤连蛋白的mRNA表达均极显著升高(P < 0.001)，见表5。

2.4.2 对胶原蛋白表达的影响同一组内，与20 d相比较，各组30 d胶原蛋白表达均显著升高(P < 0.05，P < 0.01)，表明兔耳瘢痕于30 d内处于增生期，生肌玉红膏

和贝复济对时间延长引起的胶原沉积增多均无效。同一时间内，与模型组相比，基质组胶原的蛋白表达均无显著差异(Ⅰ型胶原 20 d：P=0.887，30 d：P=0.341； Ⅲ型胶原20 d：P=0.952，30 d：P=0.693)，中浓度组和阳性对照组均显著降低了Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白表达(P < 0.01，P < 0.001)；与基质组相比，中浓度组胶原蛋白表达显著下降(P < 0.01，P < 0.001)；与阳性对照组相比，中浓度组均无显著差异(Ⅰ型胶原 20 d：P=0.970，30 d：P=0.729；Ⅲ型胶原20 d：P=0.558，30 d：P=0.642)，表明生肌玉红膏显著减少了Ⅰ、Ⅲ型胶原的蛋白表达。见图3和表6。

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引言

临床上增生性瘢痕几乎均继发于深达真皮网状层的皮肤损伤，如皮肤外伤或Ⅱ-Ⅲ度烧伤^[1]。在创面愈合过程中，正常成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化，α-平滑肌肌动蛋白作为肌成纤维细胞的标志性蛋白，显著增加了细胞和胶原晶格的收缩力，同时肌成纤维细胞可分泌大量的胶原，尤其是Ⅰ、Ⅲ型胶原，可加速创面愈合，促进创面重塑^[2-3]，该过程主要受转化生长因子β1/ Smads信号通路调节^[4]。如果创伤愈合后肌成纤维细胞不能通过凋亡机制消失，而是在转化生长因子β1/Smads信号通路的刺激下过度增殖，导致α-平滑肌肌动蛋白表达过多，并合成过多胶原，则使愈合后的组织过度挛缩，胶原过度沉积，从而导致增生性瘢痕形成^[5-6]。不仅影响容貌，还影响器官和组织功能，给患者带来巨大的身心痛苦^[7]。目前治疗增生性瘢痕的手段多是在形成后才开始干预，效果不甚理想^[8]。由于增生性瘢痕与创面修复过程密不可分^[2]，因此作者的研究拟从创伤修复的药物中筛选疗效佳者于创伤阶段即进行药物干预，观察它对增生性瘢痕的效果，并探索其机制。

生肌玉红膏方源自《外科正宗》，该方在原书中被称为“外科收敛药中之神药”，被《医宗金鉴》称为“生肌神药”，一直为中医外科、伤科所推崇。临床广泛应用于慢性溃疡、糖尿病足、外科术后、及烧烫伤等的创面愈合^[9-14]，且文献研究和作者临床使用中均发现生肌玉红膏具有减轻瘢痕的作用^[15-16]。中医认为瘢痕病机主要有腠理肌肤损伤，经络受阻，营卫失调，气血凝结，痰浊瘀互结所致，治疗以清热凉血，行气活血化瘀，软坚散结，利湿排浊。生肌玉红膏主要成分为当归、紫草、血竭、白芷、轻粉、白腊、甘草。方中重用当归养血活血、散滞生肌；紫草凉血活血，除湿敛疮，解毒生肌；血竭散瘀和血，生肌合疮；白芷行气散血，除湿消肿；上述诸药合用，可奏清热凉血，行气活血化瘀，利湿排浊，消肿散结之功效，正合瘢痕之治疗大法^[17]。实验研究发现当归具有减轻兔耳增生性瘢痕的作用，当归挥发油抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成，促进细胞凋亡^[18]。紫草色素可通过抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖、抑制血管内皮生长因子亚型的表达，血管增生及转化生长因子的阳性表达，从而抑制兔耳增生性瘢痕^[19-20]。紫草油提取物可抑制损伤后的炎症反应，从而促进创伤愈合，防止瘢痕形成^[21]。血竭素B可通过抑制成纤维细胞转分化和胶原产生，并抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖，收缩及胶原沉积，从而减轻兔耳增生性瘢痕^[22]。白芷具有活血消肿，生肌止痛之功效，广泛应用于各种治疗瘢痕的复方中，虽机制不明，但疗效显著^[17^，^23]。

为探索生肌玉红膏对增生性瘢痕的作用，研究采用日本大耳白兔耳部增生性瘢痕动物模型，于创伤后局部应用生肌玉红膏至创面愈合，采用大体观察、显微镜下测量、免疫荧光法、荧光定量PCR及Western bloting等观察生肌玉红膏对瘢痕增生及胶原沉积的作用，旨在探索生肌玉红膏是否具有抑制瘢痕增生的作用，为扩大生肌玉红膏的应用范围提供依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计动物实验观察。

1.2 时间及地点实验于2014年8月至2015年2月在上海市普陀区中心医院动物实验室和中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 药物生肌玉红膏原方由白芷15 g，甘草36 g，当归60 g，血竭12 g，轻粉12 g，紫草6 g，白蜡60 g，麻油500 g组成，其中白蜡和麻油为药物的基质部分，其余为生药，生药浓度的计算公式为：生药的总量(g)/基质(g)×100%。原方即为中浓度组，其生药浓度为25.18%；低浓度组为1/3生药/基质，浓度为8.39%；高浓度组为3倍生药/基质，浓度为75.54%，基质组仅由白蜡60 g，麻油500 g组成，药物均购自黄山市华氏医药有限公司，由安徽省亳州市永刚中药饮片厂生产，严格按照《外科正宗》方法熬制。阳性对照药物重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用溶液(商品名贝复济，珠海亿胜生物制药有限公司，产品批号20150304)，4 ℃保存备用。

1.3.2 实验动物 36只日本大耳白兔，清洁级，雌雄各半，体质量2.0-2.5 kg，由上海市普陀区中心医院动物实验中心提供，合格证号2007001103887。

1.3.3 试剂及仪器

生肌玉红膏对兔耳增生性瘢痕的抑制实验试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
兔多克隆Ⅰ型胶原抗体(货号ab34710)、兔多克隆Ⅲ型胶原抗体(货号ab7778)、兔多克隆抗体Ki-67(货号ab15580)	美国abcam，
鼠单克隆抗体α-SMA(货号A5228)	美国Sigma
TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(货号9767)、PrimeScript^TM RT Master Mix (Perfect Real Time)(货号RR036A)、SYBR^® Premix Ex Taqt^TM(Tli RNaseH Plus)(货号RR420A)	日本TaKaRa
PCR引物	上海生工生物技术有限公司合成
酶标仪680	Bio-Rad公司，美国
PCR基因扩增仪(9600)	Perkin Elmer公司，美国
Real Time PCR扩增仪(Vii ATM7型)	Aplied Biosystems公司
酶标仪680	BIO-RAD公司，美国
Centrifuge5810R 4 ℃离心机	Eppendorf公司，美国
LSM880激光共聚焦显微镜	ZEISS公司，德国

1.3.4 引物序列

引物序列：
兔Ⅰ型胶原	上游5’-CCA GGC CCC TCT GGT ATT A-3’，下游5’-Reverse- GAA GCC CTT CTT TAC CAG CA-3’；
兔Ⅲ型胶原	上游5’- CAG GGT GCA GTT GGT AGT CC-3’，下游5’- GCC ACT AGG TCC AAC AGG TC-3’；
兔α-平滑肌肌动蛋白	上游5’- AAG TAC CCG ATC GAA CAT GG-3’，下游5’- AGT GGT GCC AGA TCT TTT CC-3’；
兔结缔组织生长因子	上游5’- CGA AGC TGA CCT GGA AGA GA-3’，下游5’- GAT TTT GGG GGT ACG GAT G-3’；
兔纤连蛋白	上游5’- TGG GAG CGC ACC TAC CTA-3’，下游5’- ACC TCG GCT CCC TCC ATA-3’；
兔 GAPDH 引物	上游5’- GAA CGG GAA GCT GGT CAT C-3’，下游5’-TTG ATG TTG GCG GGA TCT-3’^[7]。

1.4 实验方法

1.4.1 动物造模与分组处理依据Morris等^[24]的增生性瘢痕动物模型造模方法并加以改进，避开大血管，于每只兔耳朵腹侧面去掉全层皮肤及软骨膜，做4个直径 1 cm的圆形创面，2个创面之间距离2 cm，每只白兔共有8个创面，36只白兔共288个创面，以兔耳为单位，72只兔耳按照随机数字表法，分为模型组，基质组(不含生药)，生肌玉红膏低浓度组(生药浓度为8.39%)，中浓度组(生药浓度为25.18%)，高浓度组(生药浓度为

75.54%)和阳性对照组(重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用溶液阳性对照)。术后常规止血，模型组不予处理，基质组和生肌玉红膏各浓度组每个创面每次0.2 mg/ 0.785 cm²，涂于创伤局部，并予按摩10 min以促进药物吸收；重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用溶液 262.5 IU/cm²，喷于创面。每日早晚各1次，连续用药14 d。造模后20 d和30 d每组各取24个愈合后的组织进行检测。

1.4.2 温哥华瘢痕量表评分和瘢痕增生指数^[1] 温哥华瘢痕量表评分从瘢痕的色泽、厚度、血管分布和质地等4个指标对瘢痕进行评价，评价标准见表1。

表1 温哥华瘢痕量表评分

Table 1 Vancouver scar scale scores

参数	内容	分值(分)
血管分布	瘢痕红润程度与正常皮肤近似	0
	肤色偏粉红	1
	肤色偏红	2
	肤色呈紫色	3
色泽	正常	0
	色素减退	1
	色素沉着	2
柔软度	正常	0
	柔软(最小压力能使皮肤变形)	1
	柔顺(在压力下能变形)	2
	质硬(呈块状不能变形，有对抗阻力)	3
	弯曲(呈绳状，伸展时会退缩)	4
	挛缩(永久性短缩导致残废与畸形)	5
厚度	正常 < 2 mm 2-5 mm > 5 mm	0 1 2 3
总分		13

表注：量表总分13分，评分越高表示瘢痕越严重。

瘢痕增生指数用来评价瘢痕增生的严重程度，是指在40倍显微镜下，采用ImageJ软件测量由瘢痕顶点至瘢痕底部与软骨交界处的距离，与周围正常皮肤厚度之比，瘢痕增生指数=1表示无增生，瘢痕增生指数 >1表示瘢痕增生，值越大，表明增生越严重^[25]。

1.4.3 免疫荧光染色切取兔耳瘢痕组织，40 g/L多聚甲醛固定后，用石蜡包埋并切成5 μm的切片。对切片进行脱蜡、脱水及抗原修复^[22]。然后室温下用Ki-67兔多克隆抗体和α-SMA小鼠单克隆抗体对切片进行孵育过夜^[22]，第2天用抗兔红色荧光二抗和抗小鼠绿色荧光二抗37 ℃孵育1h，DAPI进行核染色，抗荧光淬灭封片剂封固，激光共聚焦进行图像观察。

1.4.4 Western blotting 实验方法参照文献所述^[22]。将组织剪切为细小碎片，加入裂解液，于匀浆机研磨至组织块消失。收集蛋白，测定蛋白浓度。100 µL蛋白加入等体积 5×上样缓冲液，于恒温水浴箱中 100 ℃加热5 min使之变性，12 000 r/min离心。10%SDS-PAGE凝胶电泳后，进行转膜，封闭，洗膜，加一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h。DAB显色，暗室中用X胶片感光、显影、定影。GAPDH蛋白表达作为内参。采用IPP6.0软件对蛋白电泳带灰度值进行检测，以目标蛋白灰度值与GAPDH条带灰度值比值表示目标蛋白的相对表达量，再对比值进行比较。

1.4.5 荧光定量PCR 兔瘢痕组织的mRNA的提取和纯化依据Takara MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒说明书进行。反转录依据Takara Prime Script^TM RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒进行，反应体系为10 μL：5×Prime Script RT Master Mix(Perfect Real Time)2 μL，Total RNA(10 μL体系最大容纳500 ng total RNA)，RNase Free dH₂O补足至 10 μL。反应条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃。荧光定量PCR用以检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA变化，采用Takara SYBR^®Premix Ex Taq^TM(Tli RNaseH Plus)试剂盒，反应体系为20 μL：SYBR^®Premix Ex Taq 10 μL，PCR上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，DNA模板2 μL，dH₂O 6.8 μL。反应条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共45个循环。GAPDH的基因表达作为内参。

1.5 主要观察指标瘢痕外观的大体观察，瘢痕增生指数的测量和计算，α-平滑肌肌动蛋白 mRNA和蛋白的表达，Ki-67和α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光，Ⅰ、Ⅲ型胶原、结缔组织生长因子和纤连蛋白的mRNA表达，及Ⅰ、Ⅲ型胶原的蛋白表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件，实验数据采用x(_)±s表示，符合正态分布和方差齐性的数据，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD检验，两组间比较采用独立样本t 检验；不检验符合正态分布或方差齐性的数据，多组间比较采用Kruskal-Wallis H 检验，两组间比较P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

增生性瘢痕以表达α-平滑肌肌动蛋白的肌成纤维细胞的过度增殖和细胞外基质尤其是胶原的过度沉积为特征^[26]。正常的创面愈合，肌成纤维细胞至重塑期通过凋亡机制消失^[5]，α-平滑肌肌动蛋白表达下降。但病理性的愈合时，肌成纤维细胞持续存在，α-平滑肌肌动蛋白表达持续升高，伴随创伤区域高水平的机械应力，导致组织过度挛缩，分泌细胞外基质如：Ⅰ、Ⅲ型胶原，结缔组织生长因子和纤连蛋白等，在纤维化疾病中发挥至关重要的作用，被公认为病理性纤维化的始动因素^[27]，因此抑制α-平滑肌肌动蛋白的过度增殖和细胞外基质沉积是减轻瘢痕的重要机制。

中医认为本病与先天禀赋，素体特异有关，加之遭受金创、水火，余毒未尽，而致气滞血瘀，与经络搏结而成。病机主要有腠理肌肤损伤，经络受阻，营卫失调，气血凝结，痰浊瘀互结所致，治疗以清热凉血，行气活血化瘀，软坚散结，利湿排浊。生肌玉红膏方源自《外科正宗》，其主要成分当归、紫草、血竭、轻粉、白腊、白芷、甘草。方中重用当归养血活血、散滞生肌；紫草凉血活血，除湿敛疮，解毒生肌；血竭散瘀和血，生肌合疮；白芷行气散血，除湿消肿；上述诸药合用，可奏清热凉血，行气活血化瘀，利湿排浊，消肿散结之功效，正合瘢痕之治疗大法。研究表明当归可减轻兔耳增生性瘢痕，临床可用于预防瘢痕增生和瘢痕疙瘩。当归挥发油抑制成纤维细胞的增殖和胶原合成^[18^，^28]。紫草色素可减轻兔耳增生性瘢痕，紫草油提物可抑制小鼠瘢痕，紫草素可抑制瘢痕组织微血管的形成、血管内皮生长因子亚型的表达及瘢痕增生，临床常用于皮肤烧烫伤，促进创伤愈合^[19-21]。血竭素B可促进创伤愈合，通过下调转化生长因子β1/Smads信号通路减轻兔耳增生性瘢痕，并抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原沉积，临床可用于烧伤创面的治疗^[22]。

朱桂英等^[29]结合兔耳不同部位的解剖特点，在距离兔耳尖部3-6 cm及内外侧缘各1.5 cm的部位进行瘢痕造模，发现瘢痕于创伤后13-26 d开始上皮化，并出现瘢痕增生，瘢痕与创面上皮化后15-20 d达到高峰，创面愈合后2个月瘢痕周边颜色逐渐变浅，仍然较硬，瘢痕中央隆起仍较明显，以后瘢痕逐渐消退。

研究采用朱桂英等^[29]的造模方法，发现各组温哥华瘢痕量表评分和瘢痕增生指数均于30 d显著上升。与模型组比较，基质组均无显著改善，表明基质无效。与基质组温哥华瘢痕量表评分评分和瘢痕增生指数相比，生肌玉红膏低浓度组均无显著差异，而中高浓度组差异均较显著，但中高浓度组相比无显著差异，表明生药成分发挥减轻瘢痕的作用，但低浓度组生药含量过低，因此作用不显著。鉴于此，在分子生物学实验中选择中浓度组标本进行检测。而中、高浓度组相比无显著差异可能是因为该方轻粉中含有汞离子，高浓度组的汞含量更高，对皮肤有一定的刺激作用所致^[11^，^30]。阳性对照组20 d与30 d α-平滑肌肌动蛋白的mRNA表达差异显著，而蛋白表达无显著差异，可能是因为贝复济显著增加了基质金属蛋白酶1的表达，降低了基质金属蛋白酶组织抑制剂1的表达所致。前者可降解细胞外基质，后者作用相反抑制降解^[25]，表明瘢痕处于增生期，除贝复济对由时间延长引起的肌成纤维细胞增殖和转分化有效外，其余各组均无效。其余各组所有指标均于30 d显著升高，表明瘢痕处于增生期，而生肌玉红膏和贝复济均未抑制增生趋势。中浓度组和阳性对照组均显著抑制了α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ、Ⅲ型胶原，结缔组织生长因子和纤连蛋白的mRNA表达，及α-平滑肌肌动蛋白和Ⅰ、Ⅲ型胶原的蛋白表达，表明生肌玉红膏可显著抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化及增殖，并抑制肌成纤维细胞分泌过多细胞外基质，可能是其减轻瘢痕增生的部分机制。

临床除慢性溃疡性创面外，多数创面虽未经用药即可自愈，但愈合后的瘢痕增生，由于外观丑陋，给患者带来极的心理困扰^[31]，因此预防及减轻瘢痕增生具有十分积极的意义。创面愈合的质量影响瘢痕形成的严重程度，生肌玉红膏作为中国历史悠久的促进创面愈合的验方，在促进愈合的同时，具有抑制瘢痕增生的效果，显著提高了该药在临床的使用价值。转化生长因子β1/ Smads作为增生性瘢痕重要的信号通路^[7，32]，是否介导了生肌玉红膏抑制瘢痕作用的发挥，尚有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

生肌玉红膏对增生性瘢痕的抑制作用

Shengjiyuhong ointment inhibits hypertrophic scar formation

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