静压力对脂肪干细胞与静电纺丝纳米纤维细胞相容性的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.30.008

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (30): 4463-4468.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.30.008

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静压力对脂肪干细胞与静电纺丝纳米纤维细胞相容性的影响

陈亮¹，白轶²，刘凯³，张伟⁴

¹华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科，湖北省武汉市 430030；²武汉大学口腔医学院口腔医院种植科，湖北省武汉市 430079；³武汉理工大学材料科学与工程学院，湖北省武汉市 430070；⁴武汉市中心医院泌尿外科，湖北省武汉市 430014

收稿日期:2016-05-05 出版日期:2016-07-15 发布日期:2016-07-15
通讯作者: 张伟，武汉市中心医院泌尿外科，湖北省武汉市 430014
作者简介:陈亮，男，1979年生，湖北省武汉市人，汉族，2011年华中科技大学毕业，博士，主要从事组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年基金(31400837)；华中科技大学自主创新基金(2013)；华中科技大学同济医学院附属同济医院科学研究基金(2012)

Effects of static pressure on the cytocompatibility of adipose-derived stem cells on electrospun nanofibers

Chen Liang¹, Bai Yi², Liu Kai³, Zhang Wei⁴

¹Department of Urology, Tongji Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China; ²Departmant of Oral Implantology. Hospital and School of Stomatology of Wuhan University, Wuhan 430079, Hubei Province, China; ³School of Materials Science and Engineering of Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, Hubei Province, China; ⁴Department of Urology, Central Hospital of Wuhan, Wuhan 430014, Hubei Province, China

Received:2016-05-05 Online:2016-07-15 Published:2016-07-15
Contact: Zhang Wei, Department of Urology, Central Hospital of Wuhan, Wuhan 430014, Hubei Province, China
About author:Chen Liang, M.D., Department of Urology, Tongji Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China for the Youth, No. 31400837; the Independent Innovation Foundation of Huazhong University of Science and Technology, No. 2013; the Research Foundation of Affiliated Tongji Hospital of Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, No. 2012

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
静电纺丝：是一种特殊的纤维制造工艺，聚合物溶液或熔体在强电场中进行喷射纺丝。在电场作用下，针头处的液滴会由球形变为圆锥形(即“泰勒锥”)，并从圆锥尖端延展得到纤维细丝。这种方式可以生产出纳米级直径的聚合物细丝。
静压力：文中特指流体静压力，是指处于相对静止状态下的流体，由于本身的重力或其他外力的作用，在流体内部及流体与容器壁面之间存在着垂直于接触面的作用力。静压力可分表面力及质量力两项：①表面力：外界，如大气、活塞或密闭容器的器壁，施加在流体表面的压力；②质量力：流体受重力作用产生的压力，此力与流体的高度成正比。

背景：静电纺丝聚乳酸/聚己内酯纳米纤维是课题组自行合成的生物可降解材料，前期研究表明该材料生物相容性优越，但缺乏对该材料力学方面的研究。
目的：研究静压力对脂肪干细胞与静电纺丝聚乳酸/聚己内酯纳米纤维支架细胞相容性的影响。
方法：将脂肪干细胞接种到由聚乳酸和聚己内酯合成的静电纺丝纳米纤维支架上，置于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM低糖培养基中培养。利用静压力装置分别对培养板持续加载0，15，30，45 kPa的静压力，加载时间为4 h。采用MTT法、活死细胞染色检测脂肪干细胞在静电纺丝纳米纤维支架上的增殖、黏附和活性，评价脂肪干细胞与静电纺丝纳米纤维的细胞相容性。
结果与结论：①在体外培养条件下，经不同静压力持续加载4 h后，MTT法增殖检测得出的各组吸光度值经单因素方差分析差异存在显著性意义。在0-30 kPa压力范围内，吸光度值随静压力的增加而增加，到45 kPa时，吸光度值反而下降。各组间多重比较显示差异均有显著性意义；②用MTT法进一步检测细胞黏附百分率，各组间差异亦有显著性意义；③活死细胞染色结果印证了上述结果，统计分析表明，无论是单因素方差分析还是各组间配对t检验，4组间活细胞百分率的差异均有非常显著性意义；④适当大小的静压力可促进脂肪干细胞与静电纺丝纳米纤维的生物相容性，细胞增殖、黏附及活性有所提高，但过高的静压力会抑制细胞的生物学行为，从而影响脂肪干细胞与静电纺丝纳米纤维的相容性。
ORCID: 0000-0001-9720-7099(陈亮)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 纳米材料, 静压力, 脂肪干细胞, 静电纺丝, 纳米纤维, 增殖, 黏附, 细胞活性, 细胞相容性, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Electrospun polylactic acid/polycaprolactone nanofibers (ENF) are a kind of self-synthesized biodegradable material. Our preliminary studies have indicated that the biomaterial exhibits excellent biocompatibility; however, the research about its mechanics is still little.
OBJECTIVE: To explore the effects of static pressure on the cytocompatibility of adipose-derived stem cells on the ENF scaffold.
METHODS: Adipose-derived stem cells were seeded onto the ENF scaffold, and then cultured in the low-glucose DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum. The mixed constructs were submitted to the static pressure at 0, 15, 30, and 45 kPa for 4 hours using a static pressure device, respectively. Subsequently, the proliferation, adhesion and viability of adipose-derived stem cells on the ENF scaffold were detected using MTT assay and living/dead staining to evaluate the cytocompatibility.
RESULTS AND CONCLUSION: MTT assay showed that there were significant differences in absorbance values among groups by one-way analysis of variance after 4 hours of loading with different static pressures in vitro. Under 0-30 kPa static pressure, the absorbance values increased with static pressure, but the absorbance values declined until the pressure reached 45 kPa, and multiple comparisons between groups showed significant difference. The significant differences in the cell attachment percentage by MTT assay could be found among groups. The living/dead staining results supported the above findings. Furthermore, the significant differences in percentage of living cells among groups were shown using either one-way analysis of variance or paired t test. In conclusion, the appropriate static pressure can promote the cytocompatibility, proliferation, adhesion and viability of adipose-derived stem cells on the ENF scaffold. But the excessive pressure is likely to inhibit the cellular biological behaviors, thus affecting cytocompatibility of adipose-derived stem cells with the ENF scaffold.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Adipose Tissue, Stem Cells, Nanofibers, Pressure, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

陈亮，白轶，刘凯，张伟. 静压力对脂肪干细胞与静电纺丝纳米纤维细胞相容性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(30): 4463-4468.

Chen Liang, Bai Yi, Liu Kai, Zhang Wei. Effects of static pressure on the cytocompatibility of adipose-derived stem cells on electrospun nanofibers[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(30): 4463-4468.

图/表（结果） 4

2.1 静压力对脂肪干细胞在静电纺丝纳米纤维上增殖的影响表1列出了MTT法检测各组培养板的吸光度值。应用单因素方差分析比较，差异有非常显著性意义(F=21.55，P < 0.01)。在0-30 kPa压力范围内，吸光度值从0 kPa组的0.699±0.006 (A₀)，增加到15 kPa组的0.720±0.007(A₁₅)，至30 kPa组达到最高值0.769±0.024(A₃₀)。压力至45 kPa时，吸光度值略减少至0.725±0.017(A₄₅)。组间多重比较结果：A₀ vs A₁₅，差异有显著性意义(P < 0.05)，A₁₅ vs A₃₀及A₃₀ vs A₄₅，差异有非常显著性意义(P < 0.01)，而A₁₅ vs A₄₅，差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.2 静压力对脂肪干细胞在静电纺丝纳米纤维上黏附的影响表2列出了各组脂肪干细胞在静电纺丝纳米纤维上的黏附率。经静压力作用后，各组间单因素方差分析差异有非常显著性意义(F=55.44，P < 0.01)。进一步组间多重比较，0 kPa组与15 kPa组差异有显著性意义(P < 0.05)，15 kPa组和30 kPa组黏附率差异也有显著性意义(P < 0.05)，其他组间比较结果均为差异有非常显著性意义(P < 0.01)。

2.3 静压力对脂肪干细胞在静电纺丝纳米纤维上细胞活性的影响图3展示了活死细胞染色结果，并依据染色成像计算各组活细胞百分率(表3)。由图所见，活细胞被染成蓝色，死细胞被染成红色，同时也见到静电纺丝纳米纤维被染成蓝色。结果指定圆形为细胞，而蓝染的纤维排除在计数之外。统计分析表明，4组间活细胞百分率差异有非常显著性意义(F=117.58，P < 0.01)。组间多重比较各组差异均非常显著性意义(P < 0.01)，45 kPa组活细胞百分率最低，甚至低于0 kPa组(P < 0.01)。

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引言

材料方法

1.1 设计分组对照观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年1至6月在武汉大学口腔医院教育部口腔生物医学工程重点实验室完成。

1.3 材料聚乳酸(PLLA，M_w=100 000)(深圳光华伟业)；聚己内酯(PCL，M_w=1 000)(Slovery)；DMEM低糖培养基(Gibco)；胰酶(Invitrogen)；胎牛血清(Hyclone)；MTT细胞增殖及毒性试剂盒、Hoechst 33342、碘化丙啶(碧云天生物技术研究所)；塑料细胞培养瓶(Corning)；6孔细胞培养板(Costar)；静压力生物反应容器(自制)；恒温CO₂细胞培养箱、MK3型酶标仪(Thermo Fisher)；台式离心机(上海安亭飞鸽)；FV 500型共聚焦激光扫描显微镜(Olympus)。

1.4 实验方法

1.4.1 支架制备静电纺丝聚乳酸/聚己内酯共混纳米纤维支架由武汉理工大学材料科学与工程学院制备(图1)。经前期研究证实，聚乳酸和聚己内酯按1︰1质量比混合制备的支架生物相容性最佳^[5]，用于以下实验。

1.4.2 细胞培养种子细胞采用课题组储备的脂肪干细胞^[5]，经人脂肪组织提取，在体外分离、培养、纯化后，第3代冻存。冻存细胞经复苏后，用含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬，置于37 ℃，体积分数为5% CO₂恒温培养箱中培养，体外扩增传代1次后用于以下实验。

1.4.3 细胞接种将静电纺丝纳米纤维裁剪成2 cm× 2 cm的方形小片，经真空干燥过夜后，放入无菌操作台中。将静电纺丝纳米纤维置入体积分数为75%乙醇中浸泡1 h，PBS漂洗10 s ×3次，眼科镊小心将静电纺丝纳米纤维小片平铺于6孔细胞培养板孔底。

培养瓶中的脂肪干细胞经0.25%胰酶/0.05% EDTA消化，再经离心、重悬后，制成细胞浓度为5×10⁸ L^-1的细胞悬液，加入到预先铺有静电纺丝纳米纤维的6孔板小孔中，每孔加1.5 mL细胞悬液。同法共制备12块培养板，分成4个组，置入37 ℃、体积分数为5% CO₂条件下培养。

1.4.4 静压力加载待细胞进入对数增长期时，更换培养液，加入等量新鲜培养液，将培养板置入装有静压力加载装置的培养箱(图2)。整个装置密闭在细胞培养箱内，用微型加压泵向装置内加压(体积分数为5% CO₂)，通过气压压强模拟静压力。实验预设静压力分别为0，15，30，45 kPa共4组，其中0 kPa组不加压，但模拟所有步骤，为对照组。各组加载4 h后取出培养板，用于各项实验。

1.4.5 细胞增殖不同静压力作用4 h后，从4组培养板中各取出1块，按MTT细胞增殖及毒性试剂盒说明书操作，570 nm波长下酶标仪检测样品孔、对照孔的吸光度值。

1.4.6 细胞黏附从4组培养板中各取1块6孔板，用PBS漂洗其中3孔，15 s ×3次，转入新培养板并加等量培养基。MTT法检测新旧两块板上各3孔细胞的吸光度值，两者间的比值为细胞黏附百分率。

1.4.7 细胞活性用PBS溶解Hoechst 33342和碘化丙啶，调节二者的工作质量浓度分别为10 mg/L和0.5 g/L。每组各取1板，将静电纺丝纳米纤维在无菌操作台中取出，转至玻片上。室温下用Hoechst 33342和碘化丙啶染色工作液孵育30 min。Hoechst 33342染活细胞(蓝色)，碘化丙啶染死细胞(红色)。在激光共聚焦显微镜下检测、成像。任选3张图片计数活、死细胞数量(N_活、N_死)，计算活细胞百分率，即P_活= N_活/( N_活+ N_死)×100%。

1.5 主要观察指标 ①细胞增殖检测中，代表细胞增殖水平的吸光度值；②细胞黏附测定中，经MTT法检测出的吸光度值计算出细胞黏附百分率；③细胞活性检测中，经活死细胞计数计算活细胞百分率。

1.6 统计学分析计量资料以x(_)±s表示，采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。各组间比较采用单因素方差分析(one way ANOVA)，两两比较采用配对t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

课题组之前的研究已经充分表明，静电纺丝纳米纤维是一种生物相容性优越的聚合物纳米纤维^[4-7]。但体外实验终究替代不了体内实验，体内各种应力条件就是对该材料生物相容性的最大挑战。此研究在对前期各项结果优化之后，选择聚乳酸和聚己内酯比例最佳(1︰1)的静电纺丝纳米纤维作为支架^[5^，^7]，活性最佳部位来源(腹股沟皮下)的脂肪干细胞为种子细胞^[3]，检测细胞材料复合之后在不同静压力作用下的生物相容性，为进一步体内实验奠定基础。

已有较多文献报道，静压力能够调节细胞增殖、黏附及活性，甚至干细胞分化^[11^，^13-14]，这些都是细胞相容性的重要组成部分。另一方面，静压力对纳米纤维也有调控作用，纤维的完整性及表面亲水性能，决定着细胞的增殖与黏附^[10^，¹³^，^15]。

MTT法是检测细胞增殖的常用方法。结果显示，在0-30 kPa范围内，吸光度值随着静压力的增加而增加，但在45 kPa组测得的吸光度值却并没有继续增加，而是减少，这说明过高的静压力可能抑制了细胞的增殖。

同样借助于MTT法检测了细胞黏附率。由于取出了支架并进行了冲洗，45 kPa组的脂肪干细胞黏附率显著降低，其降低的程度明显大于吸光度值降低的幅度。作者分析，检测黏附率时静电纺丝纳米纤维上的细胞经过了漂洗，排除了6孔板上其他细胞的干扰。MTT增殖检测中培养板中的其他细胞也包括在内，可以推测当静压力达到45 kPa时，细胞可能大量死亡。

活死细胞染色提供了一种更为直观的检测方法，而随机选取图像计算活细胞百分率则相对科学地平衡了误差。从活死细胞染色图中同样可以看出脂肪干细胞在静电纺丝纳米纤维上增殖的趋势，随着静压力的增加，从0 kPa组到30 kPa组的细胞数量也增多，活细胞所占的百分率也增加，但在45 kPa组中，细胞数量减少，同时活细胞百分率最低。另外，所有组别中活细胞均占绝大多数，这反映了静电纺丝纳米纤维是一种生物相容性较高的纳米材料。

正常生理范围内的静压力一般不会超过20 kPa，实验所测静压力涵盖了这一范围。但是在某些特定情况下，如牙齿的咬合、骨骼损伤、膀胱逼尿肌收缩等，静压力会显著增加。作者的研究表明，当静压力超过一定范围后，对细胞的调控会有副作用，这与许多类似研究的结论是一致的^[11^，¹³^，^16-19]。

脂肪干细胞是组织工程中应用最为广泛的种子细胞之一^[1-3]。越来越多的研究表明，如果在培养过程中就施加特定的力学作用，会使脂肪干细胞具有更强的适应性，从而更能适应工程化组织的要求^[8-9^，^20-22]。另一方面，支架材料作为种子细胞的载体，也需具有一定的力学性能以达到保护种子细胞、维持细胞表型的作用^[10^，^23-26]。

综上所述，实验验证了静电纺丝纳米纤维具有良好的细胞相容性。下一步将继续研究其他机械力(如流体剪切力)的作用以及体内实验，进一步改进细胞功能和材料的力学性能以构建工程化人体组织。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

静压力对脂肪干细胞与静电纺丝纳米纤维细胞相容性的影响

Effects of static pressure on the cytocompatibility of adipose-derived stem cells on electrospun nanofibers

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