长期有氧运动增加自发性高血压大鼠肾脏内源性硫化氢的生成

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.27.020

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
自发性高血压大鼠：是用一只收缩压持续在150-175 mm Hg的雄性Wistar京都种大鼠与收缩压为130-140 mm Hg的雌性Wistar京都种大鼠进行交配，得到收缩压都> 150 mm Hg的有效子代，再选用血压较高的子代大鼠进行近亲交配，依次进行这种选择性近亲交配20代以此来获得稳定的高血压遗传性，从而建立了自发性高血压大鼠品种，目前该选择手段和路径得到世界相关领域专家学者的高度认可和广泛使用。
硫化氢(H₂S)：H₂S是硫的氢化物中最简单的一种。肾脏中关于H₂S生成的3个酶，分别是胱硫醚β合酶、3-巯基丙酮酸硫基转移酶、胱硫醚γ分解酶，有氧运动可以明显上调胱硫醚γ分解酶的mRNA表达，所以提示有氧运动可以通过上调肾脏中胱硫醚γ分解酶的表达，从而增加内源性H2S的生成，最终有助于改善高血压大鼠的肾脏功能。

摘要
背景：众所周知，长期有氧运动可以改善自发性高血压大鼠的肾脏功能，然而其中的机制尚未被完全阐明。
目的：观察长期有氧运动对自发性高血压大鼠肾脏内源性硫化氢生成的影响。
方法：构建长期有氧运动大鼠模型。实验随机分为4组，即WKY大鼠静止组、WKY大鼠运动组、自发性高血压大鼠静止组及自发性高血压大鼠运动组。运动为中等强度跑台运动，持续12周。造模完成后24 h称质量，尾动脉检测血压，收集血液和尿液检测肾脏功能相关的生化指标，取肾脏观察肾小球硬化程度，检测肾脏组织的硫化氢生成活性，RT-PCR法检测硫化氢生成相关酶的mRNA表达水平；同时考察肾脏组织的氧化应激情况。
结果与结论：①经过长期的有氧运动之后，自发性高血压大鼠的体质量、收缩压、舒张压明显降低；肾小球滤过率和肾血流量增加，血肌酐和尿素氮水平降低，尿白蛋白水平降低，肾小球硬化评分明显降低；血浆中硫化氢含量和肾脏组织中硫化氢生成速率明显增加；胱硫醚γ分解酶表达明显上调；血清中和肾脏中丙二醛含量明显降低；还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽比值明显增加；②结果提示，长期有氧运动可增加自发性高血压大鼠肾脏内源性硫化氢的生成，从而减轻肾脏组织的氧化应激，最终有助于维持自发性高血压大鼠的肾脏功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0003-1347-6596(王兵)

关键词: 实验动物, 运动系统动物模型, 有氧运动, 自发性高血压, 大鼠, 硫化氢, 肾脏功能, 还原型谷胱甘肽, 氧化型谷胱甘肽, 胱硫醚β合酶, 3-巯基丙酮酸硫基转移酶, 胱硫醚γ分解酶

Abstract:

BACKGROUND: It is well known that long-term aerobic exercise alleviates renal dysfunction in spontaneously hypertensive rats. However, the underlying molecular mechanism remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of long-term aerobic exercise on endogenous formation of hydrogen sulfide in the kidney of spontaneously hypertensive rats.
METHODS: Rat models of long-term aerobic exercise were established and randomly assigned to four groups: Wistar-Kyoto (WKY) rat static group, WKY rat exercise group, spontaneously hypertensive rat static group and spontaneously hypertensive rat exercise group. Moderate-intensity exercise on treadmill was given for 12 weeks. At 24 hours after model establishment, weight was weighted. Blood pressure was detected in the caudal artery. Blood and urine were collected for measuring biochemical indicators related to kidney functions. The degree of glomerular sclerosis was observed. Hydrogen sulfide production activity was detected in the kidney. RT-PCR was used to detect mRNA expression levels of hydrogen sulfide production-related enzymes. Simultaneously, oxidative stress of the kidney was observed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Long-term aerobic exercise obviously reduced body mass, systolic blood pressure and diastolic blood pressure, increased glomerular filtration rate and renal blood flow, decreased serum creatinine and urea nitrogen levels, urinary albumin levels, significantly reduced glomerular sclerosis score, increased hydrogen sulfide content in plasma and the rate of hydrogen sulfide formation in renal tissue, up-regulated cystathionine γ-lyase expression, obviously diminished malondialdehyde content in serum and kidney, and remarkably increased the reduced glutathione and oxidized glutathione ratio in spontaneously hypertensive rats. (2) Results indicated that long-term aerobic exercise could increase the generation of endogenous hydrogen sulfide in kidney, lessen oxidative stress in the kidney, and ameliorate renal dysfunction in spontaneously hypertensive rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Models, Animal, Hydrogen Sulfide, Glutathione, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王兵，侯俊，谷崎. 长期有氧运动增加自发性高血压大鼠肾脏内源性硫化氢的生成[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(27): 4090-4097.

Wang Bing, Hou Jun, Gu Qi . Long-term aerobic exercise enhances the production of endogenous hydrogen sulfide in the kidney of spontaneously hypertensive rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(27): 4090-4097.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 实验分为4组，即WKY大鼠静止组、WKY大鼠运动组、自发性高血压大鼠静止组及自发性高血压大鼠运动组，每组12只。全部进入结果分析，无脱失。

2.2 长期有氧运动对自发性高血压大鼠血压和体质量的影响 如表1所示，与WKY大鼠静止组相比，自发性高血压大鼠的收缩压、舒张压、心率明显增高，体质量变化不大；而经过长期的有氧运动之后，自发性高血压大鼠的体质量、收缩压、舒张压明显降低，心率变化不明显。

WKY大鼠经过长期有氧运动后，体质量明显下降，但是收缩压、舒张压、心率变化不明显。

2.3 长期有氧运动改善自发性高血压大鼠的肾脏功能

与WKY大鼠静止组相比，自发性高血压大鼠肾小球滤过率(图1A)和肾血流量(图1B)降低，血肌酐(图1C)和尿素氮(图1D)水平增加，尿白蛋白(图1E)水平增加，肾小球硬化评分(图1F)明显增加；而经过长期的有氧运动之后，自发性高血压大鼠肾小球滤过率和肾血流量增加，血肌酐和尿素氮水平降低，尿白蛋白水平降低，肾小球硬化评分明显降低。

WKY大鼠经过长期有氧运动后，肾脏的各项指标没有明显变化。

2.4 长期有氧运动增加自发性高血压大鼠肾脏内源性H₂S的生成 与WKY大鼠静止组相比，自发性高血压大鼠血浆中H₂S含量明显减少(图2A)；肾脏组织中H₂S生成速率明显降低(图2B)；肾脏中H₂S合成相关酶(图2C)：胱硫醚β合酶和3-巯基丙酮酸硫基转移酶的表达没有明显变化，而胱硫醚γ分解酶表达明显降低。而经过长期的有氧运动之后，自发性高血压大鼠血浆中H2S含量和肾脏组织中H2S生成速率明显增加；胱硫醚γ分解酶表达明显上调。

WKY大鼠经过长期有氧运动后，H₂S生成的各项指标没有明显变化。

2.5 长期有氧运动减轻肾脏内氧化应激的状态 与WKY大鼠静止组相比，自发性高血压大鼠血清中(图3A)和肾脏(图3B)中丙二醛(脂质过氧化产物，氧化应激的标志之一)含量明显增加；还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽比值明显降低(图3C)。而经过长期的有氧运动之后，自发性高血压大鼠血清中和肾脏中丙二醛含量明显降低；还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽比值明显增加，提示长期有氧运动可以减轻自发性高血压大鼠肾脏内氧化应激的状态。

WKY大鼠经过长期有氧运动后，氧化应激的各项指标没有明显变化。

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引言

材料方法

1.1 实验材料 实验于2015-03-01/07-23主要在西安体育学院、西安交通大学医学院和洛阳师范学院体育学院运动人体科学实验室完成。

试剂：尿液白蛋白检测试剂盒(美国R&D生物技术公司)；RIPA 裂解液、谷胱甘肽检测试剂盒(上海碧云天生物科技公司)；RT-PCR试剂盒(Roche罗氏生物试剂)；TBARS试剂盒(美国BioVision生物试剂公司)；封口膜(PARAFILM公司)；水合氯醛、三氯甲烷、异丙醇、乙醇等(中国医药集团上海化学试剂公司)。

1.2 实验动物 健康雄性Wistar-Kyoto大鼠(WKY)24只，体质量(218±19) g，由陕西中医医院动物实验中心提供，均以啮齿类动物国家标准常规喂养。

12周龄雄性自发性高血压大鼠24只，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。实验室采取控温设备与自然通风相结合的方式，室内温度基本保持在(24±2) ℃，日照方式以自然光和室内光相结合的方式进行，室内湿度维持在(47±8)%。

实验按随机数字表法分为4组，分别为WKY大鼠静止组，WKY大鼠运动组，自发性高血压大鼠静止组，自发性高血压大鼠运动组，每组12只。

1.3 造模方法

1.3.1 构建长期有氧运动大鼠模型 采用世界公认大鼠有氧运动实验模型^[19]，结合实验需要，自制大鼠用跑台，放置于电动跑步机上，倾斜角度10°，实验总共进行12周。第1周和第2周，30 min/d，速度为8 m/min；第3周和第4周，每天45 min，速度为12 m/min；剩余8周，60 min/d，速度为20 m/min。对照组大鼠(静止组)仅放置于跑台上，但不转动跑台，放置时间与运动组大鼠的运动时间相同，其他环境条件等相同。

1.3.2 造模成功的检测标准 大鼠比目鱼肌中柠檬酸合酶活性增加20%以上认为造模成功。

1.4 指标测定 所有指标均于造模后1 d测定。

1.4.1 血压检测 将大鼠头向里将其放进圆筒形的大鼠保温筒中，鼠尾暴露；将鼠尾放入37 ℃的温水中半小时预热，当看到鼠尾充血泛红时，则认为大鼠尾动脉已经充分扩张；将换能器固定于鼠尾腹侧面，并与BP2010A型大小鼠无创血压计连接，30 min保持黑暗、安静无打扰环境，等大鼠脉搏稳定后记录收缩压、舒张压、心率数值。

1.4.2 肾脏功能检测 实验末，使用代谢笼收集大鼠24 h的尿液，称量，1 000×g离心5 min。取上清置于负20 ℃冰箱保存，用于测定24 h尿白蛋白含量(使用ELISA试剂盒检测)。称量体质量后，注射10%水合氯醛麻醉，以腹主动脉放血处死大鼠，收集血3 mL左右，离心分离血浆或血清置于-20 ℃冰箱保存；采用日本Olympus AU2700全自动生化分析仪测定血清肌酐和尿素氮。大鼠肾小球滤过率、肾血流量和肾小球硬化评分根据文献[25]记录的方法进行检测。

1.4.3 H₂S含量检测

血浆：取NaHS标准品，用去离子水稀释成梯度浓度10，20，30，40，50，60，70，80 μmol/L，将H₂S探针NDS-Az溶于纯乙醇中(浓度调整为2.2 mmol/L)，使用黑底96孔板，每孔加入探针溶液10 μL，然后加入100 μL的血浆或标准品溶液，轻微振荡混匀。酶标仪激发波长360 nm、发射波长528 nm，读取每孔的数值，通过标准品孔数值绘制标准曲线，根据标准曲线计算血浆中H₂S浓度。

肾脏组织：取大鼠肾脏组织用磷酸钾缓冲液 (100 mmol/L，pH值7.4，4 ℃)匀浆；反应在25 mL锥形瓶中(冰浴环境)进行。反应体系：磷酸钾缓冲液、L-半胱氨酸(浓度10 mmol/L)、5’-磷酸吡多醛(浓度2 mmol/L)共700 μL和肾脏组织的匀浆液300 μL(体系体积为 1 mL)。在锥形瓶中央位置放置一个塑料管(容积约为 2 cm³)作为反应中央室，在中央室中加入500 μL 的醋酸锌溶液(浓度1%)，用氮气(N₂)充满锥形瓶维持30 s，使用封口膜将锥形瓶封口，然后将其转移到恒温摇床(温度调至37 ℃)中开始反应，1.5 h后加入500 μL的三氯醋酸(浓度为50%)用来终止反应，恒温摇床中继续放置1 h，移液器将中央室内容物吸出，加入到含3.6 mL蒸馏水的试管中，依次加入500 μL的N，N-二甲基-对苯二胺硫酸盐(20 mol/L)和400 μL的三氯化铁溶液(30 mol/L)，振荡混匀，室温(20-25 ℃)反应20 min，670 nm波长处用分光光度计读取溶液的吸光度。用梯度浓度的NaHS溶液读取吸光度值并制成标准曲线，依据曲线公式计算各组溶液中H₂S的水平。肾脏组织中H₂S的生成速率以每克组织在单位时间内生成的H₂S的量来表示。

1.4.4 RT-PCR 取肾脏用Trizol溶液匀浆，依次通过三氯甲烷、异丙醇、乙醇分离出总RNA，加入DEPC处理过的水20 μL溶解，-80 ℃存放。

反转录反应：4 μL 的总RNA (1 μg)，4 μL 的5×反转录缓冲液，2 μL 的10 mmol/L dNTP MIX，0.5 μL 的RNase抑制剂(40 U/μL)，1 μL的随机引物(50 pmol)， 2 μL的AMV RTase (10 U)，6.5 μL RNase-free水。反转录合成cDNA，取反转录产物进行PCR反应。

引物序列：胱硫醚β合酶，5’-ATG CTG CAG AAA GGC TTC AT-3’；5’-GTG GAA ACC AGT CGG TGT CT-3’；胱硫醚γ分解酶，5’-CGC ACA AAT TGT CCA CAA AC-3’；5’-GC TCT GTC CTT CTC AGG CAC-3’；3-巯基丙酮酸硫基转移酶，5’-GGC TCA GTA AAC ATC CCA TTC-3’；5’-TGT CCT TCA CAG GGT CTT CC-3’。内参基因GAPDH引物为：5’-GAG CTG AAT GGG AAG CTC AC-3’；5’-AAA GGT GGA GGA GTG GGA GT-3’。

反应过程：预变性，95 ℃，10 min；循环步骤(39个循环)：变性：95 ℃，15 s；退火：60 ℃，30 s；延伸：72 ℃，30 s；4 ℃结束。

应用Opticon Monitor^TM software软件记录threshold cycle值(CT值)。用内参基因GAPDH的值校正结果。

1.4.5 丙二醛含量的检测 取肾脏组织，加入1 mL的RIPA裂解液(冷浴环境下)进行匀浆，1 600×g离心10 min，分离出上清液，使用丙二醛试剂盒用于组织或血清中测定。如果测肾脏组织中丙二醛，需要使用BCA试剂盒测定组织溶液中的蛋白浓度，最终值表示为每毫克蛋白中的丙二醛含量。

1.4.6 谷胱甘肽水平检测 取部分液氮中保存的肾脏组织，称质量，在液氮中研成粉末。每10 mg研碎的组织粉末，加入100 μL蛋白去除试剂M溶液，振荡混匀，用玻璃匀浆器4 ℃条件下继续充分匀浆，冰上放置10 min后，4 ℃条件下10 000×g离心10 min，分离出上清，使用试剂盒用于还原性和氧化性谷胱甘肽的测定，并计算两者比值，作为考察肾脏组织氧化应激发生的指标之一。

1.5 主要观察指标 造模完成1 d后，检测血压，收集尿液，采集血液，分离肾脏，检测肾脏功能相关指标，检测内源性H₂S的生成及肾脏氧化应激的指标参数。

1.6 统计学分析 应用SPSS 12.0统计软件，所有数据用x(_)±s表示，多样本之间的比较采用One way ANOVA方法，当P < 0.05时认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

讨论

此课题的研究结果发现在自发性高血压大鼠的血液中H₂S含量明显下降；而肾脏中H₂S的生成活性明显降低。近些年来许多研究表明H₂S在生理和疾病状态下发挥细胞和组织的保护作用。在肾脏中H₂S可以通过提高肾小球滤过率和抑制肾小管再吸收，从而起到利尿、促排钠、促排钾的作用^[26]。动物在体积分数5%O₂条件下存活的时间一般不超过20 min，但是如果给予硫化氢或其供体预处理，动物的耐受低氧的时间超过6.5 h，提示硫化氢可以降低细胞和组织的耗氧，提高机体的耐受能力，产生了保护性的“类冬眠效应”^[27]。而肾髓质缺氧被认为是慢性肾病的普遍特征^[28-29]，所以肾脏中H₂S缺乏可以通过抑制体内重要的缺氧适应机制从而促进了慢性肾病的发生发展。

同时H₂S还具有显著的抗氧化应激作用。它含有的H+可以直接清除细胞内有害的活性氧；另外H₂S对活性氧生成的一个重要的酶——NADPH氧化酶起到抑制作用，从而间接地减少活性氧的生成^[30-31]。H₂S还具有抗炎作用。在遗传学高同种半胱氨酸血症鼠中，补充H₂S可以阻止肾脏中黏附因子和炎症因子的上调并减少炎性细胞的浸润^[32-33]。而氧化应激和炎症反应在慢性肾病的发生发展过程中也起到重要的促进作用^[34-35]，所以肾脏中H₂S缺乏可以通过促进氧化应激和炎症反应从而促进了慢性肾病的发生发展。

临床的研究发现，在原发性高血压患者中，如果坚持进行太极运动(另外一种有氧运动方式)可以明显增加患者血液中H₂S的水平^[36]。在前期的研究中作者也发现了长期有氧运动可以增加主动脉中H₂S的含量，从而改善主动脉内皮功能^[37]。在本研究中发现运动可以增加自发性高血压大鼠肾脏中H₂S的生成。肾脏中关于H₂S生成的3个酶(胱硫醚β合酶、3-巯基丙酮酸硫基转移酶、胱硫醚γ分解酶)都有丰富的表达；而有氧运动可以明显上调胱硫醚γ分解酶的mRNA表达，所以提示有氧运动可以通过上调肾脏中胱硫醚γ分解酶的表达，从而增加内源性H₂S的生成，最终有助于改善高血压大鼠的肾脏功能。

长期有氧运动实验模型和自发性高血压大鼠模型都是采用世界范围公认的实验模型来进行的，从大量实验研究成果来看，该模型的稳定性和可靠性较高，在检索现有SCI数据库收录论文中，大量高水平实验论文都采用该实验模型进行数据分析和成果检验。在实验研究中常见的动物运动模型包括电刺激收缩模型、游泳训练、跑台训练、转笼运动、举重模型、负重爬模型等。其中跑台运动应用于运动生理研究已经有50余年的历史^[38]。

跑台训练与人类正常运动方式相似，运动量和运动强度可通过调整跑的时间、跑速和跑台坡度来准确控制，这对于模型重现性要求高的心血管疾病实验研究十分有利，另外实验中对照组的设置非常方便，将动物放置于平板跑台的跑道上但跑台不转动即可，因此跑台训练在目前实验研究中应用较多^[19^，³⁷^，^39-44]。为了保证实验数据的准确定和模型的统一性，本研究重在实验模型数据的采集和实验数据的分析上，对实验模型未做明显的改动，目前动物实验成果应用于临床和进行人体实验对比还存在一定的分歧，但具有较高的可参考性，该方面研究还有待进一步深入。

综上所述，长期有氧运动能增加自发性高血压大鼠肾脏内源性硫化氢的生成，从而减轻肾脏组织的氧化应激，最终有助于维持自发性高血压大鼠的肾脏功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程