过表达miR-32削弱多氯联苯抑制P19细胞向心肌细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.018

摘要/Abstract

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文题释义：
多氯联苯：别名氯化联苯。多氯联苯按氯原子数或氯的百分含量分别加以标号，中国习惯上按联苯上被氯取代的个数(不论其取代位置)将多氯联苯分为三氯联苯(PCB3)、四氯联苯(PCB4)、五氯联苯(PCB5)、六氯联苯(PCB6)、七氯联苯(PCB7)、八氯联苯(PCB8)、九氯联苯(PCB9)、十氯联苯(PCB10)。多氯联苯属于致癌物质，容易累积在脂肪组织，造成脑部、皮肤及内脏的疾病，并影响神经、生殖及免疫系统，可通过对早期心脏发育相关重要基因的表达影响心肌分化进程。
P19细胞：加拿大渥太华大学的McBurney等在1982年从C3H/He雄性小鼠畸胎瘤中分离得到，是一种能够在体外培养的多能干细胞，P19细胞团经维甲酸诱导可分化成神经元、胶质细胞和纤维母细胞；而经二甲基亚砜诱导则分化成心肌细胞。P19细胞模型已被广泛用来研究细胞分化的分子机制。

摘要
背景：多氯联苯对P19细胞分化成心肌细胞有抑制作用。miRNAs在多氯联苯抑制P19细胞分化成心肌细胞过程中发挥了重要的作用。
目的：探索miR-32在调节多氯联苯对P19细胞分化成心肌细胞中的作用。
方法：将P19细胞与1%二甲基亚砜和2.5 μmol/L 多氯联苯共孵育，通过Western blot鉴定分化标志物α-actinin、desmin、cTnI以及早期心脏发育的重要转录因子GATA4的变化。qRT-PCR鉴定多氯联苯对miR-32表达的影响。应用基因重组技术成功构建了小鼠miR-32真核表达载体，将其转染至P19细胞，与2.5 μmol/L 多氯联苯和1%二甲基亚砜共孵育，通过Western blot实验观察分化相关蛋白表达。
结果与结论：①多氯联苯降低了miR-32的表达水平，抑制P19细胞向心肌细胞的分化；②成功构建了小鼠miR-32真核表达载体，建立了稳定过表达miR-32的P19细胞系；③过表达miR-32发挥了削弱多氯联苯对P19细胞向心肌细胞分化的抑制作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2933-7606(张松雨)

关键词: 干细胞, 分化, 多氯联苯, miR-32, P19细胞, 心肌细胞, 过表达

Abstract:

BACKGROUND: Polychlorinated biphenyls inhibit the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes. In the meanwhile, microRNAs play an important role in regulating cell differentiation.
OBJECTIVE: To explore the effect of microRNA-32(miR-32) on the polychlorinated biphenyls-inhibited differentiation of P19 cells into cardiomyocytes.
METHODS: P19 cells were co-cultured with 2.5 μmol/L polychlorinated biphenyls and 1% dimethyl sulfoxide. Afterwards, α-actinin, desmin, cTnI and GATA4 were identified by western blot assay. Wddwxrof polychlorinated biphenyls on the expression of miR-32 was evaluated by real-time PCR. Mouse eukaryotic vector expressing miR-32 was constructed by gene recombination technology, and transfected into P19 cells followed by co-cultured with 2.5 μmol/L polychlorinated biphenyls and 1% dimethyl sulfoxide. Then, expressions of differentiation-related proteins were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Polychlorinated biphenyls inhibited the differentiation of P19 cells into cardio myocytes and decreased the miR-32 expression. Cell lines overexpressing miR-32 was successfully established in mice. Furthermore, we found that overexpression of miR-32 weakens the inhibition of polychlorinated biphenyls to the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: MicroRNAs, Polychlorinated Biphenyls, Myocytes, Cardiac, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张松雨，李燕，刘江波，李纲. 过表达miR-32削弱多氯联苯抑制P19细胞向心肌细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(23): 3464-3469.

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图/表（结果） 1

2.1 PCB77抑制P19细胞向心肌细胞分化 不同浓度PCB77作用于P19细胞，同时用1%二甲基亚砜诱导分化，10 d后观察分化标志物α-actinin、desmin、cTnI以及早期心脏发育的重要转录因子GATA4的变化。结果发现与对照组相比较，PCB77处理组分化标志蛋白及心脏发育转录因子GATA4的表达降低，并呈剂量依赖性，说明PCB77抑制了P19细胞向心肌细胞的分化进程，PCB77浓度越高，抑制作用越明显，见图1。

2.2 PCB77降低miR-32的表达水平 取2.5 μmol/L PCB77作用4 d后的P19细胞，qRT-PCR法检测miR-32的表达水平，如图2所示，PCB77暴露下miR-32的表达降低。

2.3 miR-32成功转染至P19细胞 体外合成用于miR-32过表达研究的带有绿色荧光蛋白标记的miR-32慢病毒载体，以空载体为对照，分别转染P19细胞，于第12小时与第36小时通过荧光显微镜观察P19细胞中绿色荧光蛋白的表达并拍照。用嘌呤霉素筛选14 d后，用miRNA反转录试剂盒提取细胞总RNA，以U6为内参，用Real-time PCR验证miR-32的表达，获得稳定过表达miR-32的细胞株。荧光显微镜观察结果显示，实验组和对照组绿色荧光蛋白均有表达，并且表达量随着时间而上升，表明过表达miR-32的细胞株构建成功，见图3。

2.4 过表达miR-32促进P19细胞向心肌细胞分化 过表达miR-32以及含空载体的P19细胞与2.5 μmol/L的PCB77和1%二甲基亚砜同时孵育，诱导分化4 d后，将细胞团块接种到6 cm的培养皿中，加入不含PCB77和二甲基亚砜的α-MEM完全培养液，10 d后Western blot实验检测分化相关蛋白的表达，结果发现过表达miR-32的细胞均比转染空载体的细胞分化标志蛋白表达量多，过表达miR-32促进P19细胞向心肌细胞分化，削弱了PCB77对P19细胞向心肌细胞分化的抑制作用，见图4。

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引言

microRNAs(miRNAs)是一类小分子非编码单链RNA，长约22个核苷酸，通过与靶mRNA 3’非翻译区(3’-UTR)部分或完全配对，引起mRNA降解或抑制其翻译过程，从而在转录后水平对生物体内基因时序性表达起到精细调节作用^[1-4]。研究表明，miRNA可调控人类60%以上的基因^[5]。miRNA广泛存在于动物、植物细胞中，参与到细胞生长、分化、生物发育以及疾病发生等多种生物学过程中^[1^，^6]。研究表明miRNA与心脏发育、心肌细胞分化、心脏疾病的发生等过程密切相关^[7-9]。

多氯联苯(PCBs)是一类人工合成的有机物，在工业上有超过半个世纪的应用历史，也是著名的持久性有机污染物^[10]。大量研究表明暴露在多氯联苯中可导致心血管疾病发病率和严重性的增加。住在多氯联苯污染地区的人群，冠心病和急性心肌梗死的发病率增加^[11]。王薛洁等^[12]研究发现，多氯联苯暴露下，斑马鱼的胚胎心脏出现不同程度的发育异常。血液中多氯联苯的浓度越高，高血压的发病率越高^[13]。多氯联苯可导致鱼、鸟和哺乳动物的胚胎出现心血管结构改变和功能缺陷^[14]，但是多氯联苯诱导心血管疾病发生的分子机制还不清楚。

P19细胞是由Rogers和Mcburney取自C3H/He小鼠诱导的畸胎癌细胞^[15]，它具有自我复制和多向分化能力，是一种能够在体外培养的多能干细胞。P19细胞在维生素A酸诱导下可分化成神经元和神经胶质样细胞，在二甲基亚砜诱导下能够分化为心肌细胞^[16]，该细胞模型已被广泛用来研究细胞分化的分子机制^[17-18]。P19细胞易于培养，在体外可迅速大量扩增，是研究哺乳动物心脏发育、基因调控的有用工具。

miR-32与多种人类恶性肿瘤的发病机制有关。Zhang等^[19]研究发现过表达miR-32显著抑制SGC?7901胃癌细胞的增殖，降低细胞的迁移能力。Petillo等^[20]研究表明过表达miR-32可导致肾癌患者预后不良。Xu等^[21]研究表明miR-32可以负调控Sox9的表达，从而抑制骨肉瘤细胞的增殖。Wu等^[22]研究发现过表达miR-32可以通过抑制PTEN的表达而促进直肠癌细胞的增殖和迁移，减少细胞凋亡。这些研究表明miR-32可以作为致癌基因或抑癌基因从而发挥作用。

实验应用基因重组技术构建小鼠miR-32真核表达载体，研究过表达miR-32及多氯联苯暴露下P19细胞分化功能，为先天性心脏病的防治提供新的线索和理论依据。

材料方法

1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年12月至2016年2月在南阳市中心医院病理学实验室完成。

1.3 材料 P19细胞购自美国菌种保藏中心(ATCC)；α-MEM培养基、胎牛血清、青/链霉素购自美国Gibco公司；胰蛋白酶、二甲基亚砜、3，3，4，4-四氯联苯(PCB77)购自美国Sigma公司；嘌呤霉素、miRNA抽提试剂盒、miRNA反转录试剂盒购自Ambion公司；Taqman MicroRNA Real-time PCR试剂盒购自美国Gene Copoeia公司；慢病毒转染增强液(polybrene)购自上海吉玛公司；ABI 7500 Realtime PCR仪购自美国ABI公司；细胞培养箱购自日本三洋公司；荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、Nanodrop2000购自美国Thermo Scientific公司；鼠抗α-actinin、鼠抗cTnI购自美国Santa Cruz公司；兔抗desmin、兔抗GATA4、兔抗GAPDH购自Abcam公司；HRP标记的山羊抗兔、山羊抗鼠购自北京中杉金桥有限公司；RIPA裂解液(强)、ECL显色液购自碧云天公司。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养及分化诱导 P19细胞在含体积分数为5% CO₂的37 ℃培养箱中培养，每2 d换1次新鲜的完全培养液(含体积分数为10%胎牛血清，100 U/mL青-链霉素的α-MEM培养液)。在倒置显微镜下观察细胞生长情况，选取细胞生长融合度为75%-80%的细胞，消化后接种在直径为10 cm的培养皿中，使其悬浮培养在含有1%二甲基亚砜的α-MEM完全培养液中进行诱导分化(记为0 d)。诱导分化4 d后，将细胞团块接种到6 cm的培养皿中，加入不含二甲基亚砜的α-MEM完全培养液，培养10 d直到细胞分化成心肌细胞。

1.4.2 PCB 77处理细胞 PCB77溶于二甲基亚砜，在培养0 d时加入到培养液中，使其终浓度分别为0，0.5，1.5，2.5，3.5 μmol/L，培养基中加入等量的二甲基亚砜作为阴性对照。诱导分化方法同上，10 d后Western blot观察分化标志物α-actinin、desmin、cTnI以及早期心脏发育的重要转录因子GATA4的变化。

1.4.3 过表达miR-32细胞系的构建 将P19细胞培养至50%左右融合度时感染miR-32慢病毒载体(带有绿色荧光蛋白标记)及空载体，感染同时加入质量浓度为 5 mg/L聚凝胺(Polybrene)增强液增加慢病毒感染效率。感染12，36 h在荧光倒置显微镜观察P19细胞中绿色荧光蛋白的表达并拍照。感染48 h后向培养基中加入嘌呤霉素至终质量浓度为2 mg/L，筛选稳定表达株，根据细胞生长情况换液，培养基中加入新鲜的嘌呤霉素，保持终质量浓度不变。筛选14 d左右，用miRNA抽提试剂盒提取细胞的miRNA，使用Nanodrop 2000测量RNA浓度，按miRNA反转录试剂盒说明书进行反转录。以U6为内参，用Real-time PCR验证miR-32的表达，获得稳定过表达miR-32的细胞系。

1.4.4 过表达miR-32对P19细胞向心肌细胞分化的影响 将过表达miR-32的P19细胞，与含2.5 μmol/L PCB77和1%二甲基亚砜的α-MEM完全培养液同时孵育，诱导分化4 d后，将细胞团块接种到6 cm的培养皿中，加入不含PCB77和二甲基亚砜的α-MEM完全培养液，10 d后Western blot检测α-actinin、desmin、cTnI以及GATA4的变化。

1.4.5 Western blot 检测分化指标 细胞样品用冷的PBS洗2次，RIPA裂解液(添加1 mmol/L PMSF)裂解细胞，4 ℃，12 000×g离心5 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE，100 V转膜1 h，5%脱脂奶粉封闭1 h，抗desmin、抗GATA4、抗α-actinin、抗cTnI的抗体作为一抗，GAPDH作为内参，HRP标记的山羊抗兔、山羊抗鼠作为二抗，ECL显色检测蛋白表达。

1.4.6 miR-32表达水平的检测 取2.5 μmol/L PCB77作用4 d后的P19细胞，用miRNA抽提试剂盒说明书进行操作提取细胞内的miRNA。使用Nanodrop 2000测量RNA浓度，按miRNA反转录试剂盒说明书进行反转录，使用real-time PCR检测miR-32的表达量。将cDNA加入Taqman MicroRNA Real-time PCR试剂盒，以U6作为内参，在Realtime PCR仪上进行相对定量。采用2^-^??Ct方法分析miR-32在不同细胞中的相对表达水平。

1.5 主要观察指标 ①PCB77对P19细胞向心肌分化的影响。②miR-32是否成功转染到P19细胞。③miR-32对P19细胞向心肌分化的影响。

1.6 统计学分析 实验中计量数据均以x(_)±s表示，采用GraphPad Prism 5软件进行处理，其中组间差异比较使用t 检验或单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

miRNAs是一类在生物体内广泛存在的非编码RNA，可以调控生物体内基因的表达。目前已经确认多种miRNAs在心脏发育过程中有重要的作用。例如miR-208a在小鼠心脏发育过程中有重要的作用，过表达miR-208a可导致小鼠心脏肥厚性生长^[23]。miRNA-1抑制Notch信号中Delta受体表达从而促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化^[24]。miR-21通过诱导靶基因表达来保护心肌细胞免受过氧化氢导致的损伤^[25]。

为探索miR-32在调节PCB77对P19细胞分化成心肌细胞的影响，实验首先通过二甲基亚砜诱导P19细胞向心肌细胞的分化及PCB77暴露来模拟心脏发育过程，从而研究PCB77对P19细胞向心肌分化进程的影响，结果发现PCB77可以抑制P19细胞向心肌细胞分化，qRT-PCR结果表明PCB77会降低miR-32的表达水平。王瑛等^[26]研究发现，将PCB77加入向心肌细胞分化的P19细胞培养液中，心脏发育相关的基因GATA4和Nkx2.5 mRNA的表达量较对照组明显下降，这和作者进行实验的结果是一致的，提示PCB77可能会对心肌细胞分化产生不良影响。

越来越多的研究表明暴露于环境污染物中与miRNAs异常有显著的关联性^[27]。Guida等^[28]研究显示，生活在污染地区的孕妇，其外周血单核细胞中总多氯联苯的含量与miR-191的表达水平呈正相关。多氯联苯和miR-1537的表达相关，多氯联苯含量越高，胎盘中miR-1537的表达越高^[29]。Zhu等^[30]研究显示，在P19细胞分化成心肌细胞的过程中，多氯联苯对细胞内miRNAs的表达水平有重要影响，P19细胞分化时暴露于多氯联苯环境中，有14种miRNAs上调，31种miRNAs下调。多氯联苯暴露可导致心血管疾病，miRNAs在多氯联苯抑制心肌细胞分化中的调节机制还不清楚。

miR-32位于9q31.2，这一区域在许多肿瘤中缺失高频区。Yan等^[31]研究表明，miR-32可以靶向磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN)从而抑制其表达^[22]，进而调控细胞的增殖、迁移和入侵。Zhu等^[32]研究表明，在非小细胞癌中，miR-32可以靶向SOX9，抑制A549细胞的增殖、迁移。Zhang等^[33]研究发现在人口腔鳞状癌细胞中，miR-32靶向EZH2的3’-UTR，过表达miR-32可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。

实验成功构建了稳定过表达miR-32的P19细胞系，并发现过表达miR-32可以削弱PCB77对P19细胞向心肌细胞分化的抑制作用，这些结果为消除环境污染物对人体的影响奠定了理论基础。有研究表明，miR-32表达升高可以使受损的细胞继续存活^[34]。在多氯联苯暴露下，miR-32的确切靶点以及具体通过哪一种细胞通路来调控P19细胞分化还需要进一步研究。