丹参酮Ⅱ联合骨髓间充质干细胞移植促进脑梗死后的神经再生

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.012

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
丹参酮：亦称总丹参酮。是从中药丹参(唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge根)中提取的具有抑菌作用的脂溶性菲醌化合物，从中分得丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮和异隐丹参酮等10余个丹参酮单体，其中隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅱ，羟基丹参酮、丹参酸甲酯和丹参酮ⅡB 5个单体具有抗菌、抗炎及降温作用。
脑源性神经营养因子：是1982年Barde等首先在猪脑中发现的一种具有神经营养作用的蛋白质。脑源性神经营养因子及其受体在神经系统广泛表达。在脑梗死周围区域的表达水平影响脑梗死的神经修复。

摘要
背景：有研究表明，丹参酮Ⅱ能改善微循环，扩张脑血管，增加脑血流量，降低脑梗死面积，改善脑梗死后造成的脑功能代谢障碍。
目的：观察丹参酮Ⅱ联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑梗死后受损神经再生的影响。
方法：采用线栓法制作急性脑梗死大鼠模型，进行丹参酮Ⅱ联合骨髓间充质干细胞移植，并设骨髓间充质干细胞移植组和模型组进行对比。采用Longa评分进行神经运动功能的评定；采用RT-PCR法检测大鼠脑梗死区周围脑源性神经营养因子基因的表达；采用TUNEL法检测大脑梗死区细胞凋亡情况；利用免疫组织化学检测梗死灶周围皮质Nogo-A和NgR蛋白的表达。
结果与结论：①Longa评分、凋亡指数、Nogo-A和NgR蛋白表达：联合组<骨髓间充质干细胞移植组<模型组(P < 0.05)；②脑源性神经营养因子基因表达：联合组>骨髓间充质干细胞移植组>模型组(P < 0.05)；③结果证实，丹参酮Ⅱ联合骨髓间充质干细胞移植可通过抑制梗死区Nogo-A和NgR蛋白的表达，促进脑源性神经营养因子基因的表达，促进神经功能恢复，促进脑梗死后神经再生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0001-5974-1960(卢乙众)

关键词: 干细胞, 移植, 丹参酮Ⅱ, 骨髓间充质干细胞, 移植, 脑梗死, 大鼠, 神经损伤, 神经再生, 脑源性神经营养因子, Nogo-A, NgR

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that tanshinone II can improve microcirculation, dilate cerebral blood vessels, increase cerebral blood flow, reduce infarct size, and improve brain function after cerebral metabolic disorder.
OBJECTIVE: To investigate the effect of tanshinone II combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on nerve regeneration following cerebral infarction in rats.
METHODS: Rat models of acute cerebral infarction were prepared using the thread occlusion method and then given tanshinone II combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation (combined group), bone marrow mesenchymal stem cell transplantation (cell transplantation group), and no treatment (model group), respectively. Neuromotor function was assessed using Longa scores. Expression of brain-derived neurotrophic factor gene around the infarction region was detected using RT-PCR. Cell apoptosis was detected using TUNEL. Immunohistochemistry staining was used to determine peri-cortex Nogo-A and NgR protein expression at the infarction region.
RESULTS AND CONCLUSION: Longa scores, apoptotic index, and expression of Nogo-A and NgR proteins exhibited significant differences among three groups (P < 0.05) as follows: combined group < cell transplantation group < model group. Conversely, the expression of brain-derived neurotrophic factor gene was highest in the combined group successively followed by the cell transplantation group and model group (P < 0.05). These data show that tanshinone II combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation accelerate the recovery of neurologic function and promote nerve regeneration after cerebral infarction by incresing mRNA expression of brain-derived neurotrophic factor.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Tissue Engineering, Salvia miltiorrhiza

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 纳入大鼠63只，做干细胞培养时处死1只，建模过程中失败及死亡2只，最终计入结果分析的数量60只。

2.2 骨髓间充质干细胞的形态 原代培养骨髓间充质干细胞呈圆形，数量较少、散在分布，可见非贴壁的有核细胞；第5天后细胞铺满培养瓶底面，较多集落细胞形成，细胞细小呈长梭形；传代到第3代时的骨髓间充质干细胞胞体饱满、漩涡状生长，细胞呈多角形、不规则形，折光性强，长有两个或多个突起，有的突起相互连接，可见细胞核及核仁，均一性较好，形态基本一致，纯度达97%以上。见图1。

2.3 各组大鼠神经功能恢复情况 治疗后第3，7，14，21天，联合组的Longa评分明显低于模型组及骨髓间充质干细胞移植组(P < 0.05)，骨髓间充质干细胞移植组又低于模型组(P < 0.05)，见表1。

2.4 大鼠脑梗死区周围脑源性神经营养因子基因的表达 移植后2周，RT-PCR检测结果显示，模型组及骨髓间充质干细胞移植组的脑源性神经营养因子基因相对表达量为0.32±0.11，0.78±0.30，明显低于联合组的1.96±0.32(P < 0.05)，模型组又低于骨髓间充质干细胞移植组(P < 0.05)，见图2。

2.5 大属脑梗死区细胞凋亡情况 TUNEL法检测显示，联合组凋亡指数明显少于骨髓间充质干细胞移植组及模型组。在移植后1 d联合组可见少量 TUNEL阳性细胞，模型组、骨髓间充质干细胞移植组TUNEL阳性细胞数均较多，移植后3 d联合组凋亡指数明显少于骨髓间充质干细胞移植组及模型组(P < 0.05)，骨髓间充质干细胞移植组又明显少于模型组(P < 0.05)。移植后7 d，联合组凋亡指数进一步减少(P < 0.05)。各组大鼠凋亡指数比较见表2。

2.6 梗死灶周围皮质Nogo-A和NgR蛋白的表达 免疫组织化学检测显示，联合组中梗死灶周围皮质 Nogo-A和NgR阳性蛋白表达与骨髓间充质干细胞移植组及模型组比较明显下降(P < 0.05)，骨髓间充质干细胞移植组与模型组比较明显降低(P < 0.05)，见表2。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2013年8月至2015年4月在河南医科大学动物实验室完成。

1.3 材料 健康清洁级1月龄SD大鼠63只，雌雄不限，体质量212-230 g，购自于河南医科大学动物实验室，动物质量合格证号：DK0504(豫)0001，饲养坏境：20-22 ℃、自由进食、饮水。

1.4 方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离培养 在63只SD大鼠中随机取1只，采取水合氯醛麻醉后处死，利用体积分数75%的乙醇将全身浸入以消毒约10 min。在无菌环境下分离出双侧的胫骨、股骨，剔除骨端, 选用10号注射器吸取1 mL的DMEM完全培养基自一端开始冲洗,制成单细胞悬液。采用100 mL培养瓶按3×10⁷ L^-¹细胞数接种细胞，将其置入37 ℃、体积分数5%CO₂及饱和湿度的孵育箱中孵育24 h后，全量换液，随后每隔3 d换液1次。对细胞生长状况进行逐日观察，待细胞出现80%融合时，按照1∶2的比例开始行下1次传代。骨髓间充质干细胞经历多次传代扩增培养后，逐渐得到纯化、扩增。选择生长良好的1-3代骨髓间充质干细胞，采用体积分数0.25%的胰酶消化5 min，用含胎牛血清的培养液终止消化，通过PBS冲洗后以1 000 r/min，离心5 min后，将培养好的大鼠骨髓间充质干细胞悬液收集备用。

1.4.2 急性脑梗死模型大鼠的构建和分组干预 采用线栓法制作大鼠急性脑梗死模型，采用水合氯醛通过腹腔注射麻醉SD大鼠，将大鼠以俯卧位固定于无菌操作台上，做一颈正中切口，对右侧颈总、颈内和颈外动脉进行游离，利用准备好的尼龙线结扎颈总动脉、颈外动脉，在颈总动脉分叉下方剪一切口，采用明胶处理过的1.8号鱼线自切口处插入右颈内动脉，鱼线进入深度达17.0-18.0 mm处进行结扎颈内动脉，使血供完全阻断。阻断120 min后抽出尼龙线，恢复再灌注。模型建立成功的标志为大鼠即刻出现右侧Horner征。

建模成功后将60只SD大鼠随机分为模型组、骨髓间充质干细胞移植组及联合组，每组各20只。实验共63只大鼠，做干细胞培养时处死1只，建模过程中失败及死亡2只。模型组通过腹腔静脉注射生理盐水45 mg/kg，骨髓间充质干细胞移植组腹腔注射骨髓间充质干细胞悬液(2.5×10⁸ L^-¹，共1 mL)，联合组注射骨髓间充质干细胞悬液(2.5×10⁸ L^-¹，共1 mL)的同时联合注射丹参酮Ⅱ注射液30 mg/kg，均连续注射5 d，1次/d。

1.4.3 采用Longa评分进行神经运动功能的评定 实验分别于治疗前及治疗后的第3，7，14，21天，采用Longa评分进行神经运动功能的评定。Longa的评分标准^[9]。总分为5分，无神经缺损症状，评为0分；左前肢不能完全伸直评为1分，体尾实验为阳性，评为2分；向左旋转，评为3分；向左侧倾倒评为4分；不能行走或昏迷评为5分。评分结果越高，表明神经功能障碍越严重。
1.4.4 采用RT-PCR法检测大鼠脑梗死区周围脑源性神经营养因子基因的表达 于移植后2周分别在各组随机取5只SD大鼠，取脑梗死区组织(100 mg/只)进行RT-PCR分析。用Trizol提取RNA，紫外分光光度仪测定RNA含量，RT-PCR反应试验按美国Hyclone公司反应试剂盒说明书进行。以总RNA为模板，以β-actin作为内对照，通过RT-PCR两步法试剂盒操作说明，将mRNA反转录为cDNA，反应参数为：30 ℃，10 min→2 ℃，30 min→99 ℃，5 min→5 ℃，5 min。将cDNA于-20 ℃保存。以反转录所得cDNA为模板^[7]，反应条件：95 ℃行变性1 min，93 ℃变性30 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min进行反应，30个循环后，再以72 ℃延伸6 min。将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶自动成像及分析系统，取PCR扩增产物进行电泳，电泳结果用凝胶图像分析系统进行电泳条带吸光度分析，计算脑源性神经营养因子mRNA条带和内参的吸光度值比值。

1.4.5 采用TUNEL法检测大脑梗死区细胞凋亡情况 移植后2周分别在各组随机取5只SD大鼠，取脑梗死区组织，切片经石蜡包埋、脱腊水化后，PBS漂洗5 min×3，于37 ℃的蛋白酶K处理切片。将体积分数0.3%的Triton X-100和PBS配制的含体积分数3%羊血清的通透液滴加到载玻片上脑片区域，将整个脑片覆盖住，4 ℃下孵育20 min。将TUNEL的Ⅰ和Ⅱ溶液液按1∶9混合滴于铺片上，37 ℃恒温箱内孵育2 h。利用荧光抗体37 ℃ 1 h，PBS漂洗5 min共3次，然后滴入固红呈色液，避光反应约58 min后停止。PBS充分洗涤5 min后，终止反应，实验重复3次，甘油封片剂对盖玻片封固，光学显微镜下观察照相。胞核呈绿色颗粒为TUNEL阳性细胞，进行凋亡细胞计数，凋亡指数=阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100%。

1.4.6 免疫组织化学检测梗死灶周围皮质Nogo-A和NgR蛋白的表达 于治疗后第 3，7，14，21天，采用体积分数3.5%的水合氯醛过量麻醉SD大鼠后，迅速断头取脑组织，置入-20 ℃冰箱冰冻后，做片厚为2 mm的冠状位切片。放入体积分数10%中性缓冲甲醛溶液中固定48 h，采用梯度乙醇脱水, 石蜡包埋, 取梗死灶组织行SABC免疫组织化学染色，根据试剂盒操作说明书进行免疫组织化学染色，滴加兔抗人Nogo-A(NgR)一抗(1∶500)稀释液内孵育，4 ℃过夜，PBS冲洗3次，每次5 min，滴加辣根过氧化酶标记二抗(1∶1 000)，室温下孵育1 h。弃掉PBS，每张切片加入100 μL新鲜配制的DAB溶液，放置于显微镜下观察10 min至DAB显色阳性为细胞核呈棕黄色。利用蒸馏水彻底清洗3次每次 2 min，放入梯度乙醇和二甲苯中脱水透明，切片风干，中性树脂封固。

在高倍镜(×200)下每张切片上任取5个视野，X射线片曝光显影，经ABB成像分析系统扫描，分析各样本灰度值。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.5 主要观察指标 各组大鼠Longa评分、脑梗死区周围脑源性神经营养因子基因的表达、大脑梗死区细胞凋亡情况、梗死灶周围皮质 Nogo-A和NgR 蛋白的表达。

1.6 统计学分析计量资料以x(_)±s表示，采用SPSS 13.0 软件包进行数据处理，多组间数据比较采用单因素方差分析法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

Nogo-A和NgR是轴突再生抑制蛋白，在脑梗死发生后，中枢神经元的病理损伤会诱发这些抑制蛋白的释放，从而阻碍了梗死后神经功能的康复^[10-12]。相关研究表明，Nogo-A和NgR在大鼠脑梗死后表达显著增加，严重抑制了轴突神经纤维的再生^[13-15]。另有研究表明，在大鼠缺血缺氧模型中，Nogo-A和NgR在大鼠神经元的病理变化过程中扮演了重要角色^[16-19]。实验通过免疫组织化学法检测到，将丹参酮Ⅱ与骨髓间充质干细胞移植联合应用后，梗死灶周围皮质Nogo-A和NgR阳性蛋白表达有明显下降，而在模型组Nogo-A和NgR呈现高表达，提示抑制蛋白Nogo-A和NgR可能参与了大鼠脑梗死后神经元的变性、坏死等病理过程^[20-24]。

丹参酮Ⅱ是从中国传统中药丹参中提取，为水溶性物质，生物利用率较高^[25-28]。根据中国传统理所述，丹参具有祛瘀止痛、活血调经、除烦安神、凉血消痈等作用^[29-32]。有研究表明，丹参酮Ⅱ能改善微循环，扩张脑血管，增加脑血流量，降低脑梗死面积，改善脑梗死后造成的脑功能代谢障碍，多用于心脑血管疾病中的治疗^[33-36]。有研究表明，丹参酮ⅡA可以对缺血性脑卒中发挥较好疗效，且其不良反应发生率与治疗费用均较低，可以作为促进脑梗死患者神经功能恢复的理想药物^[37-51]。

实验通过Longa评分法检测在治疗前及治疗后的第3，7，14，21天，发现联合组的Longa评分明显低于模型组及骨髓间充质干细胞移植组，骨髓间充质干细胞移植组又低于模型组，提示骨髓间充质干细胞移植可以促进梗死后神经功能的恢复，但联合丹参酮Ⅱ作用效果更佳。脑源性神经营养因子基因在神经元的生存、分化、生长过程中起关键作用，脑源性神经营养因子 mRNA对神经元功能恢复及和神经再生修复具有重要作用。

实验通过RT-PCR检测脑源性神经营养因子基因表达情况，结果表明模型组及骨髓间充质干细胞移植组的脑源性神经营养因子基因表达明显低于联合组，模型组又低于骨髓间充质干细胞移植组，说明联合组的神经再生效果是3组中最好的。实验还通过TUNEL法检测显示，凋亡细胞数目在联合组的表达明显少于骨髓间充质干细胞移植组及模型组，表明联合组的神经细胞凋亡得到很好的改善。这些结果均证明丹参酮Ⅱ与骨髓间充质干细胞移植联合应用，可以对脑梗死后受损神经的再生产生更好的疗效。

综上所述，丹参酮Ⅱ联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑梗死的保护作用有可能通过抑制梗死区Nogo-A 和NgR蛋白的表达，促进脑源性神经营养因子基因的表达，进而促进脑梗死后神经功能的恢复。实验为脑梗死预防性治疗提供了实验依据。但是脑梗死的发病机制可能通过多种途径进行，虽然干细胞移植治疗脑梗死已取得一定实验基础，但仍需进一步深入探讨研究，以寻求更为有疗效的治疗方式。