人原代胃癌细胞中肿瘤干细胞的分化培养

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.005

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
细胞分化：在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态结构和生理功能上发生稳定性的差异的过程称为细胞分化。细胞分化的本质是基因组在时间和空间上的选择性表达，通过不同基因表达的开启或关闭，最终产生标志性蛋白质。
CD44：是分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，主要参与异质性黏附，即肿瘤细胞与宿主细胞和宿主基质的黏附，异质性黏附在肿瘤细胞侵袭转移中起促进作用。

摘要
背景：肿瘤干细胞与肿瘤的发生和复发存在密切的联系，但是否所有肿瘤中都存在肿瘤干细胞，仍存有一定的争议。
目的：探讨人原代胃癌细胞中肿瘤干细胞的分化培养效果。
方法：获得新鲜胃癌组织进行原代培养，并进行苏木精-伊红染色和CEA免疫组化鉴定。利用无血清微球体培养体系获得胃癌微球体细胞，免疫荧光法检测微球体细胞CD44表达。以CD44作为标志物对胃癌微球体细胞进行免疫磁珠分选，将分选出的细胞接种于小鼠腋窝后方皮下，观察移植肿瘤生长情况。
结果与结论：①以无血清培养体系获得人原代胃癌微球体细胞。球体培养获得的细胞中CD44+细胞数量显著多于常规培养获得的细胞(P < 0.05)；②球体培养细胞接种小鼠的移植肿瘤体积增长速度明显快于常规培养细胞接种；③移植90 d，获得肿瘤标本，可见球体培养细胞接种小鼠的移植瘤体积明显大于常规培养细胞接种；④实验结果表明，利用无血清微球体培养体系结合免疫磁珠分离法可以从胃癌组织中分离出肿瘤干细胞，该细胞具有一定的成瘤性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-8811-5459(王影)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 肿瘤, 胃癌, 细胞分化

Abstract:

BACKGROUND: There is a close relationship between tumor stem cells and tumor occurrence and recurrence, but there are still some disputes in the presence of tumor stem cells in all tumors.
OBJECTIVE: To investigate the differentiation and culture of tumor stem cells in human primary gastric cancer cells.
METHODS: Primary gastric cancer cells isolated from fresh gastric cancer tissues were stained with hematoxylin-eosin and identified by immunohistochemical detection of carcinoembryonic antigen. The CD44 expression of the cells was detected using immunofluorescence method. Magnetic activated cell sorting was used to isolate CD44⁺ gastric cancer cells that were then seeded subcutaneously behind the armpit of mice. Growth of implanted tumor cells was observed.
RESULTS AND CONCLUSION: Human primary gastric cancer cells were isolated in serum-free medium. Compared with the routine culture group, the number of CD44⁺ cells (P < 0.05) and the tumor volume were significantly increased in the spheroid culture group. Furthermore, at 90 days after transplantation, the tumor volume of mice in spheroid culture group was significantly higher than that in the routine culture group. These experimental findings indicate that gastric cancer cells with certain tumorigenicity can be successfully isolated from gastric cancer cells using serum-free culture method and magnetic activated cell sorting method.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stomach Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王影. 人原代胃癌细胞中肿瘤干细胞的分化培养[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(23): 3380-3385.

Wang Ying. Differentiation and culture of tumor stem cells in human primary gastric cancer cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(23): 3380-3385.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年8至12月在吉林省白城医学高等专科学校实验室完成。

1.3 材料 收集胃癌患者手术切除后的新鲜组织标本5例，所有患者均经临床病理确诊，均为腺癌，患者及家属均签署知情同意书，并经吉林省白城医学高等专科学校医学伦理部门审核。健康雄性SCID小鼠20只，鼠龄28 d，体质量20 g左右，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。

1.4 实验方法

1.4.1 人原代胃癌细胞培养^[6] 手术切除的胃癌肿瘤组织用体积分数为95%乙醇溶液清洗，随后用含青链霉素的PBS进行多次洗涤，用眼科剪去掉肿瘤组织表面的覆盖物，将肿瘤内部组织剪碎至2 mm³左右小块，加入适量Ⅰ型胶原酶消化，每隔 0.5 h 进行1次机械吹打，消化三四个小时后加入中止液终止消化，过滤、离心、收集细胞，用DMEM培养液冲洗1次，接种在含胎牛血清的DMEM培养液中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱进行培养，观察细胞生长情况，待细胞生长至铺满培养瓶80%左右时进行传代。

1.4.2 人原代胃癌细胞鉴定^[7]

苏木精-伊红染色：取原代胃癌细胞进行细胞爬片培养，待细胞贴壁且数量达到整个玻片80%以上，取出玻片，PBS漂洗2次，多聚甲醛溶液固定，PBS洗涤3次，苏木精复染、水洗、盐酸分化、脱水、伊红染色、洗涤、脱水、透明、封固、显微镜下观察。

免疫组化染色：取原代胃癌细胞进行细胞爬片培养，待细胞贴壁且数量达到整个玻片80%以上，取出玻片，PBS漂洗2次，多聚甲醛溶液固定，PBS洗涤3次，0.5% Txiton X-100处理，PBS漂洗3次，滴加含BSA的封闭液处理1 h，甩干封闭液，滴加1︰500稀释的兔抗人CEA单克隆抗体，置于4 ℃环境下反应过夜，PBS洗涤3次，滴加生物素标记的羊抗兔IgG二抗，置于室温环境下反应10 min，PBS洗涤3次，滴加辣根过氧化酶标记的链霉卵白素处理，置于室温环境下反应10 min，PBS洗涤3次，DAB显色，苏木精复染，封固，显微镜下观察。利用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4.3 人原代胃癌细胞的球体培养 取上述检测后的原代胃癌细胞，采用无血清培养液进行微球体培养，无血清培养液成分：含1% N-2 supplement，2% B-27 supplement，1%青/链霉素，20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和20 μg/L表皮生长因子的RPMI 1640培养液。置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱培养2周，在光学显微镜下观察细胞的成球情况。

1.4.4 人原代胃癌细胞CD44表达检测^[8] 利用免疫荧光法检测肿瘤干细胞CD44的表达。取原代胃癌细胞进行爬片培养，待细胞贴壁且数量达到整个玻片80%以上、以及胃癌细胞微球体形成时，取出玻片用多聚甲醛溶液固定，进行免疫荧光染色，一抗为1︰10 稀释的APC标记的兔抗人CD44单克隆抗体，置于4 ℃环境下避光反应过夜，PBS洗涤3次，滴加DAPI染色液，置于避光环境下反应5 min，PBS洗涤3次，甘油封固，置于荧光显微镜下观察。用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4.5 免疫磁珠法分选胃癌干细胞 收集人胃癌细胞球，胰蛋白酶消化后将细胞悬浮于 Pluscellect缓冲液中，添加兔抗人CD44 单克隆抗体孵育15 min，加入Pluscellect缓冲液洗涤细胞，离心，加入Pluscellect缓冲液重悬细胞，随后在细胞悬液中加入标记CD44抗体的磁珠孵育15 min^[9]，加入Pluscellect缓冲液洗涤细胞，离心，加入Pluscellect缓冲液，将细胞转移至反应管中，置于磁场中孵育6 min，观察细胞迁移情况，将悬浮细胞小心移出后，将反应管移出磁场，加入Pluscellect缓冲液和无血清培养液重悬细胞，即为分选所得细胞，妥善保存备用。

1.4.6 胃癌干细胞成瘤性检测 取上述常规培养的原代胃癌细胞作为对照组，分选所得CD44⁺胃癌细胞作为球体培养细胞组。调整两组细胞浓度为3×10⁵个(50 μL)，与Matrigel基质胶按照1︰1的体积比充分混合。20只SCID小鼠随机分为2组，每组10只，分别在腋窝后方皮下接种上述两组细胞，注意避免注射到腋窝深部，以免瘤体生长中侵入胸廓内，导致小鼠的早期死亡。细胞接种后观察成瘤情况和动物体质量，连续观察90 d，待小鼠体质量下降幅度大于20%，肿瘤体积达到2 000 mm³以上，处死小鼠，获得移植瘤组织并进行测量。肿瘤的体积V=1/2×a×b²(a和b分别位肿瘤块的长径和短径)。

1.5 主要观察指标 ①人原代胃癌细胞球体培养结果。②人原代胃癌细胞免疫荧光检测结果。③人原代胃癌细胞皮下接种的成瘤结果。

1.6 统计学分析 使用统计学软件为SPSS 18.0，组间比较予以单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

常规方法治疗胃癌的过程中，较易出现复发和转移，预后效果不佳^[10]。随着“肿瘤干细胞”相关理论和研究的不断深入，胃癌与肿瘤干细胞相关问题成为研究的热点^[11-14]。

肿瘤干细胞是肿瘤组织中极少数具有自我更新能力，能自我无限增殖的细胞，这群细胞有更强的侵袭、转移能力，能耐受常规的放化疗^[15-19]。现有治疗肿瘤的方法能够在短期内杀死大部分肿瘤细胞，使肿瘤快速缩小，但却无法从根本上治愈肿瘤^[20-21]。

以往，众多学者对胃癌干细胞相关问题进行了分析，并证实了胃癌干细胞的存在^[22-27]。实验选择利用无血清培养体系对人原代胃癌细胞进行球体培养，培养 7 d后观察可见微球体细胞。无血清培养体系的基础为合成培养基，用一定血清替代成分使整个培养体系即可以满足细胞培养的基本需求，同时有效避免使用血清对培养结果造成的影响。在胃癌肿瘤干细胞表面分子标记物方面，目前缺乏特异性的标志物^[28-31]。2009年，Takaishi等^[32]学者首次通过研究指出，CD44可用于对胃癌干细胞进行识别，随后CD44被广泛应用于对胃癌肿瘤干细胞表面分子标记研究。周雨等^[33]从胃癌SGC-7901细胞中利用磁珠分选出CD44⁺胃癌细胞，并通过球状体形成实验和软琼脂集落形成实验等鉴定CD44⁺胃癌细胞的干细胞特性。实验对常规培养人原代胃癌细胞与球体培养人原代胃癌细胞进行CD44免疫荧光检测，两组均可观察到CD44⁺细胞。球体培养获得的细胞中CD44⁺细胞数量显著多于常规培养获得的细胞，提示CD44⁺可能属于胃癌干细胞的标志物。肿瘤干细胞具有高度的成瘤性以及自我更新的特性，可能会导致肿瘤的发生和发展以及转移等^[34]。张海宏等^[35]从胃癌MKN-45细胞株利用荧光活化细胞分选技术获得SP细胞，并通过小鼠体内实验，对这些SP细胞是否具有肿瘤干细胞特性进行分析，实验结果显示，SP细胞具有很强的成瘤能力。在分选肿瘤干细胞的时候，首先利用细胞表面分子标志进行筛选，并对所获得的细胞进行生物学特性分析^[36-37]。实验选择使用免疫磁珠分选法进行细胞分选。免疫磁珠分选是一种高效简捷的分选方法，集合了免疫学、磁力学、细胞生物学等多方面的内容，可以对免疫细胞与其他细胞进行分离，达到细胞纯化的目的，其特异性来自于抗体对抗原的特异性识别^[38-39]。以往有学者以CD133为标志物，利用免疫磁珠分选，成功的从KATO-Ⅲ胃癌细胞中分选出CD133阳性细胞，并用于实验研究^[40]。

肿瘤干细胞不但具有自我更新能力和多向分化潜能等干细胞的一般特性，还具有很强的侵袭性及活体成瘤能力。为了研究分离肿瘤干细胞的成瘤性，实验选择以CD44为标志物对原代胃癌细胞球进行磁珠分选，并将分选所得细胞皮下接种于小鼠腋窝后方，结果显示，球体培养细胞接种小鼠的移植肿瘤体积增长速度明显快于常规培养细胞接种。移植90 d，处死所有小鼠，获得肿瘤标本，观察可发现球体培养细胞接种小鼠的移植肿瘤体积明显大于常规培养细胞接种。分析出现上述结果的原因，可能是因为经过球体培养和分选之后，肿瘤干细胞发生了浓缩和募集，从而获得更强的成瘤特性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程