骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子生物材料在关节软骨
缺损修复中的生物性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.20.004

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
骨形态发生蛋白：1963年由美国的Marshall R.Urist教授发现的，具有能够诱导动物或人体间充质细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织的作用。
骨形态发生蛋白与碱性成纤维细胞生长因子复合的生物材料：①骨形态发生蛋白及碱性成纤维细胞生长因子均具有诱导形成软骨的活性，促进关节内透明软骨再生的作用，但能力较弱，不能诱导关节软骨形成。②骨形态发生蛋白/碱性成纤维细胞生长因子复合物能促进关节软骨形成，较单独应用骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子效果好，是生物学修复关节软骨缺损的良好方法。

摘要
背景：众多的实验中发现了多种细胞因子通过自分泌和旁分泌等不同方式调节软骨和骨的生成。
目的：分析骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子生物材料在关节软骨缺损修复中的生物性能。
方法：选取40只新西兰家兔，随机分为4组，纤维蛋白组、碱性成纤维细胞生长因子组、骨形态发生蛋白组、复合组(骨形态发生蛋白+碱性成纤维细胞生长因子)，每组10只。建立兔关节软骨缺损模型，止血彻底后将纤维蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白以及骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子复合等材料组成的支架分别植入缺损部位。比较不同注射材料在家兔关节软骨缺损中的效果及复合材料的生物性能。
结果与结论：①关节软骨缺损修复情况：纤维蛋白组2只家兔出现跛行；碱性成纤维细胞生长因子组1只家兔活动受限；骨形态发生蛋白组出现1只跛行，1只活动受限；复合组兔恢复良好，膝关节和手术前相比差异无显著性意义(P < 0.05)。②大体观察：复合组家兔软解软骨缺损消失，内有新生血管，软骨和正常组织十分接近；骨形态发生蛋白组关节软骨边际存在裂隙，未能与正常的软骨组织紧密结合，光镜下能够看见缺损区周缘存在软骨细胞；纤维蛋白组缺损部位和周围组织基本愈合；碱性成纤维细胞生长因子组缺损部位有所修复，但不光滑。③苏木精-伊红染色结果：纤维蛋白组兔缺损部位未被修复，表面存在明显凹陷；碱性成纤维细胞生长因子组缺损部位被明显修复，缺损部位存在大量软骨细胞；骨形态发生蛋白组被修复，出现软骨细胞，但排列不规则；复合组修复良好，出现大量软骨细胞。④结果提示，骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子生物材料是关节软骨缺损中比较理想的修复材料，能够发挥骨形态发生蛋白诱导形成软骨的活性，能够发挥碱性成纤维细胞生长因子提高软骨细胞增生作用，可以达到优势互补，促进关节软骨缺损的恢复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-0170-1787(董君博)

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 骨形态发生蛋白, 碱性成纤维细胞生长因子, 生物材料, 关节软骨缺损, 生物性能, 膝关节, 软骨细胞, 修复材料

Abstract:

BACKGROUND: Articular cartilage regeneration can be regulated by autocrine or paracrine secretion of various cytokines.
OBJECTIVE: To analyze biological properties of bone morphogenetic proteins and basic fibroblast growth factor in biological materials for repair of articular cartilage defect.
METHODS: Forty New Zealand white rabbits were used and equally randomized into four groups: fibrin, basic fibroblast growth factor, bone morphogenetic protein, and combined treatment (basic fibroblast growth factor combined with bone morphogenetic protein) groups, respectively. Bioactive scaffolds with fibrin, basic fibroblast growth factor, bone morphogenetic protein, and basic fibroblast growth factor combined with bone morphogenetic protein were injected to repair the articular cartilage defect. Therapeutic effect and biological properties of biological materials were compared.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In the fibrin group, two rabbits appeared to have limps. In the basic fibroblast growth factor group hand function was limited in one rabbit. In the bone morphogenetic protein group, one had a limp and one was in a limitation of activity. In the combined treatment group, rabbits recovered well and showed no differences in the knee joint before and after surgery (P < 0.05). (2) General observation: In the combined treatment group, soft solution cartilage defects disappeared, and angiogenesis and cartilage were similar with normal tissues. In the bone morphogenetic protein group, fractured cartilage marginal existed and could not be closely integrated with normal cartilage. The presence of chondrocytes in the periphery of the defect was seen under light microscope. In the fibrin group, defect site and surrounding tissues healed. In the basic fibroblast growth factor group, defect was repaired, but not smooth. (3) Results of hematoxylin and eosin staining: In the fibrin group, the bone defect was not repaired, obvious depression surface was seen. In basic fibroblast growth factor group, repair of cartilage defect was obvious. There were a lot of chondrocytes. In the bone morphogenetic protein group, the bone defect was repaired; chondrocytes appeared, but irregular arrangement. In the combined treatment group, good bone defect repair and a large number of cartilage cells were seen. Taken together, biological materials with fibrin and basic fibroblast growth factor are ideal for repair of articular cartilage defect by promoting formation of cartilage by bone morphogenetic protein and enhancing chondrocyte proliferation by basic fibroblast growth factor.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-0170-1787(董君博)

Key words: Joints, Cartilage, Bone Morphogenetic Proteins, Fibroblast Growth Fator2

中图分类号:

R318

董君博1，2. 骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子生物材料在关节软骨
缺损修复中的生物性能[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(20): 2915-2920.

Dong Jun-bo1, 2. Biological properties of bone morphogenetic proteins and basic fibroblast growth factor in biological materials for repair of articular cartilage defect[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(20): 2915-2920.

图/表（结果） 2

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引言

关节软骨缺损是临床上常见的疾病，这种疾病发生率较高，患者发病后容易引起关节疼痛、运动障碍等，且患者发病早期不采取积极有效方法治疗将会最终引起骨性关节炎和关节软骨缺损。目前，临床上对于关节软骨缺损更多的以组织修复为主，临床上关节软骨修复损伤的修复分为两种，即刺激软骨组织自身修复和组织细胞移植方法。刺激软骨组织自身修复则又包括了清创术、灌洗法、磨造术等；组织细胞移植则又包括了软骨移植、软骨细胞及间充质细胞移植等^[1]。钻孔修复的软骨面积相抵比较小，临床上使用时容易受到限制，而骨膜/软骨膜发生层往往伴有未分化的间充质细胞，但是这些细胞由于自身所处的环境等又可以分为骨细胞或软骨细胞。刺激软骨组织自身修复使用范围相对较窄，能够修复的缺损面积相对较小，而组织细胞移植方法又会受到医院的医疗条件、专业技能在，在获取种子细胞、培养、增殖等相对比较复杂^[2-3]。

随着细胞研究的不断深入，众多的实验中发现了多种细胞因子通过自分泌和旁分泌等不同方式调节软骨和节骨的生成，常见的包括：骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子等^[3-4]，这些细胞生长因子等通过增加软骨组织DAN合成，能够有效促进软骨细胞的增殖，来影响软骨的增殖。但是，临床上对于生物因子的使用方式及其效果尚存在较大的争议。部分学者认为：单纯应用生物因子效果不佳，应该将它与种子细胞融合在一起；但是也有学者认为：骨形态发生蛋白的效果不如碱性成纤维细胞因子。骨形态发生蛋白是一类相对比较特殊的蛋白，具有诱导分化间充质细胞分化能力，从而能够促进软骨并形成新生骨等作用^[5-6]。而碱性成纤维细胞生长因子在人体组织中广泛存在，能够对机体骨和软骨修复发挥重要的作用，并且该因子还能够进一步促进软骨细胞前质的分化，提高软骨细胞增生及成熟，更加有利于缺损部位的修复^[7-8]。但是，当前的研究更多的趋于单一材料在关节软骨缺损中的修复，对于二者的复合材料缺乏研究^[8]。

文章从2015年1至8月南阳医学高等专科学校进行的40只新西兰家兔实验资料进行分析，探讨骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子生物材料在关节软骨缺损修复中应用，分析二者复合生物材料的生物性能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点于2015年1月至8月在南阳医学高等专科学校完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 40只新西兰家兔，体质量为1.3- 2.0 kg，平均(1.50±0.05) kg，雌雄随机，饲养严格遵守相关标准进行饲养。对家兔进行等条件喂养，实验中对家兔的处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规则^[2^，^9]。采用随机对照方法将家兔分为纤维蛋白组、碱性成纤维细胞生长因子组、骨形态发生蛋白组以及骨形态发生蛋白+碱性成纤维细胞生长因子组(复合组)，每组10只。

1.3.2 主要仪器和试剂冻干人纤维蛋白原(上海莱士血制品有限公司)；凝血酶原(武汉海特生物制药股份有限公司)；DAB 显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司)；苏木精染色剂(日本Nikon公司)；显微镜(OlympusCX31RBSF 型，烟台正海生物技术有限公司)；快速混匀器(XK96-A 型，Beckman Coulter 公司)。

1.3.3 材料的制备 ①精确称取140 g骨水泥，将其溶入到28 mL蒸馏水中，分为40份，烘干、消毒，备用。②精确称取1 μg碱性成纤维细胞生长因子混合140 g PVP并将其溶入到28 mL蒸馏水中，分为40份，烘干、消毒，备用^[10-11]。③精确天平称取28 mg骨形态发生蛋白溶于28 mL浓度为4 mol/L的盐酸胍、10 mL浓度为0.5 mol/L的氯化钙溶液中，将溶液分成2份。向溶液中加入140 g PVP后分成20份，另一份溶液中加入140 μg碱性成纤维细胞生长因子与140 g PVP后分成20份，晾干，消毒备用^[12-13]。

1.4 实验方法

1.4.1 建立兔关节软骨缺损模型将入选家兔均采用3.0%戊巴比妥全身麻醉(耳垂静脉麻醉)，待麻醉生效后进行消毒、铺巾。将4组所需要的支架等进行辐射消毒。在家兔左膝关节内侧做一个小切口，充分暴露其股骨滑车关节面，并采用滑车关节制造一个直径为4 mm圆形全层软骨缺损，深度为3 mm，建立缺口黏膜缺损模型(见图1)^[14-15]。

1.4.2 分组处理止血彻底后将纤维蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白以及骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子复合等材料组成的支架分别植入缺损部位^[16-17]。手术后，每周采用碘伏对家兔手术切口进行一次消毒^[18]。

1.5 主要观察指标

1.5.1 术后关节软骨缺损修复情况家兔手术后进行常规饲养，观察4组家兔活动情况、行走以及活动是否受限等。

1.5.2 大体观察术后10周观察4组家兔关节软骨缺损情况、关节面的光滑程度，以及光镜下缺损部位软骨质保情况、是否有新生血管等^[19-20]。

1.5.3 苏木精-伊红染色光镜观察 4组家兔手术后4周随机每组抽取1只家兔，选取关节缺损部位组织，进行石蜡切片，并采用苏木精进行2 min染色，采用蒸馏水冲洗1 min后，利用1%盐酸乙醇进行分化，采用伊红染色进行2 min染色，常规脱水，并采用中性树胶封固，在显微镜下观察4组家兔缺损部位组织修复情况^[2^，^21]。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件对采集到的数据进行分析，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，存在统计学意义予以LSD法两两比较。P < 0.05提示经比较两组数据间差异有显著性意义。

讨论

创伤、骨关节病等均为比较常见的骨科疾病，在这些疾病的影响下均会造成关节软骨发生缺损。由于关节软骨的特殊性，成熟的关节软骨并没有血管、淋巴管以及神经组织等，其获得的营养更多的来源于滑液^[22-23]。再加上关节软骨不仅进行正常的有丝分裂，导致关节软骨缺乏自我修复能力。相关学者进行了较多的研究^[24-25]，研究中更多的采用软骨膜移植、骨膜移植等方法对关节软骨缺损中进行修复，但是这些修复方法相对比较单一，并未能获得理想的修复效果，影响膝关节功能。国外学者认为：成形术只能提供一个无痛或者疼痛相对较轻的具有一定活动幅度的关节^[26-27]，并不能适应所有的关节软骨缺损修复需要。再加上，肢体骨软骨移植治疗关节软骨缺损的远、近疗效较高，但是这种移植方法也存在一定的缺陷，患者修复后也会存在其他并发症，如：退变、感染等^[28-29]。

近年来，随着医疗技术的飞速发展，组织工程方法在关节软骨缺损中得到应用，该方法和其他修复方法相比优势较多，它适合修复各种形状的关节软骨缺损，具有其独特性^[30-31]。再加上细胞软组织技术的发展等，骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子生物材料在关节软骨缺损中得到应用^[32-33]。骨形态发生蛋白属于是一类特殊的蛋白，能够促进新生骨形成，其生物性能比较良好，能够在体外诱导关节腔内脂肪组织以及其他组织进一步转化。碱性成纤维细胞生长因子则能够促进入股细胞前质的分化，提高骨形态发生蛋白诱导，增加成骨量^[34]。

关节软骨缺损是一个相对比较复杂的过程，该过程中涉及到多种细胞因子，骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子生物材料的应用能够进一步促进关节面光滑、完成、更加富有弹性^[35]。相关学者进行一次实验，结果显示：关节软骨缺损中采用骨膜移植后27%的新生组织存在明显的裂纹，并且成骨厚度达不到预期的厚度，9%与周围组织连接不完整，成功率仅有17%^[36]。而骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子生物材料的应用则能够发挥两种不同材料的优势，既能够发挥骨形态发生蛋白成骨活性，促进关节内透明软骨的进一步再生，又能够发挥碱性成纤维细胞生长因子形成作用，达到优势互补，从而能够提高关节软骨缺损修复效果。

综上所述，骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子生物材料是关节软骨缺损中比较理想的修复材料，它既能够发挥骨形态发生蛋白诱导形成软骨的活性，同时还能够发挥碱性成纤维细胞生长因子提高软骨细胞增生作用，可以达到优势互补，促进关节软骨缺损恢复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程