骨髓间充质干细胞移植对大鼠胃癌前病变模型的修复作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.014

摘要/Abstract

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文题释义：

胃癌前病变：指一类容易发生癌变的胃黏膜病理组织学变化，即胃黏膜的异型增生和肠上皮化生，主要伴存于慢性萎缩性胃炎。胃癌的癌前状态包括肠化和不典型增生，肠化指胃黏膜被肠型黏膜所代替。肠化有小肠型和大肠型。大肠型又称不完全肠化，推测其酶系统不健全而使被吸收的致癌物质在局部累积，导致细胞的不典型增生可发生突变成癌。

血管内皮生长因子：也称血管通透性因子或促血管素，最初是在多种培养的肿瘤细胞系中发现的一种新型的生长因子，它能增加微血管与小静脉血管的通透性。后来发现，该因子特异性地作用于血管内皮细胞，并促进血管内皮细胞的增殖，所以定名为血管内皮生长因子。

背景：胃癌前病变是多种因素共同参与的长期发展过程，骨髓间充质干细胞有修复组织损伤的作用。

目的：探讨骨髓间充质干细胞移植对大鼠胃癌前病变的影响。

方法：将36只Wistar大鼠随机分为对照组、模型组和移植组。模型组和移植组建立大鼠胃癌前病变模型，移植组大鼠经尾静脉注射1 mL CM-dil标记的骨髓间充质干细胞(3 ×10⁶个细胞)，每周注射1次，一共3次，模型组和对照组同样方法经尾静脉注入等量的生理盐水。末次注射后1周处死大鼠，观察大鼠胃组织病理变化，检测胃黏膜中血管内皮生长因子的表达以及血清中细胞因子含量。

结果与结论：①移植组大鼠胃黏膜损伤较模型组轻，移植组血管内皮生长因子表达明显高于模型组和对照组(P < 0.05)；②模型组和移植组血清白细胞介素17和γ-干扰素水平高于对照组(P < 0.05)，移植组血清白细胞介素17和γ-干扰素水平低于模型组(P < 0.05)；③结果表明，骨髓间充质干细胞通过增加胃黏膜病变部位血管内皮生长因子的表达，降低血清白细胞介素17和γ-干扰素水平，从而提高血管通透性，减轻炎症反应，阻断或者缓解癌前病变的发生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-5298-9207(刘洪锋)

关键词: 干细胞, 移植, 胃癌前病变, 骨髓间充质干细胞, 细胞移植, 细胞因子, 血管内皮生长因子

Abstract:

BACKGROUND: Precancerous lesions are a long-term development process in which many factors are involved. Bone marrow mesenchymal stem cells can repair tissue injury.

OBJECTIVE: To investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on gastric precancerous lesions in the rats.

METHODS: Thirty-six Wistar rats were randomly divided into control group, model group and transplantation group. Animal models of gastric precancerous lesions were established in the model and transplantation groups. Rats in the transplantation group were given 1 mL of CM-dil-labeled bone marrow mesenchymal stem cells (3×10⁶ cells) via the tail vein, once a week, totally three times. Rats in the model and control group were subjected to the tail vein injection of the same volume of normal saline. Then, rats were sacrificed 1 week after final injection, and pathohistological changes in rat gastric tissue sections were observed. The expression of vascular endothelial growth factor in the gastric mucosa and levels of serum cytokines were detected.

RESULTS AND CONCLUSION: The severity of gastric mucosal injury in the transplantation group was lighter than that of the model group. The expression of vascular endothelial growth factor was significantly higher in the transplantation group compared with the model and control groups (P < 0.05). The levels of serum interleukin-17 and interferon-γ were significantly higher in the model group than the transplantation group followed by the control group (both P < 0.05). Therefore, bone marrow mesenchymal stem cells can increase vascular permeability, reduce inflammation, block or ease the occurrence of precancerous lesions by up-regulating the expression of vascular endothelial growth factor in the gastric mucosa lesions and reducing the expression of interleukin-17 and interferon-γ.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Precancerous Conditions, Gastric Mucosa, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Vascular Endothelial Growth Factors, Tissue Engineering

刘洪锋，李潞. 骨髓间充质干细胞移植对大鼠胃癌前病变模型的修复作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(14): 2073-2079.

Liu Hong-feng, Li Lu. Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for gastric precancerous lesions in a rat model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(14): 2073-2079.

图/表（结果） 5

2.1 骨髓间充质干细胞生长情况接种24 h后部分细胞已经贴壁，接种48 h后贴壁细胞呈多角形、短棒形或者圆形。第3天换液清除大部分悬浮细胞后贴壁细胞迅速增殖，呈纺锤形或梭形，部分细胞形成集落，接种1周时细胞增殖加快，形成大小不等的集落，集落融合成片，折光性强，细胞形态多为纺锤形或者多角形，接种12 d时细胞80%-90%融合，铺满瓶底，开始传代。传代培养24 h细胞完全贴壁生长，分布均匀，呈梭形，传代至第3代时，细胞形态均一，呈辐射状或者漩涡状，见图2。

2.2 流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记物表达第3代骨髓间充质干细胞表面标记物CD29，CD44，CD45，CD90的阳性表达率为94.35%，69.88%，11.21%，94.41%，由此可见骨髓间充质干细胞是不同于造血干细胞的一群干细胞。

2.3 骨髓间充质干细胞的CM-dil标记情况荧光显微镜下看到CM-dil标记的骨髓间充质干细胞呈现红色荧光，CM-dil阳性标记率为94%。倒置相差显微镜下看到CM-dil标记的骨髓间充质干细胞形态比较均一，生长状态良好，呈三角形、梭形或者多角形，未发现CM-dil标记对细胞生长产生影响，随着传代培养，CM-dil标记的荧光有一定程度的减弱，3周内仍能看到CM-dil标记的红色荧光。

2.4 骨髓间充质干细胞移植后胃组织形态变化

大体观察发现：对照组大鼠胃黏膜呈现浅红色，表面光滑，弹性好，皱襞规则整齐，表面覆盖黏液。模型组大鼠胃黏膜红白相间或者苍白色，黏膜表面比较平坦，皱襞减少。移植组大鼠的胃黏膜病变介于对照组和模型组之间。

病理组织学观察发现：对照组大鼠胃黏膜上皮比较完整，腺体紧密排列，细胞均一，见散在淋巴细胞。模型组大鼠胃黏膜见大量炎症细胞浸润，腺体减少，结构紊乱，腺上皮消失，细胞形态不规则，细胞核增大、排列紊乱。移植组的病理组织学改变介于对照组和模型组之间(图3)。

2.5 CM-dil标记的骨髓间充质干细胞在大鼠胃内的定植情况 CM-dil标记的骨髓间充质干细胞移植后第7天，大鼠的胃组织切片中看到CM-dil标记细胞呈红色荧光，DAPI染色细胞核呈蓝色荧光，标记细胞主要出现在胃窦部和胃体部，胃底部未见荧光标记细胞(图4)。

2.6 各组大鼠胃黏膜血管内皮生长因子的表达血管内皮生长因子主要在细胞膜和细胞质上表达。移植组血管内皮生长因子吸光度值(0.55±0.02)明显高于模型组(0.30±0.03)和对照组(0.17±0.01)(P < 0.05)，模型组血管内皮生长因子吸光度值明显高于对照组(P < 0.05)。

2.7 各组大鼠血清白细胞介素17，白细胞介素4，白细胞介素10，γ-干扰素水平比较由表1可以看出，模型组和移植组血清白细胞介素17和γ-干扰素水平高于对照组(P < 0.05)，移植组血清白细胞介素17和γ-干扰素水平低于模型组(P < 0.05)；移植组血清白细胞介素4和白细胞介素10水平高于模型组，模型组血清白细胞介素4和白细胞介素10水平高于对照组，但3组之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计动物实验随机对照研究。

1.2 时间及地点实验于2013年3月至2014年9月在郑州大学第二附属医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物健康雄性6周龄Wistar大鼠41只(5只用于分离培养骨髓间充质干细胞，36只用于动物造模)，清洁级，体质量180-210 g，均购自河南省实验动物中心。实验前适应性饲养1周。实验大鼠符合卫生部一级动物标准，并经过动物伦理学委员会批准。

1.3.2 实验试剂 1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(MNNG) (日本TCI公司)；胎牛血清、EDTA-胰蛋白酶(Gibco公司)；注射用链霉素、青霉素钠(山东鲁抗股份有限公司)；LG-DMEM培养基(Hyclone公司)；PBS干粉、防荧光淬灭封固剂、多聚赖氨酸防脱载玻片、枸橼酸盐缓冲液粉剂、抗体稀释液(北京博奥森生物技术有限公司)；DAPI(德国Roche公司)；APC标记抗小鼠/大鼠CD29单克隆抗体(美国ABD公司)；FITC 标记抗大鼠CD44单克隆抗体、小鼠抗大鼠VEGF单克隆抗体(美国BD公司)；PerCP/Cy5.5标记抗大鼠CD45单克隆抗体(美国BioLegend 公司)；PE标记抗大鼠CD90单克隆抗体(美国BioLegend公司)；CM-dil(美国 Molecular Probes公司)；Pan-keratin 抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；OCT冰冻切片包埋剂(美国 Molecular Probes公司)；山羊血清(北京中杉金桥生物技术有限公司)；丙酮(北京化学试剂公司)；鼠兔通用型二抗试剂盒(美国Cell Signaling Technology公司)；体积分数为30%H₂O₂溶液(北京化学试剂公司)；PE标记的抗大鼠IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10抗体(美国eBioscience公司)；FITC标记的山羊抗小鼠二抗、TritonX-100、Vimentin抗体、MTT(美国Sigma公司)等。

1.3.3 实验器械与仪器超净工作台(苏州净化设备厂)；二氧化碳培养箱(德国Heraeus Biofuge Stratos 公司)；培养皿、离心管、培养瓶、玻璃吸管、分装瓶、EP管、96孔细胞培养板(美国Coring公司)；微量加液器及吸头(Finnpipette)；细胞计数板(上海玉光光学仪器厂)；电子分析天平(梅特勒-托利多仪器)；电热恒温水槽(北京市长风仪器仪表公司)；台式离心机(美国Beckman L8-80)；显微数码照相系统、生物倒置显微镜(日本Olympus)；流式细胞仪(美国BD公司)；4 ℃/-20 ℃冰箱(青岛海尔集团)；PHS-3E型精密酸度计(上海雷磁分析仪器公司)；石蜡切片机(德国Leica公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离培养将6周龄5只Wistar大鼠脱颈处死，乙醇浸泡进行消毒，无菌条件下剪开皮肤，分离股骨和胫骨，1 mL注射器抽取LG-DMEM冲洗股骨和胫骨骨髓腔，收集骨髓细胞，滤网过滤后将制成的细胞悬液放入离心管离心，弃去上清液，重悬细胞，然后接种到LG-DMEM培养液中培养，第3天进行首次换液，除去没有贴壁细胞，以后每两三天进行1次换液，每天观察细胞的生长情况，细胞生长至80%-90%融合时用胰蛋白酶消化，待纤维样细胞变圆时终止消化，离心，弃去上清液，接种于培养皿中培养，每3 d进行1次换液，每天观察细胞的生长情况，待细胞融合至80%-90%时重复进行传代培养。

1.4.2 骨髓间充质干细胞的鉴定取第3代大鼠骨髓间充质干细胞进行消化，离心，洗涤后，PBS重悬，加入抗体CD29、抗体CD44、抗体CD45、抗体90及其同型对照，上流式细胞仪检测。

1.4.3 CM-dil标记骨髓间充质干细胞取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，PBS洗涤，胰蛋白酶消化，待细胞变圆时终止消化，制成单细胞悬液，移入离心管离心，弃去上清液，PBS悬浮细胞，再离心，弃去上清液，PBS悬浮细胞，取1×10⁶个细胞加入3 μL CM-dil工作液中孵育，PBS重悬细胞，离心，弃去上清液，加入LG-DMEM重悬细胞，接种于培养皿中培养。

1.4.4 CM-dil标记效果 CM-dil标记24 h后，倒置相差显微镜和荧光显微镜下观察骨髓间充质干细胞的标记情况和细胞形态，镜下随机选5个视野，计算每个视野的细胞总数以及CM-dil阳性细胞数，取其平均值，CM-dil标记率=每个视野CM-dil阳性细胞数/每个视野细胞总数×100%。

1.4.5 动物分组将36只Wistar大鼠随机分为对照组、模型组和移植组，每组12只。

1.4.6 动物模型的建立模型组和移植组大鼠自由饮用1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(MNNG)水(100 mg/L)，每星期换液1次，按正常进食标准饲料。对照组大鼠用清洁自来水代替1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍水自由饮用，按正常进食标准饲料，共饮用4周。造模成功标准：局部腺体变薄，出现萎缩，排列紊乱；大量炎性细胞浸润；细胞核变大，染色加深(图1)。

1.4.7 骨髓间充质干细胞移植饮用后第28天，移植组大鼠经尾静脉注射移植1 mL CM-dil标记的骨髓间充质干细胞(3×10⁶个细胞)，每星期注射1次，一共3次，模型组和对照组同样方法经尾静脉注入等量的生理盐水。

1.4.8 大鼠取材各组大鼠第3次注射后第7天，水合氯醛麻醉处死大鼠，取出心脏血分离血清，取出胃，在病变明显处取材，经甲醛固定，石蜡包埋，切成0.5 mm厚的切片，行免疫组化和苏木精-伊红染色。同时去胃窦、胃体和胃底部位同样方法制成冰冻切片，显微镜下观察CM-dil标记细胞及其位置。

1.4.9 大鼠胃组织标本苏木精-伊红染色石蜡切片二甲苯脱蜡，乙醇和蒸馏水洗涤，苏木精溶液染色，乙醇分色，流水冲洗，显微镜下见蓝染细胞核，蒸馏水冲洗，酸化伊红复染，细胞质呈红染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.4.10 CM-dil标记的骨髓间充质干细胞示踪荧光免疫双染法检测CM-dil标记的骨髓间充质干细胞，OCT包埋胃组织标本，将其贴在多聚赖氨酸处理的玻片上，冰丙酮固定，PBS洗涤，TritonX-100透化破膜，PBS洗涤，DAPI染液染核，PBS洗涤，显微镜下观察拍照，骨髓间充质干细胞经CM-dil标记后胞浆呈红色荧光，经DAPI染色后细胞核呈蓝色荧光，红色和蓝色荧光重叠为骨髓间充质干细胞定植。

1.4.11 采用免疫组化法检测胃黏膜中血管内皮生长因子的表达石蜡切片厚5 μm，烤箱烘烤，二甲苯、乙醇脱蜡，PBS洗涤，柠檬酸盐缓冲液煮沸修复抗原，PBS洗涤，H₂O₂阻断过氧化物酶活性，PBS洗涤，加入小鼠抗大鼠稀释的VEGF过夜孵育，PBS洗涤，加入二抗孵育，PBS洗涤，加入DAB显色，自来水冲洗，苏木精衬染，自来水冲洗，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，高倍镜下选3个视野观察，取平均值，胞浆中有棕黄色颗粒的为血管内皮生长因子阳性细胞，应用图像分析软件得出血管内皮生长因子表达的平均吸光度值。

1.4.12 血清白细胞介素17、白细胞介素4、白细胞介素10及γ-干扰素水平测定留取大鼠心脏血液，离心后取上清液，采用流式细胞术测定白细胞介素17，白细胞介素4，白细胞介素10，γ-干扰素水平。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞形态及标记情况。②胃组织病理形态。③胃组织血管内皮生长因子的表达。④血清白细胞介素17、白细胞介素4、白细胞介素10及γ-干扰素水平。

1.6 统计学分析所有数据输入SPSS 18.0软件进行处理，计量资料用x(_)±s表示，两样本均数比较采用t 检验，组间两两比较用SNK法，非正态分布用秩和检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

胃癌的发生率和死亡率比较高^[1]，对人类健康造成严重威胁。胃癌的发生发展需要一个过程，癌前病变是指病变部位细胞具有恶性肿瘤细胞特性，但结构改变只局限在表皮内或者腺管内，未穿透基底膜向周围组织浸润，有效治疗胃癌前病变可以阻止胃癌的发生发展。胃癌前病变的诊断技术在不断发展，胃镜下亚甲蓝染色对胃癌前病变具有诊断意义^[2]，胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ结合胃镜检查可以提高胃癌前病变的检出率^[3]，胃小凹形态、微血管变化、PCNA和P53联合有助于胃癌前病变的诊断^[4]，胃癌前病变需要病理检查明确。胃癌前病变模型的建立有马兜铃酸建模^[5]、MNNG建模等^[6-7]。目前对于胃癌前病变的研究不断向分子、细胞水平发展，研究显示红藤愈萎养胃汤可以影响胃癌相关抗原MG7和胃蛋白酶原的表达^[8]；环氧合酶2和细胞角蛋白20在胃癌前病变中的表达增加^[9]；在胃癌前病变中，抑癌基因Rb表达下降，癌基因C-rebB-2表达上升^[10]；iNOS和白细胞介素10的表达与胃癌的发生有关^[11]。胃癌前病变的治疗目前西医没有有效的治疗药物，中医药治疗胃癌前病变只能改善临床症状，提高疗效，并不能从根本上解决问题^[12-13]。骨髓干细胞在组织损伤修复中得到广泛应用，为胃癌前病变的治疗提供了新的思路。

骨髓间充质干细胞具有强大的分化增殖能力，在一定条件下可能分化为多种细胞^[14]，且其取材方便，容易分离培养，免疫排斥反应小，是目前组织工程和基因工程比较理想的种子细胞，在多种疾病的治疗中有诱人的应用前景^[15-16]。骨髓间充质干细胞原代培养24 h开始出现贴壁生长，随着培养时间延长，开始出现融合，传代培养增殖能力增加，传代培养至第2代时细胞排列出现明显的方向性^[17]。骨髓间充质干细胞在一定条件下可以诱导分化为骨样细胞和软骨样细胞、神经元样细胞、胰岛素分泌细胞、心肌样细胞和干细胞样细胞等^[18-23]。骨髓间充质干细胞成为糖尿病、心肌梗死、炎症性肠病、自身免疫性疾病等多种疾病治疗中的理想种子细胞，在胃病中的研究比较少，主要集中于胃损伤的研究。

骨髓间充质干细胞在体外诱导可以分化为胃上皮细胞，体内可以定植到胃损伤黏膜参与黏膜的修复^[24]，经尾静脉移植治疗可以提高血管内皮生长因子水平促进胃溃疡愈合^[25]，还可以促进增殖，识别异体抗原，分泌细胞生长因子，减少炎症，促进新生血管形成^[26-28]。骨髓间充质干细胞还具有向损伤组织部位趋化的特性，体外实验显示骨髓间充质干细胞可以分化为上皮细胞和间质细胞^[29]。实验发现骨髓间充质干细胞可以定植到胃癌前病变大鼠的胃窦和胃体部，可以保护胃黏膜损伤。血管内皮生长因子能够提高血管通透性，诱导新生血管形成，保护胃黏膜，参与炎症反应和损伤修复^[30]，实验结果发现移植组和模型组血管内皮生长因子的表达上升，且移植组血管内皮生长因子的表达高于模型组，由此可见，局部炎症应激刺激可以促进血管内皮生长因子表达的增加，骨髓间充质干细胞移植后，局部炎症促进骨髓间充质干细胞迁移至损伤部位，骨髓间充质干细胞同时促进血管内皮生长因子的分泌，从而起到对局部组织的修复作用。骨髓间充质干细胞还具有免疫调节作用和低免疫原性，其免疫调节和免疫原性与Th17、白细胞介素4、白细胞介素10、白细胞介素17、γ-干扰素等细胞因子的表达有关，白细胞介素17、γ-干扰素与胃癌的发生发展有关^[31-34]，实验结果发现模型组和移植组白细胞介素17和γ-干扰素水平均明显高于对照组，其中移植组白细胞介素17和γ-干扰素水平低于模型组，由此可见，白细胞介素17和γ-干扰素属于致炎因子，促进多种细胞因子产生，骨髓间充质干细胞移植治疗后可以减少白细胞介素17和γ-干扰素水平，从而调节免疫功能，减少炎症反应，延缓胃癌前病变的发展。

综上所述，骨髓间充质干细胞移植可以保护胃癌前病变大鼠的胃黏膜，其机制可能为骨髓间充质干细胞增加病变部位血管内皮生长因子的表达，降低血清白细胞介素17和γ-干扰素水平，从而提高血管通透性，减轻炎症反应，阻断或者延缓癌前病变的发生。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程