富血小板纤维蛋白诱导口腔缺损软组织的修复与再生

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.07.006

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (7): 957-965.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.07.006

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富血小板纤维蛋白诱导口腔缺损软组织的修复与再生

王拓^1，2，杨琴秋³，董露⁴，肖琼⁵，陈红亮²，孙勇²，钟科²

¹西南医科大学口腔医学院，四川省泸州市 646000；²解放军成都军区机关医院口腔科，四川省成都市 610041；³遂宁市第一人民医院口腔科，四川省遂宁市 629000；⁴凉山彝族自治州第一人民医院口腔科，四川省西昌市 615000；⁵重庆拜博口腔医院管理有限公司九龙坡口腔医院，重庆市 400000

收稿日期:2016-01-04 出版日期:2016-02-12 发布日期:2016-02-12
通讯作者: 孙勇，教授，主任医师，硕士生导师，解放军成都军区机关医院口腔科，四川省成都市 610041
作者简介:王拓，女，1990年生，四川省广安市人，汉族，西南医科大学在读硕士，医师，主要从事口腔种植义齿修复的研究。
基金资助:
成都军区“十二五”科研面上项目(C14050)

Platelet-rich fibrin for repair of oral soft tissue defects

Wang Tuo^{1, 2}, Yang Qin-qiu³, Dong Lu⁴, Xiao Qiong⁵, Chen Hong-liang², Sun Yong², Zhong Ke²

¹School of Stomatology, Sichuan Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; ²Department of Stomatology, the Authority Hospital of Chengdu Military Region of PLA, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; ³Department of Stomatology, the First People’s Hospital of Suining, Suining 629000, Sichuan Province, China; ⁴Department of Stomatology, the First People’s Hospital of Liangshan Yi Autonomous Prefecture, Xichang 615000, Sichuan Province, China; ⁵Jiulongpo Dental Hospital of Chongqing Bybo Dental Hospital Administrative Limited Company, Chongqing 400000, China

Received:2016-01-04 Online:2016-02-12 Published:2016-02-12
Contact: Sun Yong, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Stomatology, the Authority Hospital of Chengdu Military Region of PLA, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
About author:Wang Tuo, Studying for master’s degree, Physician, School of Stomatology, Sichuan Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Department of Stomatology, the Authority Hospital of Chengdu Military Region of PLA, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
Supported by:
the “Twelfth Five-Year” Scientific Research Projects of Chengdu Military Region, No. C14050

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

富血小板纤维蛋白：2000年由法国科学家Choukroun及其同事首先报道，是血液经低速离心获得的血小板浓缩物，富含白细胞、生长因子、纤维蛋白等有利于愈合和免疫的组分，能促进软硬组织的再生。

口腔种植领域应用富血小板纤维蛋白：①取自自体，具有生物安全性。②富含血小板及生长因子等能促进软硬组织再生。③具有抗感染和减轻炎症反应的作用。④制备简单容易操作。

背景：口腔种植术区软组织量不足可能对创面愈合和后期美学修复带来不利影响。富血小板纤维蛋白能促进软组织缺损创面的愈合进程，但目前尚缺乏深入探讨其促进口腔软组织缺损修复的动物实验。

目的：对比观察富血小板纤维蛋白和胶原生物膜修复新西兰兔硬腭软组织缺损的效果。

方法：将54只新西兰兔随机分为3组，分别为富血小板纤维蛋白组、胶原膜组和空白对照组，每组18只。每只实验兔均于硬腭前部中份，分别距上颌后排门齿、左右硬腭黏膜边缘2 mm处以直径为5 mm的组织环切钻制备圆形软组织全层缺损区。富血小板纤维蛋白膜组、胶原膜组分别于缺损处植入自体富血小板纤维蛋白膜和胶原生物膜，空白对照组创面不予任何处理。在术后3，7，14，21，28，56 d对创面进行大体观察并作创面愈合率分析；术区取材后行苏木精-伊红染色、CD31免疫组织化学染色和Masson染色分别观察术区炎性反应、血管生成和胶原形成情况。

结果与结论：①创面愈合率：富血小板纤维蛋白组创面愈合速度最快，且无明显瘢痕形成。术后3 d各组的创面愈合率无显著差异。术后7 d富血小板纤维蛋白组创面愈合率大于胶原膜组和空白对照组(P < 0.05)。②炎性反应：术后3，7 d，富血小板纤维蛋白组炎性反应均小于胶原膜组和空白对照组(P < 0.05)；术后14，21，28，56 d，3组炎症情况差异无显著性意义。③新生血管评价以CD31平均吸光度值分析：术后7，14，21 d，富血小板纤维蛋白组CD31平均吸光度值高于胶原膜组和空白对照组(P < 0.05)。④胶原纤维形成以平均吸光度值分析：术后7 d，富血小板纤维蛋白组胶原纤维平均吸光度值高于胶原膜组和空白对照组(P < 0.05)；术后14 d，富血小板纤维蛋白组胶原纤维平均吸光度值高于空白对照组(P < 0.05)；术后21，28，56 d，富血小板纤维蛋白组胶原纤维平均吸光度值低于其他2组(P < 0.05)。结果证实，富血小板纤维蛋白能减轻创面愈合过程中的炎性反应，加快血管化进程，调节胶原代谢，减少瘢痕形成，改善创面愈合质量，促进口腔软组织缺损修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-9984-147x(王拓)

关键词: 组织构建, 组织工程, 软组织损伤, 创伤愈合, 动物模型, 硬腭, 富血小板纤维蛋白, 胶原膜, 修复, 再生

Abstract:

BACKGROUND: Insufficient oral soft tissues in the implant zone may have a negative effect on the wound healing and the aesthetic restoration in the late stage. Platelet-rich fibrin can promote the wound healing of soft tissue defects. But there is still a lack of in-depth studies on the promotion of oral soft tissue defects in animal experiments.
OBJECTIVE: To compare the repairing effects of platelet-rich fibrin and collagen membrane on soft tissue defects of the hard palate in New Zealand rabbits.
METHODS: Fifty-four New Zealand rabbits were randomly divided into three groups (n=14 per group): platelet-rich fibrin group, collagen membrane group and blank control group. A 5 mm-diameter circular full-thickness soft tissue defect was made in the front of the hard palate, 2 mm distant to the rear maxillary incisors and mucosal edge of the bilateral hard palates. Autologous platelet-rich fibrin membrane or collagen membrane were implanted into the defect in the platelet-rich fibrin group and collagen membrane group, respectively. No treatment was given in the blank control group. General observation of the wound and wound healing analysis were performed at days 3, 7, 14, 21, 28, 56 post operation. Hematoxylin-eosin staining, CD31 immunohistochemical staining and Masson staining were used to observe inflammatory reaction, angiogenesis and collagen formation in the surgical site.
RESULTS AND CONCLUSION: The wound healing rate was fastest in the platelet-rich fibrin group, and no obvious scar formed. At 3 days post operation, there was no difference in the wound healing rates among the three groups; at 7 days, the wound healing rate in the platelet-rich fibrin group was significantly higher than that in the collagen membrane group and blank control group (P < 0.05). At 3 and 7 days after operation, the inflammatory reaction in the platelet-rich fibrin group was less than that in the collagen membrane and blank control groups (P < 0.05); at 14, 21, 28 and 56 days, there was no significant difference between the three groups. At 7, 14, 21 days after operation, the average absorbance value of CD31 in the platelet-rich fibrin group was significantly higher than that in the collagen membrane and blank control groups (P < 0.05). The average absorbance value of collagen formation in the platelet-rich fibrin group was significantly higher than that in the collagen membrane and blank control groups at 7 days after operation (P < 0.05), significantly higher than that in the blank control group at 14 days (P < 0.05), but lower than that in the collagen membrane and blank control groups at 21, 28 and 56 days after operation (P < 0.05). These findings show that platelet-rich fibrin can reduce inflammatory reactions in the process of wound healing, accelerate the angiogenesis, regulate the metabolism of collagen, reduce the formation of scar and improve the quality of wound healing, thereby promoting the repair of oral soft tissue defects.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

王拓，杨琴秋，董露，肖琼，陈红亮，孙勇，钟科. 富血小板纤维蛋白诱导口腔缺损软组织的修复与再生[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(7): 957-965.

Wang Tuo, Yang Qin-qiu, Dong Lu, Xiao Qiong, Chen Hong-liang, Sun Yong, Zhong Ke. Platelet-rich fibrin for repair of oral soft tissue defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(7): 957-965.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析纳入的54只新西兰兔全部进入结果分析，无脱失。其中，富血小板纤维蛋白组动物采血过程顺利，未造成动物死亡。所有实验动物手术过程顺利。术后动物生长状况良好，自由进食饮水，体质量变化不大。

2.2 兔口腔内软组织形态变化术后3 d，富血小板纤维蛋白组创面炎性反应轻微，白色的富血小板纤维蛋白膜稳固地附着在创面基底；胶原膜组及空白对照组创缘红肿，轻触出血。术后7 d，富血小板纤维蛋白组创面愈合约2/3，已无明显炎症反应。术后14 d，富血小板纤维蛋白组创面黏膜上皮覆盖完整，无组织凹陷，无瘢痕形成；胶原膜组和空白对照组创面愈合组织呈凹陷状态。术后21 d，胶原膜组愈合创面有瘢痕形成；空白对照组仍有一定程度的组织凹陷，并可见到瘢痕。术后28，56 d，富血小板纤维蛋白组术区形态恢复良好，无瘢痕；胶原膜组及空白对照组形态恢复欠佳，瘢痕明显(图3)。

2.3 各组创面愈合率变化所有实验分组动物口腔内伤口未愈合的面积均随时间的推移而逐渐缩小。在所设定的6个时间节点实验观察到富血小板纤维蛋白组、胶原膜组和空白对照组口腔软组织缺损分别在术后14，21，28 d时已完全愈合，即创面愈合率为100%。因此，实验只需对术后3，7 d的创面愈合率进行比较。结果显示：术后3 d，各组的创面愈合率差异无显著性意义；术后7 d，富血小板纤维蛋白组创面愈合率大于胶原膜组和空白对照组(P < 0.05；表1)。

2.4 病理炎症情况

2.4.1 苏木精-伊红染色病理描述情况术后3 d，各组表皮均缺失，胶原膜组及空白对照组皮下组织坏死区域较大、水肿伴炎细胞浸润；富血小板纤维蛋白组病变较其他两组轻微，皮下炎症明显较轻。术后7 d，富血小板纤维蛋白组缔组织增殖显著，肉芽组织形成较好，感染较轻。术后14 d，富血小板纤维蛋白组创面完全修复，基本无炎性反应。术后21 d，胶原膜组及空白对照组基本无炎性反应。术后28 d，各组变化基本同术后21 d。术后56 d，各组均可见皮下脂肪结缔组织、毛细血管和部分平滑肌组织，其间偶见炎细胞(正常现象)，见图4。

2.4.2 病理炎症统计结果在术后3，7 d，富血小板纤维蛋白组与其他2组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；胶原膜组和空白对照组之间差异无显著性意义 (P > 0.05)。在术后14，21，28，56 d，各组的炎症情况差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.5 CD31免疫组织化学染色情况

2.5.1 一般情况 CD31是内皮细胞黏附分子，为血管内皮细胞特异性标记物，常用来评价新生血管^[31]。CD31免疫组织化学染色结果显示，细胞质呈浅黄色或棕黄色者为CD31表达阳性细胞。阳性信号越多，说明创面有相对较多的新生血管形成(图5)。

2.5.2 CD31平均吸光度值分析在术后3，28，56 d，各实验分组的CD31平均吸光度值差异无显著性意义(P > 0.05)。在术后7，14 d，富血小板纤维蛋白组CD31平均吸光度值高于胶原膜组和空白对照组(P < 0.05)，胶原膜组CD31平均吸光度值高于空白对照组(P < 0.05)。术后 21 d，富血小板纤维蛋白组CD31平均吸光度值高于胶原膜组和空白对照组(P < 0.05)，胶原膜组和空白对照组 CD31平均吸光度值差异无显著性意义(P > 0.05)。见表3。

2.6 Masson染色情况

2.6.1 一般情况 Masson染色后，在光镜下观察，胶原纤维呈蓝色。术后3 d，各组的胶原纤维含量很少。术后7 d，各组胶原纤维迅速增多，富血小板纤维蛋白组尤甚，此时胶原纤维较纤细，排列较杂乱。术后14 d开始，富血小板纤维蛋白组胶原纤维排列趋于整齐、规则(图6)。术后28，56 d，胶原膜组和空白对照组仍有大量深染的胶原纤维，粗细不一，呈排列紊乱的网状结构。

2.6.2 胶原纤维平均吸光度值分析术后3 d，各实验分组的胶原纤维平均吸光度值差异无显著性意义(P > 0.05)。术后7 d，富血小板纤维蛋白组胶原纤维平均吸光度值高于胶原膜组和空白对照组(P < 0.05)；胶原膜组较空白对照组胶原纤维平均吸光度值偏高(P < 0.05)。术后14 d，富血小板纤维蛋白组、胶原膜组胶原纤维平均吸光度值高于空白对照组(P < 0.05)；富血小板纤维蛋白组和胶原膜组胶原纤维平均吸光度值差异无显著性意义(P > 0.05)。术后21，28，56 d，富血小板纤维蛋白组和胶原膜组胶原纤维平均吸光度值低于空白对照组(P < 0.05)；富血小板纤维蛋白组胶原纤维平均吸光度值较胶原膜组偏低(P < 0.05)。见表4。

参考文献

[1] Levine RA, Huynh-Ba G, Cochran DL. Soft tissue augmentation procedures for mucogingival defects in esthetic sites. Int J Oral Maxillofac Implants. 2014;29 Suppl:155-185.

[2] Zucchelli G, Mazzotti C, Mounssif I, et al. A novel surgical-prosthetic approach for soft tissue dehiscence coverage around single implant. Clin Oral Implants Res. 2013;24(9):957-962.

[3] Sicilia A, Quirynen M, Fontolliet A, et al. Long-term stability of peri-implant tissues after bone or soft tissue augmentation. Effect of zirconia or titanium abutments on peri-implant soft tissues. Summary and consensus statements. The 4^th EAO Consensus Conference 2015. Clin Oral Implants Res. 2015;26 Suppl 11:148-152.

[4] Landsberg CJ. The eversed crestal flap: a surgical modification in endosseous implant procedures. Quintessence Int. 1994;25(4):229-232.

[5] Penarrocha-Diago M, Gomez-Adrian MD, Balaguer-Martinez J, et al. Mandibular connective tissue pedicle flaps in implant dentistry: report of three cases. J Oral Implantol. 2007;33(3):127-132.

[6] Jantsch HH, Kemppainen P, Ringler R, et al. Cortical representation of experimental tooth pain in humans. Pain. 2005;118(3):390-399.

[7] Vignoletti F, Nunez J, Sanz M. Soft tissue wound healing at teeth, dental implants and the edentulous ridge when using barrier membranes, growth and differentiation factors and soft tissue substitutes. J Clin Periodontol. 2014;41 Suppl 15:S23-S35.

[8] Rigby MH, Taylor SM. Soft tissue reconstruction of the oral cavity: a review of current options. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 2013;21(4):311-317.

[9] 胡开进,王新木,侯锐,等.异种脱细胞真皮基质的研究进展及其在口腔黏膜缺损中的应用[J].中华损伤与修复杂志(电子版),2007,(3):173-175.

[10] Sculean A, Mihatovic I, Shirakata Y, et al. Healing of localized gingival recessions treated with coronally advanced flap alone or combined with either a resorbable collagen matrix or subepithelial connective tissue graft. A preclinical study. Clin Oral Investig. 2015; 19(4):903-909.

[11] Missana LR, Jammal MV. Critical size defect regeneration by rhPTH-collagen membrane as a new tissue engineering tool. J Biomed Mater Res A. 2014; 102(12):4358-4364.

[12] 侯劲松,黄洪章.脱细胞真皮基质在口腔医学领域的应用进展[J].中国口腔颌面外科杂志,2007,(3):163-169.

[13] 白彭,叶平,吴润发,等.两种胶原膜暴露于口腔环境中降解作用的对照研究[J].中国口腔种植学杂志,2011,(1): 56-57.

[14] Mosesson MW, Siebenlist KR, Meh DA. The structure and biological features of fibrinogen and fibrin. Ann N Y Acad Sci. 2001;936:11-30.

[15] Choukroun J, Diss A, Simonpieri A, et al. Platelet-rich fibrin (PRF): a second-generation platelet concentrate. Part IV: clinical effects on tissue healing. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2006;101(3): e56-e60.

[16] Choukroun J, Diss A, Simonpieri A, et al. Platelet-rich fibrin (PRF): a second-generation platelet concentrate. Part V: histologic evaluations of PRF effects on bone allograft maturation in sinus lift. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2006; 101(3):299-303.

[17] Khiste SV, Naik Tari R. Platelet-rich fibrin as a biofuel for tissue regeneration. ISRN Biomaterials. 2013;2013:1-6.

[18] 杨琴秋,赵春艳,孙勇.PRF用于口腔种植软组织缺损修复的研究进展[J].西南国防医药,2014,(12):1404-1406.

[19] Gupta V, Bains V K, Singh G P, et al. Regenerative potential of platelet rich fibrin in dentistry: literature review. Asian J Oral Health Allied Sci. 2011;1(1):22-28.

[20] Simonpieri A, Del CM, Sammartino G, et al. The relevance of Choukroun's platelet-rich fibrin and metronidazole during complex maxillary rehabilitations using bone allograft. Part I: a new grafting protocol. Implant Dent. 2009;18(2):102-111.

[21] Toffler M, Toscano N, Holtzclaw D, et al. Introducing Choukroun's platelet rich fibrin (PRF) to the reconstructive surgery milieu. J Implant Adv Clin Dent. 2009;1(6):21-32.

[22] Peck MT, Marnewick J, Stephen L. Alveolar ridge preservation using leukocyte and platelet-rich fibrin: a report of a case. Case Rep Dent. 2011;2011:345-348.

[23] Marrelli M, Tatullo M. Influence of PRF in the healing of bone and gingival tissues. Clinical and histological evaluations. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2013;17(14): 1958-1962.

[24] Soadoun AP, Touati B. Soft tissue recession around implants: is it still unavoidable?-Part II. Pract Proced Aesthet Dent. 2007;19(2):81-88.

[25] 徐普,朱亚丽,程亚楠,等.即刻种植即刻负重中PRF对软组织愈合的促进作用[J].中国口腔种植学杂志,2012,(4):154-157.

[26] Dohan DM, Choukroun J, Diss A, et al. Platelet-rich fibrin (PRF): a second-generation platelet concentrate. Part III: leucocyte activation: a new feature for platelet concentrates? Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2006;101(3):e51-e55.

[27] Cornelissen AM, Maltha JC, Von den Hoff JW, et al. Local injection of IFN-gamma reduces the number of myofibroblasts and the collagen content in palatal wounds. J Dent Res. 2000;79(10):1782-1788.

[28] 张亚军,杨聪翀,刘来奎,等.低浓度尼古丁对大鼠硬腭软组织缺损愈合的影响[J].中国组织工程研究,2014(15): 2326-2331.

[29] Nagelschmidt M, Becker D, Bonninghoff N, et al. Effect of fibronectin therapy and fibronectin deficiency on wound healing: a study in rats. J Trauma. 1987;27(11): 1267-1271.

[30] van Nostrand AW, Goodman WS. Pathologic aspects of mucosal lesions of the maxillary sinus. Otolaryngol Clin North Am. 1976;9(1):21-34.

[31] Valarmathi MT, Davis JM, Yost MJ, et al. A three- dimensional model of vasculogenesis. Biomaterials. 2009;30(6):1098-1112.

[32] Thomas B, Varghese J, Bhat G, et al. Platelet-rich fibrin as an adjunct to palatal wound healing after harvesting a free gingival graft: a case series. J Indian Soc Periodontol. 2014;18(3):399.

[33] Inchingolo F, Tatullo M, Marrelli M, et al. Trial with Platelet-Rich Fibrin and Bio-Oss used as grafting materials in the treatment of the severe maxillar bone atrophy: clinical and radiological evaluations. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2010;14(12):1075-1084.

[34] Marrelli M, Tatullo M. Influence of PRF in the healing of bone and gingival tissues. Clinical and histological evaluations. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2013;17(14): 1958-1962.

[35] Toffler M, Toscano N, Holtzclaw D, et al. Introducing Choukroun's platelet rich fibrin (PRF) to the reconstructive surgery milieu. J Implant Adv Clin Dent. 2009;1(6):21-32.

[36] Peck MT, Marnewick J, Stephen L. Alveolar ridge preservation using leukocyte and platelet-rich fibrin: a report of a case. Case Rep Dent. 2011;2011:345048.

[37] Dohan ED, Del CM, Inchingolo F, et al. Selecting a relevant in vitro cell model for testing and comparing the effects of a Choukroun's platelet-rich fibrin (PRF) membrane and a platelet-rich plasma (PRP) gel: tricks and traps. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2010;110(4):409-413.

[38] Cherubino M, Pellegatta I, Tamborini F, et al. Evaluation of lymphangiogenesis in acellular dermal matrix. Indian J Plast Surg. 2014;47(3):318-324.

引言

在口腔种植领域，人们常会遇到因术区软组织量不足而影响创面愈合和后期美学修复的情况^[1-3]。在这种情形下，人们可以采取外科手段或者组织修复材料来进行软组织缺损的修补^[4-11]，但前者存在手术较复杂、供区软组织量有限和增加患者痛苦等缺点，并且移植的软组织瓣在色泽、质地、腺体分泌等方面与口腔黏膜仍有区别。而以脱细胞真皮基质为代表的组织修复材料很好地弥补了以上缺点，研究证明它能很好地发挥引导组织再生的作用，进而促进创面的覆盖和关闭^[12]。但其存在原料来源有限、价格昂贵、伦理顾虑和病毒传播危险等不足^[9]。另外，一些组织修复材料还具有一定的免疫原性，在移植早期会引起不同程度的炎症反应，且一旦暴露于口腔易发生降解，增加细菌附着及感染的机会^[13]。

富血小板纤维蛋白作为第2代血小板浓缩物，包含了血液样品中所有有利于愈合和免疫的组分^[14]，它是由聚合的纤维蛋白以及镶嵌其中的血小板、白细胞、细胞因子、循环干细胞构成^[15-16]，具有制备简单，成本低，无需使用抗凝剂，压制的富血小板纤维蛋白膜具有弹性和柔韧性，细胞因子能长时间保存并缓慢释放等优点^[17]。大量研究证实富血小板纤维蛋白能够促进组织修复，加快伤口愈合，增加新生组织再生量，减少瘢痕形成^[18]，现已被视为一种改善愈合和促进组织再生的生物材料^[19]。

目前，对于富血小板纤维蛋白促进口腔软组织缺损修复方面的研究，国内外以临床应用居多^[18^，^20-24]，均取得了较为满意的效果。而在动物实验方面，目前中国只有1例相关报道^[26]，但其未对富血小板纤维蛋白修复口腔软组织缺损进行较为全面、深入的论证。因此，实验建立了有较长观察期限，通过形态学和组织学方法对比观察富血小板纤维蛋白膜和胶原膜促进口腔软组织缺损愈合的动物实验，以评价富血小板纤维蛋白膜的创面修复效果，进而为富血小板纤维蛋白修复口腔软组织缺损提供基础实验依据以及为富血小板纤维蛋白在口腔种植临床修复软组织缺损提供参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2014年5至9月在四川大学华西医院动物中心和四川省医学科学院•四川省人民医院药物安全评价中心病理室完成。

1.3 材料健康三月龄雄性新西兰大白兔54只，体质量2.5-3.0 kg，由四川大学华西医院动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2013-14。术前在统一条件下适应性分笼喂养1周。动物饲养及手术均在四川大学华西医院动物中心进行，实验动物设施使用许可证号：SYXK(川)2013-119。实验动物均在一致的生活环境中单笼饲养，标准饲料专人喂养；室温控制在(23±2) ℃；保持兔舍内60%-70%的空气湿度及较好的光照条件；定时打扫动物房等。

1.4 方法

1.4.1 富血小板纤维蛋白的制备抽取富血小板纤维蛋白组动物耳中央动脉血5 mL于未添加任何抗凝剂的真空采血管(河北鑫乐科技有限公司)内，迅速置于离心机(Eppendorf，德国)中，立即以3 000 r/min的速度离心10 min^[26]。静置3-5 min后，用无菌有齿镊取出中间层凝胶，修剪并保留其尾部少许红细胞层，然后将其置于纤维蛋白成型处理工具盒(江苏创英医疗器械有限公司)中压制成膜备用(图1)。

1.4.2 口腔软组织缺损兔模型的构建以体积分数3%戊巴比妥钠(Sigma，美国)按1 mL/kg成功麻醉实验动物后，将动物仰卧位固定于手术台上。口内、口周常规消毒，铺巾，开口器撑开口腔。在有持续的冷却液降温的情况下，于硬腭前部中份，分别距上颌后排门齿、左右硬腭黏膜边缘2 mm处以直径为5.0 mm的组织环切钻(MCT，韩国)制备软组织缺损，去除黏骨膜瓣形成圆形缺损区，并潜行剥离缺损边缘黏骨膜瓣，并以此作为建模成功的标准^[27-28]。注意动作轻柔，勿损伤骨面。

充分止血后，富血小板纤维蛋白组动物创面缝合自体富血小板纤维蛋白膜、胶原膜组创面缝合胶原生物膜(烟台正海生物技术有限公司；图2)，空白对照组创面不予任何处理。

1.4.3 一般情况观察术后3，7，14，21，28，56 d对创面进行形态学观察并作创面愈合率分析。创面愈合率=[(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积]× 100%^[29]。

1.4.4 组织学观察在术后每个时间点，各组随机处死3只动物，术区取材后行苏木精-伊红染色、CD31免疫组织化学染色和Masson染色。处死动物后，切取硬腭术区以及术区周围2 mm的正常组织，修剪后以生理盐水冲洗，固定于40 g/L多聚甲醛(天津市进丰化工有限公司)中24-72 h。固定以后的标本再置于EDTA脱钙液(北京斯百汇生物科技有限公司)中脱钙4-6周。

苏木精-伊红染色：切片脱蜡至水→苏木精染液(北京百灵威科技有限公司生产)染色10-20 min→体积分数1%盐酸内分色30 s后取出，自来水洗→50 ℃温水或弱碱性水溶液中反蓝，取出，自来水洗→镜检染色效果→伊红染液(成都科龙化工试剂厂)内染色1 min后取出，自来水洗→镜检着色程度→梯度乙醇浸洗→切片吹干→二甲苯(成都市科龙化工试剂厂)Ⅰ：1-5 min→二甲苯Ⅱ：1-5 min→中性树胶封固。

CD31免疫组织化学染色：切片脱蜡至水→体积分数3%过氧化氢室温孵育10 min，PBS液洗3次→热修复抗原，冷却后，PBS液洗2次→滴加山羊血清(北京中杉金桥生物有限公司)封闭液，室温封闭20 min→滴加稀释的血小板内皮细胞黏附分子1一抗(1∶200)(北京博奥森生物技术有限公司)，4 ℃过夜，PBS洗3次→滴加生物素化山羊抗鼠/兔IgG二抗(北京中杉金桥生物有限司)， 37 ℃孵育30 min，PBS洗3次→滴加辣根过氧化酶标记链霉素卵蛋白试剂(北京中杉金桥生物有限公司)，37 ℃下孵育30 min，PBS洗4次→DAB(北京中杉金桥生物有限公司)显色→苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封固。

Masson染色：切片脱蜡至水→自来水、蒸馏水依次洗→苏木精液染5-10 min→充分水洗，盐酸乙醇分化→蒸馏水洗→Masson丽春红(成都市科龙化工试剂厂)酸性复红液染5-10 min→体积分数0.2%冰醋酸(天津市富宇精细化工有限公司)水溶液浸洗片刻→体积分数1%磷钨酸(成都市科龙化工试剂厂)水溶液中3-5 min→不经水洗，直接甲苯胺蓝(上海如吉生物科技发展有限公司)染色 5 min→体积分数0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻→体积分数95%乙醇、无水乙醇、二甲苯透明，中性树胶封固。

1.5 主要观察指标

病理炎症分级：采用数码三目摄像显微摄像系统(麦克奥迪实业集团有限公司)在40，100，400倍光镜下对苏木精-伊红染色切片进行观察，根据光镜下观察计数组织炎性细胞的数目并进行病理分级^[30]。

CD31平均吸光度值和胶原纤维平均吸光度值测定：采用数码三目摄像显微摄像系统对切片进行图像采集，每张切片先于100倍镜下观察，再于400倍镜下随机选取不重叠的3个视野，以Image-Pro Plus 6.0图像分析系统(Media Cybernetics，美国)测定所采集的3个图像的平均吸光度，最后取平均值。

1.6 统计学分析数据用x(_)±s表示。用SPSS 17.0统计学软件对所有数据进行分析处理。创面愈合率、CD31平均吸光度值和胶原纤维平均吸光度值采用单因素方差分析。病理炎症分级结果采取秩和检验进行分析。检验水准α =0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

具有优良生物相容性和安全性的富血小板纤维蛋白以及其显著的促进软硬组织再生的优势，在口腔种植领域得到了较为广泛的运用。实验从形态学的角度观察到富血小板纤维蛋白组创面的愈合速度最快，在术后14 d时创口已完全关闭，这与Thomas等^[32]的结果一致。同时胶原膜组和空白对照组创口在愈合过程中软组织出现了“凹陷性愈合”的现象，而富血小板纤维蛋白组创面未见该现象，说明富血小板纤维蛋白能很好地促进软组织再生，增加新生组织生成量，这与Inchingolo等^[33]的观点一致。另外，Marrelli等^[34]在无翻瓣即刻种植术区覆盖富血小板纤维蛋白膜，观察到术区被新形成的厚度

在1-3 mm的软组织覆盖。Toffler等^[35]研究也证实富血小板纤维蛋白在促进牙龈创口快速闭合的同时，伤口能形成增厚的、高度成熟的角化牙龈组织，这对最终的美学修复起着积极的作用。

实验中所采用的组织修复材料均暴露于口腔环境中。有学者指出胶原膜一旦暴露于口腔易发生降解，增加细菌附着及感染的机会^[13]。实验在术后3 d时观察到胶原膜已有降解迹象，伤口炎症反应明显；而富血小板纤维蛋白膜则完整、稳固地附着于创面基底，创口炎症反应不明显，富血小板纤维蛋白降解速率与创面愈合速度相匹配。Peck等^[36]将富血小板纤维蛋白作为创口填塞物用于1例43岁健康女性行牙槽嵴保存术(alveolar ridge preservation，ARP)。术后1周创面富血小板纤维蛋白膜仍清晰可见，尽管它暴露于口腔环境中，但未发生膜分解和感染的迹象。Thomas^[32]等将富血小板纤维蛋白用于人腭部供瓣区伤口覆盖物时也观察到在术后3 d时，富血小板纤维蛋白仍然稳定地附着在创面上。因此，将富血小板纤维蛋白运用于口腔种植术中修复软组织缺损时，实验就可以尽量地避免使用碘仿纱条和牙周塞治剂来覆盖创面，不仅可以简化手术操作，还可以提升患者术后的舒适度。

实验还发现富血小板纤维蛋白组炎性反应不明显，结合苏木精-伊红染色和病理炎症分级结果，可得知富血小板纤维蛋白能减轻伤后的炎症反应，减少炎细胞在创面局部的聚集，尤其在创伤早期(术后1周)，其效果明显。而胶原膜组和空白对照组肉眼观察到在术后1周以内伤口炎症较重，观察苏木精-伊红切片一直到术后 21 d才基本无炎性反应。尽管目前实验肯定脱细胞真皮基质的组织修复效果，但很多源自异种的胶原膜，其所含的异种胶原以及可能在加工过程中产生的变性蛋白，带入的杂质等可能转而会成为“攻击”受体组织的(半)抗原，进而在非张力、非感染、非创伤的情况下出现免疫排斥反应，影响伤口愈合。这在实验的对比观察中得到了验证，也再一次印证了富血小板纤维蛋白优良的生物安全性。

有研究显示，富血小板纤维蛋白中生长因子的释放至少1周，可持续约1个月，并在7-14 d达到高峰^[37]。这与实验观察到的在术后7，14，21 d，富血小板纤维蛋白组CD31阳性染色面积和CD31平均吸光度值均大于其他两组的时间节点相吻合。这也进一步表明富血小板纤维蛋白各组分促血管化作用使得创面有较多新生血管形成，它们能够为创口带来愈合过程中必须的氧、营养物质和生物活性成分，能促进肉芽组织的生长，加快创伤愈合。研究表明：胶原膜能够促使血管内皮细胞在7 d开始增殖活跃，14 d时持续增加^[38]，并接近完全血管化^[9]。而实验观察到的富血小板纤维蛋白组的血管化程度早在术后7 d时已达到高峰，尽管此后随着时间的推移，富血小板纤维蛋白组血管化进程减弱，但其依然高于胶原膜组和空白对照组，直到术后21 d后各组间比较无显著差异。表明富血小板纤维蛋白能显著促进创口新生血管化并且优于胶原膜。

胶原纤维对整个创面愈合过程具有重要作用。实验从形态学和Masson染色结果分析中得出：在创伤早期，富血小板纤维蛋白能够促进胶原沉积，加速创面修复，在创伤愈合中后期能对胶原代谢进行调节，从而减少胶原的过度沉积，减少瘢痕形成，改善创面愈合质量。但目前国内外关于富血小板纤维蛋白减少创伤愈合中瘢痕形成的研究很少，尚无统一定论。结合实验结果，实验推测，富血小板纤维蛋白可能通过自身所包含的丰富的生长因子在胶原的合成和降解之间进行平衡调控，从而减少瘢痕生成。但富血小板纤维蛋白到底是通过何种机制调控胶原代谢，减少瘢痕形成，这将是实验进一步研究的方向。

总之，富血小板纤维蛋白来自于自体，具有相当的生物安全性，它是促进口腔软组织再生的活化平台，能够按照创伤愈合的生理规律，有效地调控创伤愈合的整个过程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

富血小板纤维蛋白诱导口腔缺损软组织的修复与再生

Platelet-rich fibrin for repair of oral soft tissue defects

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[1]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[2]	吴训, 孟娟红, 张建运, 王亮. 浓缩生长因子修复兔髁突全层软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1166-1171.
[3]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[4]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[5]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[6]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[7]	王丰, 周立宇, 赛吉拉夫, 齐士斌, 马艳霞, 韦善文. CaMKⅡ-Smad1促进外周神经的轴突再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1064-1068.
[8]	邓桢翰, 黄勇, 肖璐璐, 陈昱霖, 朱伟民, 陆伟, 王大平. 骨形态发生蛋白在关节软骨再生过程中的作用与应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 798-806.
[9]	徐东紫, 张婷, 欧阳昭连. 心脏组织工程领域全球专利竞争态势分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 807-812.
[10]	王玉姣, 刘丹, 孙嵩, 孙勇. 改良型富血小板纤维蛋白复合双相磷酸钙可促进兔骨髓间充质干细胞的活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 504-509.
[11]	孙启, 周亚男, 董鑫, 李宁, 颜家振, 石浩江, 许胜, 张幖. 激光选区熔化钴铬烤瓷合金金瓷结合界面的特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 521-525.
[12]	刘江锋. 纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合材料联合锁定钢板治疗股骨骨纤维异常增殖症[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 542-547.
[13]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[14]	常文辽, 赵杰, 孙晓亮, 王锟, 吴国锋, 周剑, 李树祥, 孙晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.
[15]	刘旒, 周箐竹, 龚桌, 刘博言, 杨斌, 赵娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.