炎症微环境下人牙周膜干细胞的生物学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.06.020

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (6): 898-905.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.06.020

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

炎症微环境下人牙周膜干细胞的生物学特性

袁萍，李淑慧，赵璐，于莉，周春梅，吴佩玲

新疆医科大学第二附属医院口腔科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830063

收稿日期:2015-12-12 出版日期:2016-02-05 发布日期:2016-02-05
通讯作者: 吴佩玲，主任医师，教授，新疆医科大学第二附属医院口腔科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830063
作者简介:袁萍，女，1989年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事牙体牙髓病学研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81460103)

Biological properties of human periodontal ligament stem cells under inflammatory microenvironment

Yuan Ping, Li Shu-hui, Zhao Lu, Yu Li, Zhou Chun-mei, Wu Pei-ling

Department of Stomatology, the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830063, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2015-12-12 Online:2016-02-05 Published:2016-02-05
Contact: Wu Pei-ling, Chief physician, Professor, Department of Stomatology, the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830063, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Yuan Ping, studying for master’s degree. Department of Stomatology, the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830063, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81460103

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

牙周膜干细胞：是从离体牙的牙周膜中分离出的，表现间充质干细胞特性，具有自我增殖、克隆及分化能力的一类干细胞，而且还具有形成牙骨质、牙槽骨及牙周膜的能力。

炎症微环境：慢性炎症疾病中组织的再生修复能力明显下降，最新研究显示其原因是炎症环境下干细胞再生能力受到明显抑制。炎症不仅有可能改变干细胞微环境的平衡，还可能影响干细胞内源性信号的调控作用。牙周炎导致的牙周支持组织的丧失可能与牙周膜干细胞的生物学行为受到炎性因子刺激有关。

背景：牙周膜干细胞可促进牙周组织修复再生，为牙周炎的治疗提供了新的思路。

目的：观察炎症微环境对人牙周膜干细胞生物学行为的影响。

方法：组织块酶消化法培养从健康个体获得的牙周膜干细胞和牙周炎患者获得的牙周膜干细胞，并经有限稀释法纯化及干细胞表面标记物CD146及牙周膜干细胞表面蛋白STRO-1鉴定后，分别取第3代健康和炎症来源的牙周膜干细胞，标注为正常组和炎性组，各加入成骨诱导液进行成骨诱导。

结果与结论：①两种组织来源的细胞经纯化后均可表达间充质干细胞表面标志物STRO-1和CD146；炎性组牙周膜干细胞比健康组牙周膜干细胞具有更强的增殖能力，但炎性组牙周膜干细胞的成骨分化能力要低于健康组牙周膜干细胞。②正常组织来源的牙周膜干细胞在成骨诱导时分别加入不同的炎性因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6刺激后，经RT-PCR检测发现，与诱导组相比，肿瘤坏死因子α处理组成骨相关基因核心因子Runx2和Osterix的表达显著下降(P < 0.05)。③而白细胞介素1β和白细胞介素6处理组并未对牙周膜干细胞的成骨能力产生显著影响。④在肿瘤坏死因子α质量浓度为0.1，1 μg/L处理组中，成骨相关基因Runx2的表达与诱导组相比无显著影响，而在肿瘤坏死因子α质量浓度为10 μg/L处理组，成骨相关基因Runx2的表达与诱导组相比明显降低(P < 0.05)。⑤结果证实，炎症微环境改变了牙周膜干细胞内部的分子信号机制，使炎症来源的牙周膜干细胞分化能力低下，其中肿瘤坏死因子α是导致牙周膜干细胞成骨分化能力下降的关键因子之一，10 μg/L为肿瘤坏死因子α的最佳干预质量浓度。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID:0000-0002-4293-4392 (吴佩玲)

关键词: 干细胞, 培养, 牙周膜干细胞, 成骨, 牙周炎, RT-PCR, 肿瘤坏死因子α, 白细胞介素1β, 白细胞介素6, 核心因子Runx2, 炎症微环境, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The periodontal ligament stem cells can promote periodontal tissue regeneration, providing a new way for the treatment of periodontitis.

OBJECTIVE: To observe the inflammatory microenvironment effects on the biological properties of periodontal ligament stem cells.

METHODS: Periodontal ligament stem cells from healthy controls and patients with periodontitis were primarily cultured by tissue digestion method, purified using limited dilution method, and identified through detection of CD146 and STRO-1. Then, passage 3 cells were taken and denoted as normal control and inflammation groups followed by osteogenic induction.

RESULTS AND CONCLUSION: Purified cells from two sources both expressed STRO-1 and CD146. Periodontal ligament stem cells in the inflammation group showed higher multiplication capacity, but the osteogenesis ability was lower compared with the normal control group. The expressions of Runx2 mRNA and Osterix mRNA were dropped significantly after the stimulus of tumor necrosis factor-α

(P < 0.05), but the interleukin-1β and interleukin-6 did not have a significant impact. Tumor necrosis factor-α at 0.1 and 1 μg/L had no significant effects on the expression of Runx2 mRNA, but the expression of Runx2 mRNA was decreased significantly after treatment with 10 μg/L tumor necrosis factor-α (P < 0.05). It is confirmed that the molecular signaling mechanism inside the periodontal ligament stem cells is changed under inflammatory microenvironment, so that the differentiation capacity of cells from the inflammatory sources is lowered. Moreover, tumor necrosis factor-α is one of the key factors and its optimal concentration is 10 μg/L.

袁萍，李淑慧，赵璐，于莉，周春梅，吴佩玲. 炎症微环境下人牙周膜干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(6): 898-905.

Yuan Ping, Li Shu-hui, Zhao Lu, Yu Li, Zhou Chun-mei, Wu Pei-ling . Biological properties of human periodontal ligament stem cells under inflammatory microenvironment[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(6): 898-905.

图/表（结果） 6

2.1 两种组织来源的牙周膜干细胞的形态学变化正常和炎症来源的牙周膜组织经组织块酶消化法原代培养3-8 d后，可见牙周膜组织块边缘有细胞爬出(图1)，大部分细胞呈长梭形或不规则形，类似成纤维细胞。有限稀释法克隆化培养约8 d出现细胞克隆，所得细胞即为H-PDLSCs和P-PDLSCs(图1)。倒置显微镜下观察，两种细胞呈纺锤形，呈螺旋簇集落生长。两种细胞在形态学上无明显差异(图1)。

2.2 培养的人牙周膜干细胞细胞表面标记物的表达用免疫荧光染色观察显示，正常和炎症来源的牙周膜干细胞细胞膜及胞浆均阳性表达间充质干细胞表面标志物STRO-1和CD146，呈明亮的绿色荧光(+++)，结果见图2。

2.3 正常和炎症牙周膜干细胞生长曲线比较H-PDLSCs和P-PDLSCs的细胞生长曲线均呈“S”型，培养第6天前细胞生长数量呈现上升趋势，且P- PDLSCs生长速度明显高于H-PDLSCs，尤其是在培养第3，4天，差异有显著性意义(P < 0.05)，培养第6天起细胞生长速度趋于平缓，细胞增殖进入“平台期”，之后P-PDLSCs生长速度低于H-PDLSCs，但差异无显著性意义(P > 0.05；图3)。

2.4 两种来源牙周膜干细胞成骨分化能力的比较将两种细胞进行成骨诱导，成骨诱导7 d矿化结节定量结果显示，P-PDLSCs的吸光度值低于H-PDLSCs(表1； P < 0.05)，说明P-PDLSCs的成骨分化能力远不如H- PDLSCs。

成骨诱导3 d后，RT-PCR检测成骨相关基因的表达，结果显示，H-PDLSCs的Runx2和Osterix mRNA的表达均高于P-PDLSCs(P < 0.05；表1)。

2.5 不同炎性因子刺激后RT-PCR检测牙周膜干细胞中Runx2及Osterix mRNA的表达成骨诱导时分别加入肿瘤坏死因子α(10 μg/L)、白细胞介素1β(10 μg/L)、白细胞介素6(10 μg/L)，诱导3 d后，在肿瘤坏死因子α处理组，Runx2及Osterix mRNA表达均明显下调；而在白细胞介素1β、白细胞介素6处理组，Runx2及Osterix mRNA的表达水平与成骨诱导组相比差异无显著性意义(表2)。

2.6 不同质量浓度肿瘤坏死因子α对牙周膜干细胞成骨分化的影响各组浓度刺激成骨诱导培养下，在成骨诱导组、肿瘤坏死因子α(0.1，1 μg/L) 处理组，Runx2 mRNA的表达差异无显著性意义；但在肿瘤坏死因子α(10 μg/L)刺激下，Runx2 mRNA的表达下调明显(P < 0.05；表3)。

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引言

专家学者推测牙周膜中可能存在能再生牙周膜和牙骨质的多潜能干细胞，直到2004年，Seo等^[1]首次从健康成年人牙周组织获得具有克隆形成能力、高度增殖和分化能力的牙周膜干细胞，这使得利用干细胞促进牙周组织再生成为研究的热点问题。

牙周炎通常是指由革兰阴性厌氧菌感染牙周支持组织而引起的慢性感染性疾病。牙周炎在成年人中的发病率高达80%，其中20%患有重度牙周炎^[2]。其不可逆转地侵袭破坏牙周组织，牙周再生能力丧失是造成牙周组织缺损最终导致牙齿丧失的最常见原因。终止牙周软、硬组织的破坏，恢复功能和美观，促进牙周组织的再生和修复^[3-4]，是牙周治疗的最终目的。而缺损牙槽骨的再生和修复是影响牙周病治疗的关键因素。

现有的治疗方法主要包括牙周刮治、骨移植和引导组织再生术等，但仍然无法实现真正的牙周组织再生。牙周组织缺损能否获得再生，关键在于能否募集并激活所需细胞并使其发挥作用^[5]。

干细胞是维持组织器官再生能力的重要基础，2004年，Seo^[1]等利用单细胞克隆技术，从牙周膜中成功分离、鉴定出了一种新的成体干细胞即为牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)。

口腔组织中包含多种成体干细胞，如骨髓基质干细胞、表皮干细胞、肌肉干细胞等，但只有牙髓干细胞和牙周膜干细胞为口腔特有的成体干细胞^[6]。而牙周组织再生修复与牙周膜干细胞的异质性有密切关系。牙周膜干细胞可处于不同的分化阶段或具有不定向的分化趋势^[7-8]，能增殖产生成骨细胞、成纤维细胞和成牙骨质细胞，从而使牙周组织再生进入了一个新的领域。

除了健康牙周膜来源的干细胞外，实验还从牙周炎牙周膜组织中成功分离了炎性来源的人牙周膜干细胞。这种牙周膜干细胞的发现为牙周炎的治疗提供了新的思路和方法^[9]。

牙周膜干细胞具有成体干细胞共有的特性，具有很强的自我更新能力和自我分化能力，这些功能使其成为牙周组织再生修复的重要种子细胞^[10]。但是，慢性炎症疾病中组织的再生修复能力明显下降^[11]，最新研究显示其原因是炎症环境下干细胞再生能力受到明显抑制。炎症不仅有可能改变干细胞微环境的平衡，还可能影响干细胞内源性信号的调控作用。因此，牙周炎导致的牙周支持组织的丧失可能与牙周膜干细胞的生物学行为受到炎性因子刺激有关。

1975年，Carswell等发现了一种能抑制并杀伤体外培养的肿瘤细胞的蛋白物质，并将其命名为肿瘤坏死因子。Shalaby等^[12-13]将巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子命名为肿瘤坏死因子α。牙周炎的致病菌主要是革兰阴性菌，革兰阴性菌细胞壁表面的LPS(lipolysaccharide)主要激活巨噬细胞而产生许多的肿瘤坏死因子α，肿瘤坏死因子α与牙周炎的病程发展密切相关^[14-15]。LPS与炎症性骨疾病如骨髓炎和牙周炎等的发病机制相关密切^[16-17]，单核细胞、巨噬细胞及内皮细胞通过信号转导级联反应而释放促炎性因子，包括肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6等^[18-19]。

实验分别从健康及慢性牙周炎患者离体牙中分离培养牙周膜干细胞(H-PDLSCs，P-PDLSCs)，进行体外扩增，并进行表型鉴定和生物学行为观察比较，探讨炎症微环境对干细胞的影响及进一步认识牙周炎导致牙周支持组织丧失的原因。

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。

1.2 时间及地点于2015年3至9月在新疆医科大学第一附属医院临床研究院干细胞实验室完成。

1.3 材料离体牙来自2015年3至9月在新疆医科大学第二附属医院口腔科就诊患者因正畸减数或阻生而拔除的前磨牙、第三磨牙。

正常组织来源：20-40岁志愿者因正畸减数或阻生而拔除的前磨牙、第三磨牙10例，均无牙周组织炎症，无牙髓炎、根尖周炎和牙根吸收。

炎症组织来源：20-45岁患者因慢性牙周炎而拔除的患牙13例，均无牙髓炎、根尖周炎、牙根吸收。慢性牙周炎的诊断标准参照Armitage的推荐标准^[20]：X射线片显示牙槽骨吸收达到牙根2/3，一个以上的牙周袋探诊深度≥ 5 mm。

所有纳入个体均无系统性疾病和已知的可以影响牙周状况的疾病，无吸烟史，近6个月无特殊服药史。拔牙前对患者进行口腔洁治，拔牙时碘伏消毒，牙齿拔除后立即侵入含双抗的培养液中。

1.4 实验方法

1.4.1 正常和炎症组织来源牙周膜干细胞的培养和鉴定原代培养：在SW-CJ-2D型超净工作台(苏州净化设备有限公司，中国)上，用含双抗(Hyclone公司，美国)的PBS根冠向冲洗3遍，然后刮取根中1/3牙周膜，将其剪成1 mm³的组织块，离心，弃上清后加入约组织体积5倍量的3 g/L的Ⅰ型胶原酶(Gibco，美国)，吹散，于 37 ℃水浴箱中消化30 min后离心，弃上清，用1 mLα- MEM细胞培养液(体积分数15% FBS、50 mg/L抗坏血酸、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL双抗；Gibco，美国)重悬后接种于6孔板，置于37 ℃，体积分数5%CO₂孵箱(Thermo Scientific，美国)中培养，每隔3 d换液1次，直至3-8 d后细胞从组织边缘爬出。

1.4.2 有限稀释法纯化细胞并传代当细胞浓度达到80%汇合时，用体积分数0.25%胰蛋白酶消化，离心弃上清，α-MEM培养基重悬并调整细胞浓度为(10-20)×10^-3个后，接种于96孔板，置于37 ℃，体积分数5%CO₂孵箱中培养，次日在XDS-1B型倒置相差显微镜(莱卡，德国)下标记出单个细胞孔后继续培养，每隔 3 d换液1次，待孔中的细胞形成较大克隆集落是胰酶消化，常规传代培养。标记H-PDLSCs为正常组织来源的牙周膜干细胞，P-PDLSCs为牙周炎症组织来源的牙周膜干细胞。采用第3-5代克隆牙周膜干细胞用于后续实验。

1.4.3 细胞表面标记物检测分别取正常和炎症第3代牙周膜干细胞，体积分数0.25%胰酶消化，离心弃上清，培养基重悬，以4×10⁷ L^-1的细胞浓度接种于共聚焦小皿中，待细胞浓度50%汇合时弃原培养液，PBS洗2遍，加入40 g/L的多聚甲醛固定1 h后弃液，PBS洗2遍，加入体积分数5%羊血清封闭半小时，弃液，加入STRO-1 (美国)和CD146(博奥森，北京)一抗，4 ℃过夜。次日弃一抗，PBS洗2遍，避光条件下加入FITC标记的IgM二抗(博奥森，北京)1 h，弃液，加DAPI染色10 min，PBS洗2遍，激光共聚焦显微镜观察，拍照。观察胞浆及细胞膜染色情况，强阳性为明亮的荧光绿，记为(+++)；弱阳性为淡绿色，记为(+)；阴性为不着色，记为(-)。

1.4.4 细胞生长曲线检测分别取正常和炎症来源的处于对数生长期的第3代牙周膜干细胞，以1×10³/孔的密度接种于96孔板，每组设3个副孔和1个空白对照孔(以无细胞的空白孔调零)，分别记为正常组1，2，3及正常对照孔，炎性组1，2，3及炎性对照孔。加入200 μL/孔培养液，37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养过夜。次日更换新鲜培养液，每孔180 μL液体(无血清)，5 h后观察细胞，在第1天的孔中加入20 μL MTT液，37 ℃孵育4 h后吸弃培养液，加入150 μL的DMSO，将96孔板置于酶标仪水平震荡5 min混匀，于450 nm波长处检测吸光值(吸光度值)，取均值。

检测结束后将每孔检测液吸出，PBS洗2遍，加入培养液继续培养，连续检测7 d，每3 d换液1次。以时间为横轴，吸光度值为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.4.5 成骨诱导培养取正常组织来源和炎症组织来源第3代牙周膜干细胞，体积分数0.25 %胰酶消化，离心弃上清，培养基重悬，以细胞浓度为2×10⁷ L^-1接种于6孔板中，待细胞浓度达50%时更换为矿化诱导培养液(体积分数5%FBS α-MEM，10 mmol/L β-甘油磷酸钠，质量浓度50 mg/L 抗坏血酸，100 nmol/L地塞米松)进行矿化诱导，每隔3 d更换新鲜矿化诱导液，于第7天用茜素红染色，染色后用去离子水反复冲洗，加入十六烷基吡啶孵育15 min，用分光光度计在紫外线波长为540 nm处测吸光度值。

1.4.6 不同炎性因子及不同质量浓度的肿瘤坏死因子α刺激后Real Time PCR检测成骨相关基因的表达取正常来源的处于对数生长期的第3代牙周膜干细胞，成骨诱导时分别加入肿瘤坏死因子α(0.1，1，10 μg/L)、白细胞介素1β(10 μg/L)、白细胞介素6(10 μg/L)，设成骨诱导组作对照，成骨诱导3 d后用Trizol裂解并提取细胞总RNA，经紫外分光光度计测定RNA浓度后，用反转录试剂盒(Thermo，美国)分别反转录合成cDNA；然后以cDNA为模板，以β-actin为内参照，用Syber Green荧光定量PCR检测试剂盒(Thermo，美国)进行荧光定量PCR，分别检测Runx2和Osterix mRNA表达水平。反应体系均为20 μL引物序列。

PCR反应条件：95 ℃变性10 min，95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min，40个循环。ABI型实时定量PCR仪(Applied Biosystems，德国)检测记录数据，结果根据标准曲线由软件自动计算得出。实验进行3次重复。

1.5 主要观察指标各组细胞形态学、生长曲线观察，成骨诱导后，两组矿化结节定量分析及成骨相关基因的表达结果。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行数据分析，计量资料以x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析法，组间数据两两比较采用独立样本t 检验，检验水准α=0.05。

讨论

为了观察炎症微环境对牙周膜干细胞的生物学行为是否产生影响，实验参照Seo等^[1]的方法，分别从正常和炎性牙周组织中分离培养出了两种来源的牙周膜干细胞(H-PDLSCs与P-PDLSCs)，并对这两种来源的牙周膜干细胞的增殖和分化能力做了对比研究，经比较，两种细胞均呈现成纤维细胞样的长梭形，在形态学上并无明显差异，这表明牙周膜干细胞的存在和形态不受炎症环境的影响。

实验采用免疫荧光染色法检测细胞表面标记，H-PDLSCs和P-PDLSCs均表达干细胞的表面分子，且表达基本相同，这说明实验得到的均为牙周组织来源的干细胞，炎症感染的牙周组织中同样存在牙周膜干细胞，为牙周炎患者的牙周组织自体修复提供了种子细胞。

实验从MTT生长曲线的结果对比发现P-PDLSCs的增殖能力强于H-PDLSCs。实验进一步对P-PDLSCs的成骨相关能力进行了观察，无论从矿化结节定量分析，还是成骨相关基因的结果均显示，P-PDLSCs的成骨能力要低于H-PDLSCs。这说明炎症微环境影响下，牙周膜干细胞的行为发生了改变，慢性炎症性疾病如牙周病是造成骨组织损伤的重大疾病，在慢性牙周病中骨的形成和再生能力受到了不同程度的抑制，导致这种情况的关键因素可能是由于炎性微环境的改变及在炎性微环境的影响下干细胞的功能发生了变化^[21-22]。

牙周炎的牙周组织破坏是在菌斑的刺激下局部组织产生过度免疫造成的^[23-24]。LPS是菌斑最主要的产物，可刺激宿主细胞产生炎性因子，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β等^[25-27]。在这些炎性因子中，肿瘤坏死因子α被认为是其他因子的上游因子，在炎症发生中起重要作用，其在骨病理生理过程中扮演重要角色^[28-31]，通过抑制转录方式调节Runx2表达^[32]，还有研究表明，肿瘤坏死因子α能抑制成骨细胞分化及矿化结节的形成^[33-35]。

实验发现，只有肿瘤坏死因子α组可以显著抑制牙周膜干细胞的成骨分化，而白细胞介素1β、白细胞介素6并未对牙周膜干细胞的成骨能力造成明显影响，这说明在牙周炎这个炎症微环境中，肿瘤坏死因子α是使牙周膜干细胞成骨能力下降的关键炎性因子。

目前，肿瘤坏死因子α对干细胞成骨分化的作用有不同的报道，有的认为其是抑制成骨的，如Zhou等^[36]发现，在炎症反应发生中，肿瘤坏死因子α可激活成骨细胞中的p38 MAPK^[37]，抑制成骨细胞的分化。也有研究表明肿瘤坏死因子α在干细胞成骨分化中起着积极的作用，通过激活核转录因子kB途径^[38]，提高成骨相关蛋白的表达，使基质矿化增多^[39]。

实验利用肿瘤坏死因子α刺激H-PDLSCs来模拟炎性环境，比较不同质量浓度肿瘤坏死因子α刺激对牙周膜干细胞成骨能力的影响，结果表明，在肿瘤坏死因子α低浓度时对成骨能力没有明显影响，浓度越低成骨能力反而呈增高趋势，如在肿瘤坏死因子α质量浓度为0.1，1 μg/L时，Runx2 mRNA的表达与成骨诱导组相比有上调趋势，但差异无显著性意义；而在高浓度时成骨能力受到抑制，且质量浓度为10 μg/L时，成骨分化抑制尤其显著。因此试验选择质量浓度为10 μg/L作为肿瘤坏死因子α的刺激浓度，这为未来牙周炎导致牙周支持组织的丧失提供了新思路。

炎症微环境下人牙周膜干细胞的生物学特性

Biological properties of human periodontal ligament stem cells under inflammatory microenvironment

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