中成药无敌丹对骨关节炎软骨细胞活力和软骨细胞凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.37.015

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (37): 5983-5987.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.37.015

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中成药无敌丹对骨关节炎软骨细胞活力和软骨细胞凋亡的影响

孟亚轲¹，刘岩¹，王宏瑞¹，刘建国²，郭永飞¹

1解放军第二军医大学附属长征医院骨科，上海市 200003； 2解放军第二军医大学药学院药理教研室，上海市 200082

出版日期:2015-09-10 发布日期:2015-09-10
通讯作者: 郭永飞，博士，硕士生导师，解放军第二军医大学附属长征医院骨科，上海市 200003
作者简介:孟亚轲，男，1989年生，河南省郑州市人，汉族，解放军第二军医大学在读硕士，主要从事骨科的研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年项目(31100988)

Effect of Wudi Dan on vitality and apoptosis of cartilage chondrocytes after osteoarthritis

Meng Ya-ke¹, Liu Yan¹, Wang Hong-rui¹, Liu Jian-guo², Guo Yong-fei¹

1Department of Orthopedics, Changzheng Hospital of Second Military Medical University, Shanghai 200003, China; 2Department of Pharmacology, School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200082, China

Online:2015-09-10 Published:2015-09-10
Contact: Guo Yong-fei, M.D., Master’s supervisor, Department of Orthopedics, Changzheng Hospital of Second Military Medical University, Shanghai 200003, China
About author:Meng Ya-ke, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, Changzheng Hospital of Second Military Medical University, Shanghai 200003, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31100988

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究发现，无敌丹能够抑制病变关节局部的炎症反应，保护关节软骨。
目的：验证无敌丹对家兔软骨细胞活力和软骨细胞凋亡的影响及对家兔骨关节炎病变的治疗效果。
方法：用含无敌丹的血清培养基培养大鼠软骨细胞，通过与溶剂对照组对比，观察无敌丹对软骨细胞活力及凋亡的影响；采用改良Hulth法构建兔膝骨关节炎模型，无敌丹给药组给予无敌丹；溶剂对照组给予生理盐水，2次/d，连续给药4周。观察无敌丹对兔膝骨关节炎的治疗作用；镜下观察关节局部的软骨细胞情况；用免疫组织化学的方法检测软骨中白细胞介素1、基质金属蛋白酶3的水平。
结果与结论：无敌丹血清培养的软骨细胞凋亡率显著低于对照组；兔膝关节病理检查显示溶剂对照组软骨破坏程度较高，无敌丹组软骨破坏程度低；免疫组织化学染色显示无敌丹给药组胞质和胞外基质着色浅，阳性细胞数量少，白细胞介素1表达低；无敌丹给药组阳性表达的细胞数量少，着色浅，基质金属蛋白酶3表达被抑制。结果表明，无敌丹能够有效保护家兔骨关节炎病变部位关节软骨，减少炎症反应，对于骨关节炎有很好的治疗作用，其机制可能与抑制软骨细胞凋亡、减少细胞因子的生成及抑制基质金属蛋白酶的蛋白表达有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 软骨细胞, 骨关节炎, 无敌丹, 组织工程, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that Wudi Dan can suppress local inflammatory response of the lesioned joints to protect the articular cartilage.

OBJECTIVE: To verify the effect of Wudi Dan on chondrocyte viability and apoptosis as well as the therapeutic effect on osteoarthritis.

METHODS: Rat chondrocytes were cultured in serum medium containing Wudi Dan, and the effects of Wudi Dan on cell viability and apoptosis were observed by comparison with the control group. Rabbit model of knee osteoarthritis was constructed using modified Hulth method. Rabbit models were divided into two groups: Wudi Dan group treated with Wudi Dan and control group treated with normal saline, twice a day, consecutively for 4 weeks. Therapeutic effect of Wudi Dan on knee osteoarthritis was observed; cell viability and apoptosis were observed under microscope; the levels of interleukin-1 and matrix metalloproteinase-3 were determined using immunohistochemical method.

RESULTS AND CONCLUSION: The apoptotic rate of chondrocytes was significantly lower in the Wudi Dan group than the control group. Pathological findings of the rabbit knee joints showed that the control group had more severe damage to the articular cartilage than the Wudi Dan group. Immunohistochemical staining revealed that in the Wudi Dan group, the cytoplasm and extracellular matrix were colored light and there were a small
number of positive cells as well as low expression of interleukin-1 and matrix metalloproteinase-3. The results suggest that Wudi Dan can effectively protect against articular cartilage lesions, reduce inflammation, and have a good therapeutic effect on osteoarthritis. Its mechanism may be related to inhibition of chondrocyte apoptosis, reduction of cytokine production and inhibition of protein expression of matrix metalloproteinase.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoarthritis, Drugs, Chinese Herbal, Chondrocytes

中图分类号:

R318

孟亚轲，刘岩，王宏瑞，刘建国，郭永飞. 中成药无敌丹对骨关节炎软骨细胞活力和软骨细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(37): 5983-5987.

Meng Ya-ke, Liu Yan, Wang Hong-rui, Liu Jian-guo, Guo Yong-fei. Effect of Wudi Dan on vitality and apoptosis of cartilage chondrocytes after osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(37): 5983-5987.

图/表（结果） 1

2.1 中药无敌丹对培养大鼠软骨细胞活力的影响对用普通胎牛血清培养的软骨细胞和用含无敌丹血清培养的软骨细胞经MTT染色后用酶标仪进行检测，其测量的A值越高，表示细胞的活力指数越高。检测结果如下：用普通胎牛血清培养的软骨细胞的A值为0.116，而用含有无敌丹血清培养的大鼠软骨细胞A值为0.499，说明用含有无敌丹血清培养的大鼠软骨细胞活力明显高于胎牛血清组 (P < 0.001)。 2.2 中药无敌丹对培养大鼠软骨细胞凋亡的影响经过对培养好的软骨细胞缺氧处理会有较高的细胞凋亡率，经用流式细胞仪测试发现，用普通胎牛血清培养的软骨细胞凋亡率为45.3%；而用含有无敌丹血清培养的软骨细胞凋亡率仅有16.2%，显著低于对照组(图2)。 2.3 实验动物数量分析实验选用新西兰家兔14只，分为2组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。 2.4 兔关节病理检查结果软骨细胞分3层，表层软骨细胞呈梭形，近似水平排列，中间层软骨细胞呈散在无序排列。柱状层软骨细胞呈柱状排列，其下方为潮线。马松染色软骨细胞核呈深蓝色，基质呈蓝绿色，软骨下骨及骨组织呈红色。溶剂对照组(图3A)染色轻度不均，红染区较多，胶原纤维数量减少。软骨表面整齐，软骨细胞数量较少，细胞排列较紊乱，潮线模糊，无法辨认，软骨破坏程度较高。无敌丹组(图3B)基质染色均匀，染色较深，胶原纤维数量较多，排列整齐。软骨表面整齐，软骨内细胞数量较多、密度均匀，潮线清晰，软骨破坏程度低。 2.5 免疫组织化学检查家兔关节软骨上的炎症反应情况白细胞介素1免疫组织化学染色结果显示：溶剂对照组关节软骨细胞上炎症因子白细胞介素1阳性表达，其胞浆和胞外基质被染成棕黄色，着色区域较大，着色深，说明软骨上炎症反应明显。无敌丹给药组胞质和胞外基质着色浅，阳性细胞数量少，白细胞介素1表达低，说明无敌丹对于降低炎症反应有非常明显的作用(图4)。基质金属蛋白酶3 主要作用是降解细胞外基质蛋白质，是骨关节炎软骨退行性变的主要因素之一。通过下调关节软骨基质金属蛋白酶3的表达可以减少胶原纤维和蛋白多糖的降解，直接保护关节软骨。基质金属蛋白酶3免疫组织化学染色结果显示：溶剂对照组关节软骨细胞阳性表达的胞浆和胞外基质着色，呈棕黄色，着色区域较大，着色较深，基质金属蛋白酶3高表达。无敌丹给药组阳性表达的细胞数量少，着色浅，基质金属蛋白酶3表达被抑制，说明无敌丹对于保护关节软骨有非常明显的作用(图5)。

参考文献

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引言

骨关节炎是一种以关节软骨退行性变和继发骨质增生为特征的慢性关节疾病，病变可累及关节软骨、滑膜、关节囊及关节周围肌肉，是不同因素作用所致的不可逆关节损害。骨关节炎多见于中老年人，女性多于男性，好发于负重较大的膝关节、髋关节、脊柱及远侧指间关节等部位，该病亦称为骨关节病、退行性关节炎等。

骨关节炎是由多种因素引起的关节软骨纤维化、皲裂、溃疡、脱失导致的关节疾病^[1]，主要变现为活动时的关节疼痛及不同程度的肢体肿胀、僵硬、活动障碍，病程长、症状重者可出现关节畸形，给患者带来极大的生活困难。随着人口的老年化和肥胖化，骨关节炎在全球范围内发病率呈现逐年上升趋势。据不完全统计，国内50岁以上人口骨关节炎发病率逐年升高，国外60岁以上发病率高达78%^[2]。骨关节炎将成为降低老年人生活质量的主要原因之一，现已引起社会和医学界的高度重视。

骨关节炎的治疗方法众多，包括非药物治疗、药物治疗及手术治疗，其中中医药在骨关节炎治疗方面历史悠久，疗效肯定。李克文、刘忠伦等^[3]学者都证实了中医药在骨关节炎中的治疗效果。祖国医学历史悠久，众多医家运用中医理论对骨关节炎的治疗，在改善骨关节炎症状、延缓骨关节炎进程等方面积累了相当多的经验。而且，中医治疗疾病的整体观念、辨证施治和遣方用药的理论，在治疗骨关节炎这样成因复杂的疾病中显示出独特的理论和疗效。无敌丹胶囊系临床应用多年的经验方，主要由黄芪、三七、苏木、血竭、肉苁蓉、五加皮、续断、制乳香、制没药、当归、杜仲等中药组成，具有补气养血、祛风除湿、消肿止痛之功，临床主要用于急慢性(软组织)扭挫伤、骨折、骨质增生、风湿疼痛、关节炎、体虚腰膝疼痛等病症。实验旨在观察无敌丹对家兔软骨细胞活力、软骨细胞凋亡的影响及对家兔骨关节炎病变的治疗效果，为临床应用提供实验依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计分组对照观察。

1.2 时间及地点实验于2014年7至11月在解放军第二军医大学药学院实验中心完成。

1.3 材料

实验动物：4周龄雄性SPF级SD大鼠2只用于制备大鼠软骨细胞，动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016；6个月龄雄性新西兰家兔14只，体质量(2.5±0.5) kg。动物生产许可证号：SCXK(沪)2012-0007。

中成药无敌丹对骨关节炎软骨细胞活力和软骨细胞凋亡的影响实验所用药物、试剂与仪器：
药物、试剂与仪器	来源
无敌丹胶囊(内容物为红棕色至褐色粉末，气微香，味苦。规格：0.4 g/粒，批准文号：国药准字Z53020659，生产批号：20130507，室温储存，使用时将胶囊内的药粉倒出，用蒸馏水溶解后使用。成分：黄芪、血竭、三七、杜仲、熟地黄、羌活、乳香(制)、没药(制)、香加皮、细辛、当归、骨碎补等20味)	云南无敌制药有限责任公司
甲醛(规格：500 mL，产品批号：20140702)	国药集团化学试剂有限公司
Ⅱ型胶原酶(规格：1 g/瓶，批号：461699)	Gibco公司
MTT(噻唑蓝)(批号：LJ0628A5010J)	AMRESCO公司
凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(生产批号：20130709)	南京凯基生物科技发展有限公司

1.4 实验方法

1.4.1 含药血清制备大鼠用无敌丹灌胃1次/d，连续 7 d，末次给药后1.5 h麻醉动物，从股动脉取血离心留血清。56 ℃灭菌30 min，经0.22 μm滤膜过滤分装，-20 ℃保存备用。

1.4.2 软骨细胞的制备与鉴定取4周龄SD大鼠，断颈处死，用Ⅱ型胶原酶消化法制备大鼠软骨细胞并进行鉴定^[4]。将软骨细胞置于25 mL的培养瓶中于37 ℃，在体积分数5%的CO₂培养箱中培养3 d，对软骨细胞进行鉴定将载玻片放在处于对数生长期的软骨细胞培养液中，软骨细胞会附于载玻片上，待细胞贴壁后3 d取出载玻片，用PBS清洗后放入40 g/L的多聚甲醛固定液中固定30 min，再次PBS清洗。载玻片上加入体积分数3%的过氧化氢，室温下放置10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS清洗。用体积分数10%的牛血清白蛋白(BSA)室温下封闭20 min，倾去血清(勿冲洗)。在细胞爬片上滴加1∶200的一抗工作液，37 ℃孵育1.5 h，PBS清洗。滴加1∶200的二抗工作液，37 ℃孵育 30 min，PBS清洗。DAB显色：取1 mL蒸馏水，加试剂A、B、C各1滴，混匀后加之爬片，室温下显色8 min；用PBS清洗，晾干后观察细胞爬片，软骨细胞显示为黄棕色(图1)。

1.4.3 家兔膝骨关节炎模型的构建及实验方法采用改良Hulth法构建兔膝骨关节炎模型^[5]，戊巴比妥钠(40 mg/kg)耳缘静脉注射麻醉，侧卧于兔台，右膝关节剃毛、体积分数75%乙醇消毒。从膝关节内侧切口进入关节腔，将髌骨向外侧，膝关节屈曲位，暴露半月板，在直视下切除内侧半月板的前1/3部分、切断前交叉韧带。抽屉实验证明前交叉韧带完全断裂后，生理盐水冲洗切口，使用3-0手术丝线逐层关闭切口。肌肉注射青霉素40×10⁴U/只，连续3 d，以防感染。

实验动物分组：按照组间均衡一致的原则，将14只家兔用完全随机数字法分为2组，每组7只。

手术次日开始给药，无敌丹给药组灌胃给予无敌丹，65 mg/kg，2次/d；溶剂对照组灌胃给予生理盐水，5 mL/kg，2次/d，连续给药4周。末次给药结束1 h后，耳缘静脉注射空气处死家兔，取家兔膝关节，浸泡于体积分数10%甲醛中固定3 d后，再浸泡于脱钙液中进行脱钙处理。骨骼脱钙完成后制作病理切片，检查软骨破坏程度、并用免疫组织化学的方法检测软骨中白细胞介素1、基质金属蛋白酶3的水平。

1.4.4 检测方法及检测指标

软骨细胞活力、细胞凋亡指数：培养5 d后，将大鼠软骨细胞消化后以10⁸ L^-1接种于96孔培养板，其中一只培养板加入含有胎牛血清的培养液，另一只加入含有无敌丹血清的培养液，培养5 d后，每孔加入5 g/L 的MTT溶液20 μL，37 ℃继续孵育4 h，终止培养，吸弃上清液，每孔加入150 μL的二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分溶解。比色：选择570 nm的波长，在酶联检测仪上检测各孔的A值，记录结果。A值越高，代表细胞活力越高，空白孔调零。将2组细胞置于温度为37 ℃、CO₂体积分数5%，O₂体积分数1%的三气培养箱中进行缺氧处理，缺氧时间为5.5 h。消化细胞后，按凯基细胞凋亡检测试剂盒的要求用流式细胞仪测试细胞凋亡的情况。

关节病理检查：采用胶原纤维染色(马松染色)观察软骨破坏程度；采用免疫组织化学方法检查兔关节软骨白细胞介素1、基质金属蛋白酶3的表达。

1.5 主要观察指标 ①中药无敌丹对培养大鼠软骨细胞活力和软骨细胞凋亡的影响。②兔关节病理检查结果。③兔关节软骨白细胞介素1和基质金属蛋白酶1表达。

1.6 统计学分析实验结果用x(_)±s表示，与溶剂对照组(实验对照组)进行等方差组间两样本均数比较的t 检验统计分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨关节炎又称退行性骨关节病，是一种累及关节软骨、软骨下骨、关节滑膜等多种组织的疾病，关节软骨的退行性改变是该病的主要病理变化，通过建立骨关节炎的动物模型进行实验研究是对其发病机制、治疗及预防研究的必要手段^[6]。目前，骨关节炎的发病机制还不完全清楚。有研究表明软骨细胞破坏和细胞外基质降解等是该病发生的重要因素，近年，软骨细胞凋亡在骨关节炎病理过程中发挥的作用也越来越受到重视^[7]。Blanco等^[8]运用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)技术报道了骨关节炎患者关节存在软骨细胞凋亡异常，发现软骨细胞凋亡主要位于浅层和中层，但细胞凋亡并不是在所有的软骨细胞中同时发生，这和骨关节炎软骨退化是一个缓慢的过程相符合。之后，Hashimoto等^[9]相继对软骨细胞凋亡对骨关节炎的影响也做出了报道，但诸多学者对软骨细胞凋亡发生的主要部位及比例的报道尚不一致^[10]，软骨细胞凋亡具体的机制尚不清楚，需进一步的研究。相反，Aigner的研究发现，在老年性骨关节炎或低分级的骨关节炎中未检测到有意义的空陷窝，这表明软骨细胞的坏死或凋亡在骨关节炎或人关节软骨的老化过程中影响有限^[11]。白细胞介素1作为一种炎症递质，是调节炎症的始动因素白细胞介素1包括白细胞介素1α和白细胞介素1β两种亚型，其中白细胞介素1β是细胞外白细胞介素1的主要成分，学者认为白细胞介素1β在骨关节炎动物模型中发挥关键性作用^[12]。研究发现，白细胞介素1β在骨关节炎患者的滑膜、关节滑液、软骨、软骨下骨等处都明显升高，白细胞介素1β受体在骨关节炎患者的软骨细胞及成纤维样滑膜细胞中表达升高。白细胞介素1β通过炎症反应和分解代谢效应在骨关节炎疾病的发生、发展中发挥重要作用。白细胞介素1对骨关节炎的影响是多方面的^[13]：白细胞介素1β抑制软骨细胞合成细胞外基质，干扰Ⅱ型胶原蛋白、蛋白多糖等主要结构蛋白的合成；影响软骨细胞酶类的合成代谢活动，诱导基质金属蛋白酶(主要是基质金属蛋白酶1，3，13)的合成，引起软骨基质降解，促进软骨变性；产生强大的促炎作用，造成关节软骨生存的恶劣微环境；与肿瘤坏死因子α相互作用加速软骨细胞的老化与凋亡；白细胞介素1β能刺激活性氧自由基的产生，活性氧自由基通过产生过氧化物、羟基激进分子对关节软骨产生破坏作用。基质金属蛋白酶是一组锌与钙离子依赖性的肽链内切酶，它们的生物学功能主要是降解细胞外基质蛋白质,其中，基质金属蛋白酶3也叫间充质溶解素。滑膜细胞和软骨细胞均能分泌基质金属蛋白酶3，有研究认为在骨关节炎患者的疾病发生发展过程中，基质金属蛋白酶3在降解基质方面发挥关键性作用^[14]。另外，有研究表明，破骨细胞在早期骨关节炎疾病进程中起了重要作用^[15]，在骨关节炎早期，软骨下骨的破骨细胞活动增强，从而导致骨吸收作用明显强于成骨作用，进而引起软骨下骨的骨量丢失，骨质量下降。在软骨下骨的骨吸收作用中，基质金属蛋白酶3可降解关节中的骨基质，特别是破骨细胞表达的基质金属蛋白酶3可能在软骨下骨的骨吸引中起重要作用，但有关早期骨关节炎软骨下骨基质金属蛋白酶3表达的研究在国内外报道目前较少。最近，Chen等^[16]发现基质金属蛋白酶3与骨关节炎的疾病的进展密切相关，甚至可以作为诊断骨关节炎的早期指标。祖国的传统医学理论认为骨性关节炎的病因机制以肝肾亏虚、气血不足为本，局部气滞血瘀、经络痹阻为标，其中气滞血瘀是形成骨性关节炎的一个关键因素，而这与骨内微循环障碍的本质是一致的。三七、苏木、血竭、当归、制乳香等有明显的活血化瘀作用，而黄芪、五加皮、肉苁蓉、杜仲又具有补肾益气的疗效，无敌丹胶囊中通过以上机制改善了骨内血流动力学和血液流变学状态，从而起到保护关节软骨、防治骨性关节炎的作用。因此活血化瘀、改善组织微循环状态就成为治疗骨性关节炎的主要环节。无敌丹胶囊对家兔关节液中白细胞介素1β子水平有显著降低作用，为其抗炎功效提供了重要证据；无敌丹给药组关节局部基质金属蛋白酶3表达水平明显降低，为其具备软骨保护作用提供了依据，此外镜下观察发现，无敌丹组的关节软骨和正常组相比无明显退变，而溶剂对照组组的关节软骨则出现明显退行性改变，说明无敌丹可改善关节固定造成的膝关节面软骨的退行性改变，对处于病变条件下的软骨具有保护作用，对已造成退行性改变的关节软骨有减轻和改善其病变程度的作用。综上所述，无敌丹能够有效保护家兔骨关节炎病变部位关节软骨，减少炎症反应，对于骨关节炎治疗有很好的作用。其机制可能与抑制软骨细胞凋亡、减少细胞因子的生成及抑制基质金属蛋白酶的蛋白表达有关。但无敌丹抑制软骨细胞凋亡，降低白细胞介素1和基质金属蛋白酶3水平的具体机制还需要进一步的研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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