膝骨性关节炎差异表达蛋白血清标记物筛选：iTRAQ技术的重要性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.37.010

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (37): 5955-5960.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.37.010

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

膝骨性关节炎差异表达蛋白血清标记物筛选：iTRAQ技术的重要性

梁海波¹，苏伟¹，罗世兴²，董桂甫²，龙光华²，覃育接²

1广西医科大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530021； 2广西医科大学第九附属医院，广西壮族自治区北海市 536000

出版日期:2015-09-10 发布日期:2015-09-10
通讯作者: 罗世兴，博士，副教授，副主任医师，硕士生导师，广西医科大学第九附属医院，广西壮族自治区北海市 536000
作者简介:梁海波，男，1987年生，广西壮族自治区桂林市人，汉族，广西医科大学在读硕士，主要从事创伤骨科、关节外科研究。
基金资助:
广西科技厅青年基金(2012GXNSFBA053124)；国家自然科学基金(81460345)

iTRAQ technology is important to screen serum markers of differentially expressed proteins in knee osteoarthritis

Liang Hai-bo¹, Su Wei¹, Luo Shi-xing², Dong Gui-fu², Long Guang-hua², Qin Yu-jie²

1First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Ninth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Beihai 536000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Online:2015-09-10 Published:2015-09-10
Contact: Luo Shi-xing, M.D., Associate professor, Associate chief physician, Master’s supervisor, Ninth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Beihai 536000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Liang Hai-bao, Studying for master’s degree, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the Youth Fund of Guangxi Science and Technology Department, No. 2012GXNSFBA053124; the National Natural Science Foundation of China, No. 81460345

摘要/Abstract

摘要：

背景：在临床上对于早期膝关节骨性关节炎尚缺乏有效的诊断方式。蛋白质组学是从整体的角度分析细胞的所有蛋白质组成、表达水平及修饰状态的学科，可以了解蛋白与蛋白间的相互作用及联系，从而揭示蛋白功能与细胞生命活动的规律。

目的：通过对骨性关节炎K/L分级的各阶段的血清样本进行ITRAQ定量蛋白组学分析检测，以发现骨性关节炎各个时期的的潜在分子标志物。

方法：收集膝关节骨性关节炎患者60例，参照Kellgren-Lawrence(K-L)分级标准，分为K-L 0、Ⅱ、Ⅳ级的亚组，每个亚组随机选取10例男性与10例女性。去除血清高丰度蛋白，进行稳定同位素116、117、118的iTRAQ标记、反相色谱柱分离、质谱检测及Swissport数据库检索；再利用生物信息学软件进行分析。

结果与结论：通过对不同样品的iTRAQ肽段实验标记、Q-star质谱鉴定和MASCOT搜库，共筛选出有意义差异蛋白169个，K-L 0级与K-L Ⅳ级差异蛋白153个；K-L 0级与K-L Ⅱ级差异蛋白153个；K-L Ⅱ级与K-L Ⅳ级差异蛋白145个。结果表明应用iTRAQ技术可筛选出与骨性关节炎发生发展的多个差异蛋白，提示iTRAQ技术对于骨性关节炎蛋白质组学血清生物标记物的研究有重要意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 骨性关节炎, iTRAQ, 血清生物标志物, 组织工程, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: There is lack of effective diagnostic methods for early knee osteoarthritis. Proteomics refers to the large-scale experimental analysis of proteomes from the overall level of intracellular protein compositioon, expression and modification, based on which, we can understand protein-protein interaction and relationship, thereby revealing protein functions and cell activity patterns.
OBJECTIVE: To apply the isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) to identify proteins differentially in serums of osteoarthritis Kellgren-Lawrence classification at each stage, and to find out potential molecular markers at each stage of osteoarthritis.
METHODS: Sixty patients with knee osteoarthritis were enrolled, and according to Kellgren-Lawrence (K-L) grading, they were subdivided into K-L 0, II and IV groups. There were 10 males and 10 females randomly selected in each group. Proteins differentially regulated in serums were identified by the stable isotopes 116, 117, 118 of the iTRAQ labeled, reversed-phase column separation, mass spectrometry and Swissport database search, after the serums were subjected to high abundance proteins depletion. Finally, we analyzed the proteins identified by using bioinformatics software.
RESULTS AND CONCLUSION: Totally 169 proteins were identified through iTRAQ peptides experiments of different sample tags, Q-star mass spectrum identification and MASCOT library search. 153 proteins were identified as K-L 0 to K-L IV, 153 proteins were identified as K-L 0 to K-L II, and 145 proteins were identified as K-L II to K-L IV. iTRAQ technology may help to identify novel serum markers for early diagnosis of knee osteoarthritis, indicating iTRAQ technology for proteomics serum biomarkers of osteoarthritis study has good application prospect.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoarthritis, Proteomics, Adiponectin

中图分类号:

R318

梁海波，苏伟，罗世兴，董桂甫，龙光华，覃育接. 膝骨性关节炎差异表达蛋白血清标记物筛选：iTRAQ技术的重要性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(37): 5955-5960.

Liang Hai-bo, Su Wei, Luo Shi-xing, Dong Gui-fu, Long Guang-hua, Qin Yu-jie. iTRAQ technology is important to screen serum markers of differentially expressed proteins in knee osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(37): 5955-5960.

图/表（结果） 3

2.1 iTRAQ-2DLC-MS/MS技术对血清差异蛋白质的筛选所有数据利用Applied Biosystems ProteinPilot software 4.5软件进行肽段及差异蛋白质的鉴定和定量搜库，对处理后的血清样品进行iTRAQ肽段实验标记、Q-star质谱鉴定、MASCOT搜库，2次实验一共鉴定出306个(95%可信度)差异蛋白。在这些蛋白中，以邻近时间点蛋白比值> 1.2或< 0.8，P < 0.05，EF< 2为差异蛋白筛选标准，共筛选出有意义差异蛋白169个，K-L 0级与K-L Ⅳ级差异蛋白153个；K-L 0级与K-L Ⅱ级差异蛋白153个；K-L Ⅱ级与K-L Ⅳ级差异蛋白145个。 2.2 将所有筛选出的169个差异蛋白进行GO分类结果结果发现，在细胞定位方面，这些蛋白主要位于细胞外基质(71%)。在生物学过程方面，这些差异蛋白主要参与炎症反应(51%)、免疫反应(35%)等生物学过程。在分子功能方面，这些差异蛋白主要涉及酶活性、细胞骨架的方面。见图1。

2.3 差异表达蛋白质的蛋白-蛋白相互作用STRING网络分析结果所鉴定到的差异蛋白中，部分蛋白的功能已知，并有相关文献报道其与肝癌发生有关系。而部分功能未知的差异蛋白成为值得探讨的目标。通过STRING蛋白-蛋白相互作用网络分析发现，有一些差异蛋白和其它差异蛋白间存在广泛的相互作用，即在分子对话(cross-talk)中起到关键作用。如图2可知，在差异蛋白中具有关键作用的蛋白有FN1、PPBP、P4HB、CD4和TIPM1等。他们在网络中与超过5个以上差异蛋白发生相互作用，是网络的关键性节点，因此他们是研究骨性关节炎发生的候选分子。

2.4 KEGG通路的富集度分析结果进一步对参与各类生物过程的蛋白质进行富集度分析。结果所有匹配到63条KEGG通路，其中6条显著富集，见表2。

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引言

膝关节骨性关节炎是运动系统的常见多发病，好发于40岁以上的中老年女性人群，国内六大城市抽样的女性膝关节骨性关节炎发病率高达32.8%。膝骨性关节炎常表现为膝痛、僵直及功能障碍，晚期病变者可导致劳动力丧失，给个人和社会造成沉重的负担^[1-2]。膝骨性关节炎发病机制尚不十分清楚，但有研究表明绝经后的女性，无论患病率，还是症状严重度均远超过同年龄段的男性^[3]。目前，骨性关节炎的发病机制还不是十分明确。膝关节骨性关节炎病因与发病机制目前尚未完全明了，早期的骨性关节炎缺少十分有效的诊断方式。蛋白质组学是从整体的角度分析细胞的所有蛋白质组成、表达水平及修饰状态的学科，可以了解蛋白与蛋白间的相互作用及联系，从而揭示蛋白功能与细胞生命活动的规律^[4]。目前，蛋白质组学技术已逐步成为寻找疾病标志物的主要方法之一。有研究者采用2-D DIGE技术，分别比较类风湿关节炎和骨性关节炎关节液和血浆蛋白组差异，发现钙粒蛋白B、血清淀粉样蛋白A两种蛋白质在类风湿性关节炎病例组中高表达^[5]。De Seny等^[6]采用激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)方法寻找骨性关节炎特异血清蛋白标志物，比较蛋白质图谱的差异，再经排除分析筛选、确认了4种与骨性关节炎的发生发展的潜在生物标记物：V65玻璃粘连蛋白、C3F缩氨酸、CTAP-III和M/Z3762蛋白质。然而，同位素标记相对和绝对定量 (isobaric tag for relative and absolute quantitation， iTRAQ)技术是近年来应用较广泛的一种最新开发的蛋白质组学定量技术^[7]，该方法具有灵敏度高、分离能力强、适用范围广、高通量、结果可靠、自动化程度高的特点。本实验采用iTRAQ标记技术结合液相色谱串联质谱(liquld chromatography-tandem mass spectrometry， LC-MS/MS)技术^[8]。参照Kellgren-Lawrence(K-L)分级标准^[9]，分为K-L 0，Ⅱ，Ⅳ级3个亚组；3组样本的血清分别进行定量蛋白质组学分析，筛查骨性关节炎的各阶段差异蛋白分子。筛选出骨性关节炎相关的具有潜在应用价值的差异蛋白。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计分组对照观察。

1.2 时间及地点实验于2012年2月至2013年12月在广西医科大学第一附属医院完成。

1.3 对象收集2012年2月至2013年12月广西医科大学第一附属医院及广西医科大学第九附属医院就诊的膝关节骨性关节炎患者的血清。

1.3.1 诊断标准采用美国风湿病学院(ACR)膝关节骨性关节炎诊断标准进行诊断^[10]。

1.3.2 纳入标准 ①符合膝关节骨性关节炎诊断标准。②通过临床和影像学检查确诊，记录性别、年龄、骨关节疾病史、月经史等。③临床资料记录完整。

1.3.3 排除标准膝外伤手术史、膝关节感染、成年前膝关节畸形、代谢性骨病、下肢不等长、膝关节肿瘤史等的病例，任何患有甲状腺和甲状旁腺功能亢进、肝肾疾病、糖尿病等影响骨代谢疾病，及近期服用雌激素、孕激素治疗者。

1.3.4 分组标准参照X射线检查及K-L分级标准把膝骨关节炎分5级，为了简化分组按照病情的正常、中度、重度，分为K-L 0，Ⅱ，Ⅳ级3组，患者的年龄及HSS评分见表1。

1.4 方法

1.4.1 采集标本受试对象隔夜禁食12 h，清晨采肘静脉血5 mL，6 h内3 500 r/min离心5 min，提取血清，置于-80 ℃超低温冰箱保存待检。

1.4.2 去除血清高丰度蛋白按照安捷伦多重亲和去除系统所带的标准液相色谱(LC)操作程序，去除人血清原液中高丰度蛋白。收集各管洗脱液，-80 ℃保存待用。

1.4.3 iTRAQ定量蛋白质组学分析

BCA法测定低丰度蛋白浓度：按照BCA试剂盒说明书准备标准品。以酶标仪测562 nm吸光度值，并绘制标准曲线。根据标准曲线，计算样品的浓度。根据测定的浓度每组取100 μg蛋白分装，同时取20 μg蛋白进行SDS-PAGE。其余蛋白-80 ℃保存。

蛋白还原和半胱氨酸封闭：向每管样品中分别加入2 μL还原剂TCEP(tris 2-carboxyethyl phosphine)，涡旋混合，离心，60 ℃孵育1 h。然后，向每管内各加入1 μL 10 mmol/L半胱氨酸封闭剂(s-methylmethanethiosulfonate， MMTS)，涡旋混合，离心，室温孵育10 min。

胰酶消化：按1∶40(胰酶∶蛋白质)的比例向每管内加入消化酶，涡旋混合，37 ℃孵育过夜。

iTRAQ试剂标记：每管iTRAQ试剂瓶内加入70 μL乙醇，涡旋混合，使之溶解后转入样品管。其中，116标记OA-0级组，117标记OA-Ⅱ级组，118标记OA-Ⅳ级组。同时进行技术重复1次，116标记OA-0级组，117标记OA-Ⅱ级组，118标记OA-Ⅳ级组。涡旋混合，再将iTRAQ标记后的6组液体予以混合，冻干。用C18柱子除盐。

反相液相色谱(RPLC)：用50 μL RPLC A相(5% ACN，0.1%FA，pH 10)稀释冻干的iTRAQ试剂标记的肽段混合样品。经装有反相分离柱ZORBAX 300SB-C18 column(5 μm，30 nm，0.1×15 mm，Microm，USA) 的反相液相色谱RPLC进行分离。顺梯度每2 min均收集35份馏分，冻干，进行第二维分析。

RPLC-Q-Star XL MS/MS分析与数据处理：每一份馏分的肽段经真空冻干，用50μLRPLC A相(5%CAN，0.1%FA)加以溶解。先经装有反相分离柱ZORBAX 300SB-C18 column (5 μm，30 nm，0.1×15 mm，Microm，USA)的反相液相色谱RPLC进行分离，色谱分离90 min，梯度：B% (95%ACN，0.1%FA)从5 min 5%到70 min上升至35%。从反相色谱柱洗脱出的多肽通过在线连接的QSTAR XL MS/MS质谱仪(Qstar Pulsar^TM，Applied Biosystems-MDS Sciex)进行串联质谱分析。在IDA模式下，先进行MS 400- 1 800范围的扫描，然后再对其进行MS/MS 100- 2 000范围的扫描，每个强阳离子碎片都进行双重分析，然后选择4个最强的母离子进行串级离子扫描。

在质谱分析鉴定特殊肽离子片断结构的基础上，将用Analyst QS 1.1软件采集到的质谱分析数据导入美国应用生物系统公司基于Paragon算法的ProteinPilot 3.0软件，对每一个肽段进行鉴定。全部的RAW数据利用Applied Biosystems ProteinPilot software 4.5 (revision 1656)进行蛋白数据库的搜索和分析处理，在人蛋白质数据库中进行蛋白搜索，设计蛋白鉴定的条件如下：

对Swissport数据库(SP HUMAN 20111015.fasta)进行检索鉴定蛋白，报告置信度在95% (Protscore > 1.3)以上的蛋白质，同时用116、117、118报告离子的峰面积积分进行相对定量分析。进样误差通过软件自带的统计学偏畸值校正(Bias correction)功能进行归一化处理。鉴定蛋白采用置信Cutoff值为ProtScore(unused)>1.3，Confidence Interval>95%并满足EF< 2且P < 0.05，以邻近时间点蛋白值> 1.2或< 0.8为差异蛋白筛选标准。

生物信息学分析：将用iTRAQ方法筛选出的差异蛋白汇总后。对所有差异蛋白应用IPI数据库网站按照其生物学功能及在机体内参与的生理学反应过程进行GO(Gene Ontology)分类，对其生物学过程(Biological Process，BP)、亚细胞定位(Cellular Component，CC)和分子功能(Molecular Function，MF)等进行分析。然后用STRING提供的蛋白质调控网络和相互作用网络进行差异表达蛋白质的蛋白-蛋白相互作用分析。

1.5 主要观察指标 ①iTRAQ-2DLC-MS/MS技术对血清差异蛋白质的筛选。②将所有筛选出的169个差异蛋白进行GO分类结果。③差异表达蛋白质的蛋白-蛋白相互作用STRING网络分析结果。④KEGG通路的富集度分析结果。

讨论

骨性关节炎是以关节软骨进行性退变为基本特征的常见病之一^[11]。随着社会人口的老龄化，骨性关节炎的患病率日益增加。传统的治疗药物虽对缓减疼痛有良好的疗效，但不能阻断骨性关节炎软骨退变区的病灶扩大，甚至加速骨性关节炎的病理进程^[12]。迄今为止骨性关节炎患者关节软骨退变的机制尚未完全明确，除机械性损伤和炎症会导致关节软骨退变外，还有多种因素参与^[13]。因此，进一步了解骨性关节炎的分子机制及寻找新的早期诊断标志物成为目前研究的热点。骨性关节炎的发生是一个多因素参与的复杂病理过程，在这一过程中，患者的血清蛋白表达谱也会发生相应的复杂变化^[14]。因此，本次实验通过对比K-L 0、Ⅱ、Ⅳ级3组血清样本观察骨性关节炎发生过程的血清蛋白质组动态变化，探索骨性关节炎发生过程中的生物分子标志物。近年来，蛋白质组学技术已被广泛的应用于各种疾病的研究，是分析蛋白表达谱有力的工具^[15]。在肿瘤研究方面已经有了大量研究，如肺癌^[16]、肾癌^[17]、胃癌等^[18]。标本多为肿瘤组织，在临床上获取比较难。而血清在临床上较易获得，患者痛苦少。通过iTRAQ标记技术结合LC-MS/MS技术共筛选到差异有显著性意义的差异蛋白169个。其中FN1是细胞外间质中的一种粘连糖蛋白，主要以2种形式分布于血浆和组织中分别是血浆型纤维粘连糖蛋白、细胞型纤维粘连糖蛋白^[19]。冯立等^[20]通过在培养成骨细胞时加入FN1可促进骨细胞的生长。发现FN1在成骨细胞的代谢中发挥着重要的作用，是骨细胞存活、增殖、成骨过程中不可或缺的蛋白。在骨性关节炎后期，手术切开膝关节时可见关节周围软骨增生十分明显，皱襞滑膜增多增厚^[21]。本实验中结果示FN1在骨性关节炎患者的血清是升高的，与之前的研究相符。因此，在骨性关节炎的进程中，上调的粘连蛋白可能作用于修复关节丢失的骨质或骨质的异常增生。同时说明FN1浓度在骨性关节炎的中期和晚期的组织内和血清中同时上升，但血清的FN1浓度测定较简易。可作为早期诊断骨性关节炎的生物标记蛋白。同时，国外学者Hampel Sesselmann认为其是一种无菌性炎症性的退行性骨关节病，机体发生强烈的异常炎症反应分泌大量的细胞因子和炎症递质，引起体内细胞因子和炎症递质水平的异常变化^[22]。而细胞因子和炎症递质如：白细胞介素^[23]、HIF等通过自分泌和旁分泌形式作用于软骨组织^[24]，引起软骨基质的降解及破坏。因此，包括PPBP(趋化因子蛋白)在内的多种细胞因子和炎症递质参与膝骨性关节炎的发生、发展和预后的病理过程，细胞因子和炎症递质在膝骨性关节炎发病机制中的介导作用是探索研究骨性关节炎发病机制的一个潜在的方向。此外P4HB(羟脯氨酰基4)、CD4和TIPM1(基质金属蛋白酶组织抑制因子1)等差异蛋白^[25-27]，在其他文献也有报道过与骨性关节炎相关。在筛选的蛋白中处于蛋白相互作用的中心，而且也属于PATHway的信号通路中。因此可作为骨性关节炎血清清标记物的候选分子。本研究采用iTRAQ技术筛选出了一系列骨性关节炎相关的血清差异蛋白。但iTRAQ技术灵敏度高、特异性较差。筛选出较多相关的差异蛋白。这些蛋白可能参与了一个或者多个的调控通路或发病机制。需要进一步深入的研究其机制。然而，筛选出来的差异蛋白是进行这深入研究的前提。总之，iTRAQ技术用于骨性关节炎生物标记物的研究有很好的前景。蛋白在骨性关节炎发生发展中的作用尚未完全清楚，需要进一步评价这些血清差异蛋白作为诊断骨性关节炎的候选标志物的可靠性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

膝骨性关节炎差异表达蛋白血清标记物筛选：iTRAQ技术的重要性

iTRAQ technology is important to screen serum markers of differentially expressed proteins in knee osteoarthritis

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