飞秒激光处理促进人牙周成纤维细胞在纯钛材料表面的增殖和分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.34.004

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前对种植体表面优化处理促进人工牙种植体骨整合的形成是近年来这一领域的研究热点，而通过飞秒激光这种表面处理钛金属表面改性促进成纤维细胞的增殖和分化的相关性研究报道较少。

目的：观察飞秒激光处理对于人牙周膜成纤维细胞在钛金属表面增殖和分化的影响。

方法：将人牙周膜成纤维细胞接种在分别经过飞秒激光处理、TiO₂颗粒喷砂和砂纸顺向抛光的纯钛片表面(飞秒激光组，TiO₂颗粒喷砂组和对照组)，观察细胞增殖和分化情况。

结果与结论：与对照组相比，飞秒激光组和TiO₂颗粒喷砂组钛片表面粗糙度明显增加，表面细胞密度明显增加，RUNX2和OSX mRNA表达水平增加；且飞秒激光组上述指标高于TiO₂颗粒喷砂组。提示飞秒激光处理的纯钛表面更加粗糙，更有利于人牙周膜成纤维细胞的增殖和分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 生物材料, 口腔生物材料, 飞秒激光, 纯钛, TiO₂颗粒喷砂, 细胞增殖, 细胞分化

Abstract:

BACKGROUND: Currently, the implant surface is optimized to promote the osseointegration of artificial dental implants, which has become a research focus in recent years. But the femtosecond laser is less reported to modify the titanium surface so as to promote fibroblast proliferation and differentiation.

OBJECTIVE: To observe the effect of femtosecond laser on the proliferation and differentiation of human periodontal ligament fibroblasts on titanium surface.

METHODS: Human periodontal ligament fibroblasts were respectively inoculated on different titanium surfaces of the three groups (femtosecond laser group, TiO₂ particle blasted group and pure titanium group). Then differentiation and proliferation of human periodontal ligament fibroblasts were observed.

RESULTS AND CONCLUSION: There was a significant difference in the surface roughness among these three groups, and compared with the pure titanium group, the attached cells were more in the femtosecond laser group and TiO₂ particle blasted group. mRNA expressions of RUNX2 and OSX were highest in the femtosecond laser group followed by TiO₂ particle blasted group and pure titanium group in order. These findings indicate that pure titanium treated with femtosecond laser has fine biological property and may be more feasible for human periodontal ligament fibroblasts to attach, grow and proliferate.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Titanium, Lasers, Surface Properties, Fibroblasts

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

设计：随机对照细胞学实验。

时间及地点：实验于2014年6月至2015年4月在成都医学院第一附属医院中心实验室完成。

材料：人牙周膜组织选取于成都医学院第一附属医院口腔科门诊因正畸拔除的双尖牙。钛合金Ti-6Al-4V圆片购自陕西宝钛集团。

方法：

材料表面处理：将直径为10 mm，厚度为1 mm的圆形纯钛片分为3组，每组20片：飞秒激光组，TiO₂颗粒喷砂组和对照组。

飞秒激光组：对钛片表面采用钛：蓝宝石飞秒激光放大器(美国Spectra-Physics公司)进行处理，加工参数设定为：脉冲宽度100 fs，中心波长800 nm，脉冲重复频率 1 kHz。将钛片放在程序控制的二维移动平台上，经焦距180 mm的凸透镜使激光聚焦在钛片上，调节飞秒激光的偏振放向，使其与飞秒激光扫描方向平行。通过衰减片调节单位面积能量密度为1.40 J/cm²，扫描速度为1 mm/s。

TiO₂颗粒喷砂组：在5 kPa气压下采用笔式喷砂机把80目砂粒的TiO₂均匀的喷到钛片的表面，加工参数设定为：在喷嘴距钛片表面1 cm，和表面成45°角的条件下均匀喷涂45 s。

对照组：钛片表面以80目的砂纸顺同一方向抛光，打磨时力度均匀，频率一致，并且避免过多产热。

钛金属形态观察：将钛片清洗干净并以体积分数75%的乙醇消毒20 min后备用，每组钛片置于扫描电子显微镜(日本JEOL电子公司)下随机选择不同区域观察各组钛片的表面形貌。使用表面粗糙度测量仪(日本三丰公司)对纯钛片的表面粗糙度的轮廓算术平均偏差(Ra)值进行测量，每个实验面测量10次，计算平均值。

细胞培养：刮取根中1/3牙周膜组织剪碎，胰酶消化，过800目细筛，将其均匀的分散接种于培养瓶中，加入 5 mL DMEM培养液(体积分数10%胎牛血清，青霉素1×10⁵U/L，链霉素100 mg/L)，放进CO²培养箱(体积分数5% CO₂，95%湿度，37 ℃恒温)下孵育4-6 h后观察，静置培养。当细胞长满培养瓶底大约80%时，即可进行细胞的传代培养，首次传代比例为1∶1。等细胞长满培养瓶底80%时，以1∶3比例再次传代。传至第4代时用于实验，以4×10⁸L^-1细胞浓度接种在含有24 mm×24 mm盖玻片的培养皿中，待细胞贴壁伸展至基本正常时取出盖玻片，PBS冲洗，丙酮固定10 min。

MTT检测：细胞接种后24 h，在超净工作台上，用PBS冲洗各组钛片2次，以洗去钛片表面未黏附的细胞，小心钳出钛片，用无菌滤纸把钛片的表面PBS吸干。重复该操作，按原顺将各组钛片依次放入干燥的24孔板内。避光加入新鲜配制的2.5%MTT溶液20 μL/孔、含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液0.5 mL/孔，培养板放入CO₂培养箱中继续培养4 h后，取出培养板，倾斜培养板并用加样枪小心吸弃孔内的培养液，然后每孔加入二甲基亚砜200 μL，使之刚好压住钛片。37 °C条件下震荡10 min使结晶完全的溶解。将24孔培养板内的液体按原顺序转移到96孔培养板中，用酶联免疫标记仪(南京华东电子集团)在490 nm光波长处测量吸光度值。

实时定量PCR检测：提取各组钛片表面的人牙周膜成纤维细胞总RNA，测定RNA浓度(统一稀释500 mg/L)。反转录后使用定量PCR试剂盒检测分化相关基因转录因子RUNX2，OSX和GAPDH的相对表达。引物如下：

引物序列：
基因	上游引物(5’-3’)	下游引物(5’-3’)
RUNX2	CCA CCA CTC ACT ACC ACA CG	TCA GCG TCA ACA CCA TCA TT
OSX	ACT CAT CCC TAT GGC TCG TG	GGT AGG GAG CTG GGT TAA GG
GAPDH	GGT GAA GGT CGG TGT GAA CG	CTC GCT CCT GGA AGA TGG TG

主要观察指标：①表面结构不同的钛金属对体外牙周膜成纤维细胞增殖的影响。②细胞分化相关基因表达结果。

统计学分析：计数资料采用卡方检验或者Fisher精确检验进行分析。计量资料若满足正态分布及方差齐性应用单因素方差分析进行检验，如果差异有显著性意义，则应用SNK法进行组间的两两比较；若不满足正态分布或者方差齐性则应用多个独立样本检验的Kruskal-Wallis秩和检验，如果差异有显著性意义，则应用Wilcoxon秩和检验进行组间的两两比较。采用SPSS17.0统计软件包(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)进行实验数据分析。P < 0.05时，差异有显著性意义。

讨论

成纤维细胞是人牙周膜细胞的优势亚群之一，具有干细胞的很多特性，比如很强的增殖能力和多向分化潜能等，对于牙周组织的再生性修复有着极其重要的作用。人牙周膜成纤维细胞在种植体材料的表面黏附会受到许多因素的影响。飞秒激光在固体材料表面进行纳米周期结构的诱导成为了一个重要的研究方向，国内外学者发表了许多相关的研究成果。Tsukamoto等^[12]在研究飞秒激光辐照纯钛表面的一个点时得到了具有条纹和孔洞的结构图案。Liang等^[13]的研究表明，相对于其他技术，飞秒激光处理种植体表面既产生适合的表面形貌又减少表面污染。飞秒激光能够通过改变激光参数，能够在纯钛表面产生纯纳米结构，或各种尺度的纳米和微米相结合的复合结构等多种表面结构，与长脉冲激光相比，更加适合应用在生物医学中，并且其通过变换表面结构的粗糙度可以进行优化细胞的增殖和分化^[14-16]。人牙周膜成纤维细胞的细胞形态和细胞外基质分泌对细胞的黏附能力、细胞活性有非常重要的影响。Wieland等^[17]在保证材料表面化学成分相同的前提下研究材料表面形貌对细胞生长的影响，发现钛表面形貌影响人牙龈成纤维细胞的厚度和形状，但是对于细胞的体积没有影响，提示细胞具有自动调节形状以适应材料表面的能力。刘潇等^[18-20]的研究表明，微孔形貌的纯钛表面可以导致人牙龈成纤维细胞胞体丰满，并能够进入粗糙表面的的微孔伸出伪足将细胞固定，形成良好的局部接触，利于人牙龈成纤维细胞在纯钛表面的黏附。本实验发现采用不同处理的纯钛表面对于人牙周膜成纤维细胞的形态及分布都有很大的影响。对照组钛片表面细胞稀疏、扁平，伪足较少并且较短，细胞外基质分泌较少。而TiO₂颗粒喷砂组和飞秒激光组表面黏附的细胞密集，胞体丰满，伸展良好，伪足较多且较长。尤其是飞秒激光组表面细胞轮廓清晰，细胞明显密集，伸出的伪足进入周边的孔隙内，将细胞固定牢固，粗糙表面布满了细胞外基质。MTT检测结果显示24 h后飞秒激光组表面细胞活性最强，TiO₂颗粒喷砂组次之，对照组最差。根据以上分析得出粗糙表面形貌更加利于人牙周膜成纤维细胞的增殖。牙周组织中具有分化潜能的成纤维细胞群体能够表达出一些成骨细胞的表型和功能蛋白，向成骨样细胞分化，其中成骨细胞特异性转录因子起着中心调节的作用^[21]。RUNX2是第一个被证实的成骨细胞特异性转录因子，对成骨细胞的分化，成熟和自身稳定起着重要的作用^[22-28]；同时通过调节生长因子和骨细胞外基质蛋白的基因表达等起到促进成骨细胞的分化和增殖；RUNX2还能够通过调控骨钙素的表达作用于已经分化的成骨细胞。本实验结果显示在3，6，9 d时，飞秒激光组中RUNX2 mRNA表达水平明显较多，说明该表面处理更有利于成骨细胞的分化。 OSX是成骨细胞分化和骨形成不可缺少的调节因子，其调控许多重要的成骨早晚期表型和功能蛋白的表达，能够激活COL-Iα1和OPN的表达，促使细胞发生骨分化^[29-35]。本实验飞秒激光组中OSX mRNA在较早时期(第3天)就表达较多，在第6天明显增多。这一系列成骨细胞标志物在飞秒激光组的明显增多显示飞秒激光表面处理可以促进人牙周膜细胞向成骨细胞分化，从而有助于提高钛种植的成功率。综上所述，飞秒激光组和TiO₂颗粒喷砂组、对照组钛片表面相比，粗糙度均明显增加且生物附着性较好，其表面细胞轮廓清晰，细胞明显密集，表面细胞活性最强，分化相关基因RUNX2和OSX表达增加，结果证实了飞秒激光处理的纯钛表面对人牙周膜成纤维细胞增殖、分化具有强烈的促进作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程