卵巢癌细胞中CD90+肿瘤干细胞的生物学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：肿瘤干细胞与卵巢癌的发生和发展等之间存在十分密切的联系，CD90+是一种重要的肿瘤干细胞标志物。
目的：探索卵巢癌细胞中CD90+肿瘤干细胞生物学特性。
方法：获得原代卵巢癌细胞并进行分析，对人卵巢癌细胞系SKOV3和原代卵巢癌细胞的CD133和CD90阳性率进行流式细胞术检测，分选获得CD90+和CD90-细胞，并通过反转录PCR法对其干细胞和上皮间质化相关基因mRNA的相对表达情况进行检测。通过Transwell小室侵袭试验对细胞侵袭能力进程观察，利用克隆形成试验对细胞增殖分化能力进行观察，利用悬浮成球试验对干细胞潜能进行观察。并通过免疫缺陷小鼠体内有限稀释成瘤试验，对成瘤时间以及成瘤率进行观察。
结果与结论：SKOV3细胞的CD133和CD90阳性率均显著低于原代卵巢癌细胞。SKOV3细胞系CD90+干细胞相关基因mRNA相对表达CD133和OCT4均显著高于SKOV3细胞系CD90-干细胞；原代卵巢癌细胞CD90+干细胞中CD44、CD133、乙醛脱氢酶1和OCT4均显著高于原代卵巢癌细胞CD90-干细胞。SKOV3细胞系CD90-和CD90+干细胞的上皮间质化相关基因mRNA相对表达水平差异有显著性意义，原代卵巢癌细胞CD90-和CD90+干细胞的上皮间质化相关基因mRNA相对表达水平差异有显著性意义。随着接种细胞数量的增加，CD90-和CD90+细胞成瘤率呈现出不断上升的情况，成瘤时间则不断下降。其中，CD90+干细胞的上升较之CD90-干细胞更为显著。SKOV3细胞系和原代卵巢癌细胞的CD90+干细胞穿膜细胞数、细胞克隆数、悬浮成球数量均显著大于CD90-干细胞。提示卵巢癌细胞中CD90+干细胞可高表达干细胞相关基因和间质属性基因，并具备较高的侵袭、增殖分化能力以及成瘤能力和较大的干细胞潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 卵巢癌, 肿瘤细胞, 肿瘤干细胞标志物, 生物学特性, 上皮间质转化, CD90+细胞

Abstract:

BACKGROUND: There is a close connection between the occurrence and development of tumor stem cells and ovarian cancer. CD90+ is an important tumor stem cell marker.
OBJECTIVE: To explore the biological characteristics of CD90+ tumor stem cells in ovarian cancer cells.
METHODS: The CD133 and CD90 positive rate of SKOV3 and primary ovarian cancer cells were detected by flow cytometry. The CD90+ and CD90- relative expression in stem cells and epithelium was detected by RT-PCR. Transwell invasion assay was employed to observe the cell invasion ability, clone formation test was done to observe cell proliferation and differentiation capacity, suspension ball test was adopted to observe pluripotent stem cells. The tumor formation time and tumor formation rate were observed by limited tumor dilution in immunodeficient mice.
RESULTS AND CONCLUSION: The positive rates of CD133 and CD90 in SKOV3 were significantly lower than those in primary ovarian cancer cells. The expression of CD133 and OCT4 in CD90+ cells of SKOVS was significantly higher than that in CD90- cells of SKOVS. The expression of CD44, CD133, acetaldehyde dehydrogenase-1 and OCT4 in CD90+ stem cells of primary ovarian cancer cells was significantly higher than that in CD90- stem cells of primary ovarian cancer cells. There were significant differences in the epithelial-mesenchymal related gene expressions between CD90- and CD90+ stem cells of SKOV3 and primary ovarian cancer cells. With the increase of inoculated cells, the tumor formation rate of CD90- and CD90+ cells was increased continuously, but the tumor formation time was decreased. The tumor rate of CD90- cells was lower than that of CD90+ cells. The number of transmembrane cells, cell clones and suspended cell balls was significantly higher in the CD90+ stem cells than the CD90- stem cells. These findings indicate that in ovarian cancer cells, CD90+ stem cells can highly express stem cell-related genes and epithelial-mesenchymal related genes, which have a higher invasion, proliferation and differentiation ability, as well as tumorigenic and pluripotent ability.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Ovarian Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, Epithelial-Mesenchymal Transition

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

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引言

卵巢癌是一种常见的女性生殖器恶性肿瘤，起病隐匿，易转移，对人体的危害极大。由于卵巢位于盆腔内，起病隐匿，且易于腹腔内播散转移，初诊的卵巢癌患者采取手术治疗等大多可以取得一定的疗效，但复发率高[1]。其主要特征是肿瘤细胞的恶性生长、转移及复发，病因和发病机制尚不清楚。虽然卵巢癌发病率次于宫颈癌与子宫体癌，但由于卵巢肿瘤深藏于盆腔，患病初期很少有症状，一旦出现腹痛、腹水等症状并确诊为卵巢癌时，60%-70%的患者已属晚期。目前国外已着手卵巢恶性肿瘤早期诊断的研究，并普遍开展以手术为主的综合治疗，但由于其繁多的病理分类、组织结构复杂等因素，治疗效果一直不理想。
肿瘤干细胞学说是一门新近发展起来的全新理论，认为肿瘤干细胞虽然只占全部肿瘤组织的极少数，但它却是肿瘤形成、发展和恶化的根源。如何对肿瘤的干细胞进行分子或者形态上的鉴定，并加以识别和分离，是利用肿瘤干细胞来进行癌症治疗的关键环节。肿瘤干细胞具有自我更新、分化能力，并具有高致瘤性和耐药性，是一种特殊的干细胞类型[2-3]。随着“卵巢癌干细胞”作为卵巢癌的罪魁祸首最终被成功“锁定”，卵巢癌早期诊断和治疗这一难题有望得到攻克，而以彻底消灭肿瘤干细胞为目标的新化疗方案将给患者带来新的曙光。
卵巢癌干细胞具备极强的自我更新、增殖能力和多向分化潜能。在对肿瘤干细胞生长特点进行研究的过程中，关于肿瘤干细胞表面标记物的研究是一个重要的内容[4]。现如今，CD133是目前公认的卵巢癌干细胞标志，CD90是一种十分重要的肿瘤干细胞标志物[5]。本实验拟对人卵巢癌细胞系SKOV3和原代卵巢癌细胞的CD133和CD90进行分析，探讨卵巢癌CD90+肿瘤细胞肿瘤干细胞生物学特性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

设计：体外观察性实验。

时间及地点：实验于2015年5至6月在西安市长安医院实验室完成。

材料：选取西安市长安医院收治的1例卵巢癌患者，年龄34岁，经手术、病例证实为低分化腺癌，抽取1 000 mL腹水。患者未接受化疗，对本次实验相关具体内容知情，并自愿参与本次实验。

Nod-scid小鼠20只，鼠龄4-6周，体质量约16 g，均为雄性，清洁级，由深圳市卫光生物制品股份有限公司提供，实验动物使用许可证[证号为SYXK(粤)2009-0054]。本次研究相关内容和方法均经西安市长安医院伦理部门审核并批准，实验设计方案、使用动物品种品系规格、处死动物的方法、项目进行中设计动物福利和伦理问题等均符合要求。

卵巢癌CD90⁺干细胞生物学特性检测使用的主要试剂与仪器：
试剂与仪器	来源
人卵巢癌细胞系SKOV3	上海弘顺生物科技有限公司
DF12培养基	天津市宝玺丰化工有限公司
胎牛血清	上海信然生物技术有限公司
Transwell小室	成都瑞芬思生物科技有限公司
流式抗体EpCAM-FITC	深圳市凯驰自动化设备有限公司
CD90-FITC	青岛迈可威微波应用技术有限公司
CD133-PE	上海研卉生物科技有限公司
表皮生长因子，成纤维生长因子，白血病抑制因子	上海源叶生物科技有限公司
PBS	北京东胜创新生物科技有限公司
结晶紫	上海研拓生物科技有限公司
胰酶	上海华蓝化学科技有限公司
流式细胞仪	贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司
离心机	苏州科技城生物医学技术发展有限公司
光学显微镜	深圳市海量光电有限公司

方法：

腹水原代细胞分离与鉴定：抽取的腹水于无菌条件下进行离心处理，弃去上清液后于室温条件下进行5 min的红细胞裂解，经PBS洗涤之后再次离心。网过滤后置于培养基中进行培养，弃掉未贴壁细胞，经PBS洗涤之后进行培养。待细胞铺满瓶底之后进行梯度消化，去掉成纤维细胞^[6]。进行EpCAM-FITC标记和鉴定，获得合格原代细胞，合格标准为上皮细胞比率> 90%。

流式细胞术检测：对人卵巢癌细胞系SKOV3 和原代卵巢癌细胞的CD133和CD90阳性率进行流式细胞术检测。利用含胎牛血清的培养基对人卵巢癌细胞系SKOV3和腹腔分离的原代卵巢癌细胞进行传代培养，对贴壁培养的细胞进行胰酶轻消化收集，经PBS洗涤之后添加CD133-PE进行孵育，孵育结束之后再次进行PBS洗涤。对样品进行PBS重悬，流式细胞仪检测，计算CD133和CD90阳性率。

CD90⁺和CD90^-细胞分选：对贴壁培养的细胞进行胰酶轻消化收集，经PBS洗涤之后添加CD90FITC，置于37 ℃条件下进行1 h的孵育，孵育结束后再次进行PBS洗涤，利用流式分选仪经流式分选，获得CD90⁺和CD90^-细胞。

干细胞及上皮间质化相关基因mRNA相对表达检测：通过实时反转录PCR法对其干细胞和上皮间质化相关基因mRNA的相对表达情况进行检测，严格按照试剂盒说明书进行操作。其中干细胞相关基因mRNA相对表达检测指标包括CD44、CD133、乙醛脱氢酶1和OCT4；上皮间质化相关基因mRNA相对表达检测指标包括上皮型钙黏蛋白、神经型钙黏蛋白、波形蛋白(Vimentine)、基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9。

CD90成瘤能力检测：所有Nod-scid小鼠进行体内有限稀释成瘤试验，将CD90^-、CD90⁺细胞按10²、10³、10⁴梯度与Matrigel按体积比1∶1共100 μL分别接种于5只小鼠的两侧大腿根部，其中右侧为CD90^-，左侧为CD90⁺。接种结束对小鼠进行常规喂养，并进行观察。每周对肿瘤生长情况进行观察，待肿瘤体积达到1 cm³左右之后处死小鼠，记录成瘤时间以及成瘤率。

CD90细胞侵袭能力检测：通过Transwell小室侵袭试验对细胞侵袭能力进行观察，上室每孔添加80 μL Matrigel，于37 ℃条件下放置1 h。待凝固之后，上室添加100 μL含有1×10⁴细胞的无血清培养基，下室添加600 μL含血清培养基，进行48 h的培养。培养结束之后，拭去膜上层细胞，甲醛固定并经PBS洗涤之后，利用结晶紫染色，再次经PBS洗涤之后风干，于高倍镜下对穿膜细胞数进行细胞计数。

CD90细胞增殖分化能力和干细胞潜能：利用克隆形成试验对细胞增殖分化能力进行观察，对CD90⁺和CD90^-细胞进行悬浮培养，将细胞接种在低黏附24孔板，无血清DF12培养基进行悬浮培养。添加10 μg/L表皮生长因子、成纤维生长因子、白血病抑制因子，每3 d补液1次，14 d后置于镜下进行观察，利用悬浮成球试验对干细胞潜能进行观察。

主要观察指标：观察SKOV3与原代卵巢癌细胞的CD133和CD90阳性率，通过反转录PCR法检测干细胞及上皮间质化相关基因mRNA相对表达，利用成瘤试验观察CD90⁺和CD90^-细胞成瘤能力，利用Transwell小室侵袭试验对细胞侵袭能力进行观察。

统计学分析：数据以x(_)±s表示。本次研究过程中得到的所有研究数据均录入SPSS 19.0统计学软件，并进行处理。计数资料均予以χ²检验，对于计量资料，符合正态分布的予以t 检验，不符合正态分布的予以单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

卵巢癌是一种发生在卵巢的恶性肿瘤，是常见的女性生殖器官恶性肿瘤^[7]。由于卵巢位于盆腔内，起病隐匿，且易于腹腔内播散转移，初诊的卵巢癌患者采取手术治疗等大多可以取得一定的疗效，但复发率高^[8]。 3.1 肿瘤干细胞大多数肿瘤由不同性质的细胞亚群组成，它们的增殖潜力和移植后重建肿瘤的功能大不相同。肿瘤细胞与干细胞具有类似之处，如它们都能自我更新，具有不定分化的潜能，其细胞表面标志也相似等。尽管这2种细胞均能够进行增殖，但不同之处在于肿瘤细胞的增殖不受控制，而干细胞的增殖则受到严格的调控；肿瘤细胞增殖后异常分化，而干细胞则可以分化成正常的成熟细胞。在肿瘤细胞中，存在一类十分特殊的细胞。这些细胞具有自我更新能力以及较强的分化能力，被称为肿瘤干细胞^[9]。总体来看，肿瘤干细胞可以发挥出多重功能^[10]。首先，肿瘤干细胞可以通过自我更新和增殖来对肿瘤细胞群的生长和壮大提供强大的活力来源，帮助其维持旺盛的生命力^[11]。其次，肿瘤干细胞还具有较强的迁徙和运动能力，极大的促进了肿瘤细胞的转移，导致各种肿瘤的浸润和转移等^[12]。另外，在正常状态下，肿瘤干细胞还可以长期维持相对稳定的休眠状态，并具备较强的耐药性^[13]。因此，临床对各种肿瘤患者进行常规放疗或者化疗治疗的过程中，因为肿瘤干细胞对治疗的敏感性不强，因此无法对其造成杀灭^[14-17]。于是，在治疗结束一段时间之后，肿瘤干细胞便会继续发挥作用，导致肿瘤的复发，并引发一系列不良后果的出现^[18]。 3.2 卵巢癌与肿瘤干细胞临床对肿瘤干细胞进行研究的过程中，肿瘤干细胞特异的细胞表面标志很少，在不同的肿瘤组织中肿瘤干细胞的表面抗原标志也各不相同，对于肿瘤干细胞的研究具有一定的困难^[19]。因此，在研究过程中，首先需要筛选出可能的肿瘤干细胞表面标志，然后通过细胞分选的方法分选出具有该标记的细胞，再进一步进行干细胞活性检测、细胞移植、克隆形成、细胞增殖以及细胞分化等肿瘤干细胞功能分析^[20]。CD13、CD133、CD90、CD24、EpCAM、OV6等阳性的肝细胞癌细胞都曾被鉴定为具肿瘤干细胞特性^[21]。临床对卵巢癌患者进行治疗的过程中，可以采取单一顺铂化疗或者紫杉醇联合顺铂化疗的方式。但常规治疗往往无法获得满意的临床效果，预后效果不尽如人意^[22]。随着医学水平的不断提高，临床开始积极探讨通过分子靶向治疗方式来对卵巢癌患者进行治疗，于是，各种肿瘤标记物也开始被应用于对卵巢癌组织的检测之中^[23]。目前，卵巢癌干细胞研究相关报道相对较少，经过搜索和查阅，Zhang等^[24]通过研究指出，卵巢癌细胞拥有一些具有一定特异性的干细胞表达标记物，包括CD117和CD44。何炜等对不同肿瘤干细胞表达的CD34、CD44、CD133等抗原标记进行了综述，还有学者通过研究认为CD90表达程度不一，且CD90的功能包括多个方面，包括参与细胞与细胞以及细胞与细胞基质间交互作用等^[25]。还有一些学者发现肝癌、食管癌、胶质瘤、白血病、胃癌等肿瘤中CD90⁺细胞具有肿瘤也干细胞生物学特性^[26-29]。Tang等^[27]通过检测食管癌患者肿瘤标本和食管癌细胞株 KYSE140、KYSE520，观察到CD90表达，且发现CD90⁺亚群和肿瘤的发生和发展以及耐药等关系密切。Yang等^[30]发现从多株肝癌细胞、肝癌患者肿瘤标本和血样标本中均可分离获得CD90⁺细胞，且经裸鼠移植瘤构建研究证实CD90⁺细胞亚群具有更强的成瘤能力。研究发现在卵巢癌细胞异质性群体中，上皮属性细胞在获得间质属性之后，可以获得更高的侵袭转移能力，化疗耐药性更强，从而导致肿瘤临床进展的加快^[31-43]。而上皮细胞向间质细胞转化过程中，会出现上皮标志上皮型钙黏蛋白丢失现象，并伴有间质标志Vimentine或者神经型钙黏蛋白的上升^[44]。在接受化疗之后，卵巢癌细胞会出现上皮间质化现象，导致残留癌细胞获得更强的恶性表型^[45]。即表明，卵巢癌发生、发展、耐药等过程中，上皮细胞向间质细胞转化发挥出十分重要的作用^[46-47]。通过本实验发现，SKOV3细胞系CD90⁺干细胞相关基因mRNA相对表达CD133和OCT4均显著高于SKOV3细胞系CD90^-干细胞；原代卵巢癌细胞CD90⁺干细胞中CD44、CD133、乙醛脱氢酶1和OCT4均显著高于原代卵巢癌细胞CD90^-干细胞。通过本实验还发现，SKOV3细胞的CD133和CD90阳性率均显著低于原代卵巢癌细胞；SKOV3细胞系和原代卵巢癌细胞的CD90⁺干细胞穿膜细胞数、细胞克隆数、悬浮成球数量均显著大于CD90^-干细胞。即表明卵巢癌细胞中CD90⁺干细胞并具备较高的侵袭能力和较大的干细胞潜能。经小鼠体内回植还发现，随着接种细胞数目的不断增加，CD90⁺和CD90^-干细胞的成瘤率和成瘤时间均呈现出不断上升的情况，CD90⁺干细胞的上升较CD90^-干细胞更为显著。即提示卵巢癌细胞中CD90⁺干细胞并具备较高的增殖分化能力以及成瘤能力。

3.3 总结综上所述，卵巢癌细胞中CD90⁺干细胞具有一定的生物学特性，可高表达干细胞相关基因和间质属性基因，并具备较高的侵袭、增殖分化能力以及成瘤能力和较大的干细胞潜能。但受到入组样本数量以及观察时间等因素的影响，本实验所得到的相关结果以及相应的结论可能存在一定的片面性和不准确。因此，本实验还存在一定的不足之处，还需要在今后的研究中予以进一步完善和分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程