定向诱导分化环境下骨髓间充质干细胞向成骨及成脂细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.004

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞属于骨髓中的非造血干细胞，能够在不同的条件下诱导分化为软骨细胞、骨细胞以及脂肪细胞等，是最有前途的组织工程种子细胞。
目的：探讨定向诱导分化环境下骨髓间充质干细胞向成骨细胞及脂肪细胞分化的关系。
方法：无菌抽取日本大耳兔骨髓，采用密度梯度离心法和细胞贴壁法分离、纯化出骨髓间充质干细胞，分别采用成脂诱导培养基和成骨诱导培养基进行诱导培养，培养后不同时间点进行苏丹Ⅳ染色、Von Kossa染色、碱性磷酸酶活性检测，比较细胞成脂和成骨率。以正常DMEM培养液培养细胞为对照组。
结果与结论：骨髓间充质干细胞经过7 d成脂诱导后细胞浆开始出现小脂滴、细胞无序，培养21 d后细胞浆内形成高折光性的脂滴。苏丹Ⅳ染色结果显示：骨髓间充质干细胞克隆中心的细胞浆内存在大量的颗粒状红色脂滴，对照组仅5%骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞。骨髓间充质干细胞经过7 d成骨诱导后细胞逐渐汇合成铺路石状，并且形成多个结节；培养14 d后能够看见褐色点状矿化结节中心；培养21 d后形成小片状矿化结节。成骨诱导实验组成骨率为40%，成脂率为20%，显著高于对照组(成骨率为5%，成脂率为5%)。结果提示在适当的环境下骨髓间充质干细胞能够一部分转化为脂肪细胞，另一部转化为骨细胞，并且二者存在一定的联系，即分化的脂肪细胞多，骨细胞则少；反之分化的脂肪细胞少，骨细胞则多。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 诱导分化, 骨髓间充质干细胞, 成骨细胞；, 脂肪细胞

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells are non-hematopoietic stem cells from the bone marrow and can differentiate into chondrocytes, osteocytes and adipocytes under different induction conditions, which are the most promising seed cells for tissue engineering.
OBJECTIVE: To evaluate the osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells under directional induction.
METHODS: Bone marrow samples from Japanese rabbits were extracted aseptically to isolate and purify bone marrow mesenchymal stem cells using density gradient centrifugation and cell adherent method. Then, the cells were cultured in osteogenic and adipogenic induction media as experimental group. Another cells cultured in DMEM medium acted as control group. Sudan IV staining, Von Kossa staining and alkaline phosphatase activity detection were performed at different time after culture to compare the osteogenic and adipogenic rates.
RESULTS AND CONCLUSION: After 7 days of adipogenic induction, small lipid droplets were visible and the cells arranged disorderly; at 21 days of induction, see lipid droplets with high refractivity were seen in the cytoplasm. Sudan IV staining showed that there were a large amount of red lipid droplets in the cloning center of bone marrow mesenchymal stem cells, but only 5% bone marrow mesenchymal stem cells differentiated into
adipocytes in the control group. At 7 days of osteogenic induction, induced cells were confluent in a flagstone shape, and there were many nodules; at 14 days of culture, the center of brown mineralized nodules were visible; at 21 days of culture, small pieces of mineralized nodules formed. The osteogenic and adipogenic rates were 40% and 20% in the experimental group, respectively, which were higher than those in the control group (5%, 5%). These findings indicate that under certain conditions, bone marrow mesenchymal stem cells can partially differentiate into fat cells part, and another part differentiate into osteocytes, suggesting there is a certain link between them, that is, more adipocytes and fewer osteoblasts, or vice versa.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells;, Cell Differentiation

中图分类号:

R394.2

赵勤鹏. 定向诱导分化环境下骨髓间充质干细胞向成骨及成脂细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(32): 5103-5107.

Zhao Qin-peng. Osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells under directional induction [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(32): 5103-5107.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析从10只日本大耳兔中提取骨髓间充质干细胞，操作过程中2只大耳兔骨髓间充质干细胞原代培养时发生污染，淘汰，8只大耳兔成功提取骨髓间充质干细胞。 2.2 分离培养的骨髓间充质干细胞形态利用淋巴细胞分离液分离骨髓能够得到明显的白膜层，接种到培养瓶中的白膜层细胞开始贴壁，两端存在较长的突起，胞核为卵圆形，成克隆样生长，培养2周左右89%-90%汇合，传代后生长分布均匀，形态为长梭形，见图1，2。 2.3 骨髓间充质干细胞成脂诱导结果原代培养骨髓间充质干细胞经过7 d成脂诱导后细胞浆开始出现小脂滴、细胞无序，培养21 d后在显微镜下能够看见细胞浆内形成高折光性的脂滴，并且更多的集中在克隆中心，提高放大倍数能够看见胞浆内的脂滴，克隆边缘也存在少量脂肪细胞。染色结果显示：骨髓间充质干细胞克隆中心的细胞浆内存在大量的颗粒状红色脂滴。在低倍镜下显示10份细胞爬片中70%以上骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞；对照组中只有5%骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞。 2.4 成脂诱导后两组细胞碱性磷酸酶活性实验组有10%的成骨率，显著高于对照组5%，差异有显著性意义 (P < 0.05)。 2.5 骨髓间充质干细胞成骨诱导结果原代培养骨髓间充质干细胞经过7 d成骨诱导后细胞逐渐汇合成铺路石状，并且随着时间的延长，间充质开始堆积，形成多个结节，开始逐渐融合(图3A)；培养14 d后能够看见褐色点状矿化结节中心(图3B)；培养21 d后形成小片状矿化结节。 2.6 成骨诱导后两组细胞碱性磷酸酶活性成骨诱导实验组成骨率为40%，成脂率为20%，显著高于对照组(成骨率为5%，成脂率为5%)。

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2013年12月至2015年1月在西安交通大学医学院动物实验中心完成。

材料：

骨髓间充质干细胞定向分化实验所用主要试剂和器材：
试剂和器材	来源
DMEM细胞培养基	GIBCO公司
地塞米松注射液、胰岛素	浙江仙琚制药有限公司
胎牛血清	上海恒信化学试剂有限公司
甲醛钙、苏丹红	北京中山金桥生物技术有限公司
一次性塑料培养器皿	德国西门子有限公司

实验动物：10只日本大耳兔，体质量为2.15-3.15 kg，雌雄不限，六七周龄，由南方医科大学动物实验中心提供，严格遵守相关标准进行饲养，合格证号为SCXK(粤) 2007-0010。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

实验方法：

大鼠骨髓间充质干细胞培养：选取10只日本大耳兔，在大耳兔髂嵴处采用无菌操作抽取骨髓，并将其放入到肝素钠中抗凝，1 000 r/min离心10 min，去除上层油脂，采用DMEM基础培养基对骨髓进行等倍稀释，将获得的骨髓根据2∶1的比例放置在淋巴细胞分离液上面，2 000 r/min离心20 min^[19-20]，提取单个核细胞层，采用DMEM基础培养基进行培养，培养3 d后进行1 000 r/min离心10 min，PBS洗涤3次，用DMEM生长培养基(青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/L，体积分数为10%胎牛血清，pH 7.2)进行悬浮，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，接种于T25塑料培养瓶，每瓶10 mL，接种于直径为3.5 cm培养皿，每皿2 mL，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱，观察细胞的贴壁生长情况。细胞培养72 h后去除非贴壁细胞组织，更换新的DMEM生长培养基，每2 d半量换液1次，观察细胞的形态学特征及其生长情况^[21-22]。

定向诱导培养：

成骨诱导：对原代骨髓间充质干细胞进行24 h传代培养后去除培养液和悬浮细胞，采用DMEM基础培养液进行清洗，然后实验组更换为含有成骨诱导培养基(即DMEM培养基中加入10^-⁸ mol/L地塞米松，10 mg/L胰岛素、100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素)；对照组用不含诱导剂DMEM培养基培养，每隔2 d半量换液，其余方法同实验组^[23-24]，诱导21 d。

成脂诱导：对原代骨髓间充质干细胞进行24 h传代培养后去除培养液和悬浮细胞，将培养液更换为成脂诱导培养基(即DMEM培养基中加入50 mg/L维生素C，10 mmol/L β-磷酸甘油钠、10^-⁸ mol/L地塞米松)；对照组用不含诱导剂DMEM培养基培养，每2 d半量换液，其余方法同实验组^[25-26]，诱导21 d。

碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色：取正常培养组和诱导培养组不同时间段细胞爬片，采用碱性磷酸酶染色和Von Kossa法观察钙结节的形成情况^[27-28]。

苏丹Ⅳ染色：取正常培养组和诱导培养组不同时间段细胞爬片，采用苏丹Ⅳ染色法观察脂滴的形成情况^[29-30]。

主要观察指标：骨髓间充质干细胞形态和成骨成脂诱导分化能力。

统计学分析：采用SPSS 18.0软件对采集到的数据进行分析，组间比较采用卡方检验方法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓基质中存在许多种类细胞，每一类细胞均有其特殊的功能。传统的研究中更多关注于骨髓基质中造血细胞、成骨细胞等，很少研究骨髓基质中间充质细胞^[31-32]。骨髓脂肪细胞并不是单纯的空间充填物，它是随着机体生长、生理状态不同而发生改变的物质，并且骨髓中脂肪和骨形成之间存在紧密的联系，对人类疾病和健康等均发挥了重要的作用^[33-34]。传统研究提取的脂肪更多来源于大鼠的成纤维细胞，并且采用NIT/3T3代表的多能干细胞系如3T3-L1前脂肪细胞系和T3-F442A前脂肪细胞系^[35-36]。本次研究则利用日本大耳兔为实验对象，采用骨髓间充质干细胞为成脂诱导的前体细胞，研究定向诱导分化环境下骨髓间充质干细胞对成骨细胞和成脂细胞分化产生的影响^[37-38]。本研究原代培养骨髓间充质干细胞经过7 d成脂诱导后细胞浆开始出现小脂滴、细胞无序，培养21 d后在显微镜下能够看见细胞浆内形成高折光性的脂滴，提高放大倍数能够看见胞浆内的脂滴。染色结果显示：骨髓间充质干细胞克隆中心的细胞浆内存在大量的颗粒状红色脂滴；对照组中只有5%骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞；原代培养骨髓间充质干细胞经过7 d成骨诱导后细胞逐渐汇合成铺路石状，间充质开始堆积，并且形成多个结节；培养14 d后能够看见褐色点状矿化结节中心；培养21 d后形成小片状矿化结节。通过碱性磷酸酶活性测定为阳性。成骨诱导实验组成骨率和成脂率显著高于对照组。由此看出：骨髓间充质干细胞本身在体内具有多方向分化潜能，在体外通过不同的诱导剂能够改变骨髓间充质干细胞的主要分化方向，其具体表现为不同的成脂和成骨分化比例^[39-40]；同时，地塞米松对于大耳兔骨髓间充质干细胞诱导作用既能够促进成脂细胞分化同时还能够促进成骨细胞分化，提示一定量地塞米松在成脂、成骨诱导中能够发挥重要作用^[41-42]。骨髓间充质干细胞在向骨细胞及脂肪细胞分化之间存在着反向变化关系，并且这一结论对研究骨质疏松症发病机制等至关重要，机体内脂肪增殖体积增大常伴随着骨质的减少，临床上将表现为具体某一个部位骨质的减少，脂肪细胞数目的增多^[43-44]。考虑到骨髓内成骨与成脂是相互反作用的关系将会对人类研究骨质疏松症和其他骨病的病因提供重要的依据^[45-46]。综上所述，在适当的环境下骨髓间充质干细胞能够一部分转化为脂肪细胞，另一部转化为骨细胞，并且二者存在一定的联系，即分化的脂肪细胞多，骨细胞则少；反之分化的脂肪细胞少，骨细胞则多。

杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程