以线栓法构建脑梗死模型大鼠的微血管新生及电针干预效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.27.008

摘要/Abstract

摘要：

背景：脑梗死发生后缺血半暗带存在的状态决定了最终梗死灶的体积，在这一区域出现的选择性基因表达、蛋白合成减少、乳酸中毒和细胞毒性水肿，对神经细胞的抢救性治疗以及对神经血管单元的持续调节，成为后期神经功能恢复的结构和生理基础。
目的：以脑梗死后微血管新生过程为研究切入点，探索微血管新生随时间延续呈现的基本规律以及电针干预对局部血管增殖产生的影响。
方法：96只Wistar大鼠随机分为模型对照组和电针干预组，以线栓法复制大鼠大脑中动脉梗死模型，电针干预组在造模后即刻针刺人中穴，给予15 Hz，1 mA的电刺激，持续20 min。模型对照组同样抓取固定，但不进行任何治疗。在脑梗死后不同时间(3，6，12，24，48 h以及3，7，12 d)采用vWF、Ki67免疫荧光双标记检测血管的新生情况。
结果与结论：在大脑中动脉梗死后3，6，12 h，模型对照组梗死区周围无血管内皮细胞增殖标记，24 h出现血管内皮细胞增殖，48 h血管内皮细胞增殖增加，3 d时达到高峰，7 d时血管内皮细胞增殖水平下降，12 d时无血管内皮细胞增殖标记；在大脑中动脉梗死后3，6 h，电针干预组无血管内皮细胞增殖标记，12 h出现血管内皮细胞增殖，24，48 h血管内皮细胞增殖进一步增加，3 d时达到高峰，7 d时血管内皮细胞增殖水平下降，12 d时无血管内皮细胞增殖标记。与模型对照组比较，电针干预组血管内皮细胞增殖出现时间提前，血管内皮细胞增殖数量多于同时相模型对照组，而两组所有时相梗死区和梗死灶对侧半球均无血管内皮细胞增殖标记。结果表明电针干预可促进大脑中动脉梗死模型大鼠梗死区周围脑血管内皮细胞增殖，并将血管内皮细胞增殖出现时间提前，由此可改善脑梗死的预后。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物, 脑及脊髓损伤动物模型, 脑梗死, 血管新生, vWF, Ki67, 电针, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The state of ischemic penumbra after cerebral infraction determines the final infarct volume. Decreased selective gene expression and protein synthesis, lactic acidosis and cytotoxic edema, salvage therapy of nerve cells, and continous regulation of neurovascular unit in the ischemic penumbra are areas of interest for recovery of neurological function.
OBJECTIVE: Taking the neoangiogenesis process of post-infarction as the research point, to investigate the basic law of neovascularization with time and the effect of electroacupuncture intervention on proliferation of local blood vessels.
METHODS: Ninety-six Wistar rats were randomly and evenly divided into model and electroacupuncture groups.
The rat models of middle cerebral artery infarction were established by suture method. Immediately after modeling, the rats in the electroacupuncture group were given electrical stimulation (15 Hz, 1mA, 20 minutes) at the Renzhong (Du26) acupoint. The rats in the model group received similar procedures with the exception of no treatment. The angiogenesis was observed using double-immunofluorescence labeling for von Willebrand Factor (vWF) and Ki-67 antibodies at 3, 6, 12, 24, 48 hours and 3, 7, 12 days after middle cerebral artery occlusion.
RESULTS AND CONCLUSION: In the model group, vascular endothelial cell proliferation in the peri-infarct region was not observed at 3, 6 and 12 hours, occurred at 24 hours, increased at 48 hours, reached a maximum at 3 days, began to decrease at 7 days, and disappeared at 12 days after middle cerebral artery occlusion. In the electroacupuncture group, vascular endothelial cell proliferation in the peri-infarct region was not observed at 3 and 6 hours, occurred at 12 hours, increased at 24 and 48 hours, peaked at 3 days, began to decerase at 7 days, and disappeared at 12 days after middle cerebral artery occlusion. Compared with the model group, the time at which vascular endothelial cell proliferation started was earlier, and the number of proliferated vascular endothelial cells was greater in the electroacupuncture group. Vascular endothelial cell proliferation in the infarcted regions and contralateral hemisphere was not observed in either group at all designated time points. These results demonstrate that electroacupuncture intervention can improve the prognosis of cerebral infarction by promoting the proliferation of vascular endothelial cells in the peri-infarct region and advancing the time at which vascular endothelial cell proliferation started in rat models of middle cerebral artery occlusion.

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Key words: Infarction, Middle Cerebral Artery, Ki-67 Antigen, Electroacupuncture

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 4

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引言

“微血管枢纽学说”认为，脑梗死急性发生后，脑表面侧支血管系统犹如一个“闸门”，决定着脑缺血区能否及时有效地接受来自缺血周边区的侧支循环血流，并压送这些代偿血流进入微细血管，以营养缺血的神经元组织，“闸门”的功能状态决定着缺血细胞的命运^[1-2]。急性脑梗死发生后，造成“闸门”的阻力增大，开放不利，微血管自律运动出现高频率低振幅，其流质、流场的动态耦合发生障碍，表现为“高速低效振荡”，成为缺血脑组织获取代偿血流的障碍。那么，脑梗死急性发作后，梗死区血流发生了怎样的变化，是否存在一定的变化规律，如何根据这些变化迅速而有效的重建微血管侧支循环，恢复缺血区的血流供应，则成为治疗的关键。
课题组前期研究已经证实，电针干预能够调节脑血管的舒缩状态，恢复脑梗死后微血管的自律运动，并能够有效促进脑梗死急性期侧支循环的建立，从而增加缺血半暗带和梗死区的脑血流供应，减轻脑梗死神经元损伤^[3-8]。血管新生可以看作是增加侧支循环的另外一种机制，但是相对于侧支循环的建立，血管新生需要更长的时间。如同病理状态下一样，在生理状态下，脑血管网根据组织对血流的需求以及血流供应本身的改变作出调整，这种调整可通过3种不同的机制达到血管发生、血管生成和动脉生成^[9-15]。一系列的研究表明，脑梗死发生后，缺血半暗带内的血管新生增加，还有研究认为脑梗死后血管新生的增加是为了清除堆积的代谢产物^[16-17]，但是换个角度讲，血管新生的增加无疑为血液进入梗死区提供了通路。本研究旨在探索脑梗死后血管新生的规律以及电针的干预效应，为针灸临床治疗脑梗死提供实验依据。

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材料方法

1.1 造模动物及材料
1.1.1 实验动物及分组 2月龄健康雄性Wistar大鼠，体质量180-200 g，由中国医学科学院实验动物养殖中心提供，随机分为模型对照组和电针干预组，进一步分为3，6，12，24，48 h以及3，7，12 d 8个时相组，每个时间点6只。
1.1.2 主要试剂 ①0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)：氯化钠(NaCl)16 g，氯化钾(KCl)0.4 g，磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O) 5.78 g，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.4 g，蒸馏水定容至2 000 mL(pH 7.2-7.4)。②复合消化液(100 mL)：胃蛋白酶20 mg，胰蛋白酶125 mg，蛋白酶K 1mg，EDTA-Na2 10 g，溶于100 mL PBS定容过滤。③体积分数为0.3%过氧化氢封闭液(100 mL双蒸水+30 μL H2O2)。④0.5% Tirton X-100(100 mL PBS+ 50 μL Tirton X-100)。⑤50%甘油缓冲液。
一抗：①兔抗人八因子相关抗原(Ⅷ-R Ag)多克隆抗体(DAKO公司，Catalog No：N1505，北京中杉金桥生物技术有限公司分装，货号ZA-0111)。②小鼠Ki-67单克隆抗体(abcam公司，产品号：B126.1)。③山羊抗大鼠CD31多克隆抗体(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC. Catalog No.SC1506)。
二抗：①免疫荧光标记山羊抗兔IgG抗体(Invitrogen 公司，ZYMED Laboratories，Catalog No.81-6111)。②免疫荧光标记山羊抗小鼠IgG抗体(Invitrogen 公司，ZYMED Laboratories，Catalog No. 81-6514)。③生物素化抗山羊IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，产品编号：ZB-2050)。④生物素化抗小鼠IgM(北京中杉金桥生物技术有限公司，产品编号：ZB-2055)。
1.2 造模方法采用Longa的腔内线栓法阻滞大鼠左侧大脑中动脉，复制脑梗死模型[18]，尼龙线直径为0.205 mm。大鼠经10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔内注射麻醉，仰卧于手术台上，颈正中偏左侧切口，分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉，颈总动脉近心端和分叉处放置动脉夹，在两动脉夹中间扎孔，插入尼龙线拴，长度18-22 mm，线栓进入颈内动脉稍遇阻力即停止进线，结扎线拴和颈总动脉，放开颈总动脉近心端动脉夹，缝合皮肤。
1.3 模型纳入排除标准参照Longa 5分制评分标准[18]，0分：无神经功能缺失症状；1分：轻度局灶性神经功能缺失(不能完全伸展右侧前肢，左侧Horner's征阳性)；2分：中度局灶性神经功能缺失(提尾悬空时右前肢屈曲、内收，行走时向右侧转圈)；3分：重度局灶性神经功能缺失(站立不稳，向右侧倾倒)；4分：不能自发行走，意识水平降低。
评分在1-3分为造模成功，以下两种情况为模型复制不成功，予以剔除：①实验过程中大鼠死亡。②在规定时间处死动物，取脑时见有蛛网膜下腔出血或颈内动脉分叉部出血。
1.4 电针处理方法电针干预组在大脑中动脉梗死后即刻针刺人中穴，人中穴定位根据华兴邦的动物穴位图谱，用半寸毫针(0.5寸，10 mm×40 mm，华佗牌GB2024-1994)在大鼠鼻中隔下方向上斜刺2 mm，并在该部位下约2 mm处刺入一针作为参考电极，人中穴接电针仪的正极，参考电极接负极，用15 Hz，1 mA的电刺激，持续20 min。3，6，12 h 3个时相组治疗1次，规定时间取材；24，48 h以及3，7，12 d 5个时相组每天治疗1次，规定时间取材；模型对照组均同样抓取固定，但不进行任何治疗。
1.5 样本制备 ①心脏灌注：各组大鼠在规定时间开胸行 40 g/L多聚甲醛心脏灌注，灌注压15.96-18.62 kPa，连续灌注10 min，取脑。②脱水：以大脑中动脉和大脑前动脉分叉部为中点前后各2 mm取中间一块脑组织，30%蔗糖脱水。③切片：冰冻切片，切片厚度14 µm，连续切片20张，4 ℃丙酮固定，晾干后-20 ℃保存待检。
1.6 免疫荧光双标记染色步骤 ①冰冻切片空气干燥 1 h，自来水冲洗5 min，双蒸水浸泡5 min。②体积分数为0.3%过氧化氢封闭液室温封闭5 min，0.01 mol/L PBS室温下洗3次，5 min /次。③0.5%Tirton X-100室温浸泡10 min，0.01 mol/L PBS室温下洗3次，5 min/次。④复合消化液室温消化10 min，0.01 mol/L PBS室温下洗3次，5 min/次。⑤正常山羊血清室温封闭10 min，倾去，勿洗。⑥滴加特异性抗体(一抗)vWF(1︰50)与Ki67(1︰50)混匀，每张片子分别为50 μL，4 ℃过夜孵育。⑦0.01 mol/L PBS室温下洗3次，5 min/次。⑧滴加荧光素标记山羊抗兔IgG与山羊抗小鼠IgG(1︰50)( 每张片子滴加50 μL)，室温孵育3 h。⑨0.01 mol/L PBS室温下洗3次，10 min/次。⑩50%甘油缓冲液封固，镜下观察并采集图像。
1.7 图像分析以光学显微镜、荧光显微镜和共聚焦显微镜观察染色结果并摄取图像，采用Image Pro-Plus图像分析系统，结合人工计数观察vWF和Ki67的表达情况，vWF和Ki67同时表达时，以有Ki67表达的细胞核的数量计算内皮细胞增殖量。

讨论

本研究旨在探讨电针干预对大鼠大脑中动脉梗死模型脑血管新生的影响，选择von Willebrand Factor(vWF)和Ki67为检测指标，以免疫荧光双标记法检测血管内皮细胞的增殖情况。vWF是分子质量约为1 000 ku的糖蛋白，主要在内皮细胞和巨核细胞内合成，其前体含2 813个氨基酸，包括22个氨基酸的前导肽，741个氨基酸的原肽和 2 050个氨基酸的成熟分子。细胞增殖核抗原Ki67是细胞周期特异性抗原，在G1期开始出现，在M期达到高峰，但G0期无表达，在有丝分裂后迅速降解并失去抗原决定簇，能客观反映细胞的增殖潜力。本研究以兔抗人vWF多克隆抗体标记大鼠脑血管内皮细胞，以羊抗大鼠Ki67标记处于增殖状态的细胞核，以二者的共同表达对血管内皮细胞的增殖状态进行半定量检测。
实验结果显示：模型对照组在大脑中动脉梗死后24 h开始出现血管内皮细胞增殖，48 h继续增多，至大脑中动脉梗死后3 d达到最大值，7 d时增殖水平下降；电针干预组在大脑中动脉梗死后后12 h即开始出现血管内皮细胞增殖，24，48 h继续增多，至大脑中动脉梗死后3 d达到最大值，7 d时增殖水平下降，血管内皮细胞增殖趋势与模型对照组相同，但出现时间提前，各相同时相比较，血管内皮细胞增殖均多于模型对照组。
脑梗死的病理状态下，由缺血缺氧引起梗死区周围脑血管增生，在一定范围内，缺血缺氧程度的严重性与脑血管的增生相关，早期的研究结果表明，若没有缺血缺氧诱发则脑血管处于静止状态，不存在或很少有增生^[11]，根据这一结论，缺血缺氧的程度越轻，则脑血管的增生越少，甚至没有增生。由此，电针干预增加缺血半暗带血流灌注后，脑组织缺血缺氧的状态得到缓解，而模型对照组未经过电针干预，缺血半暗带和梗死区缺血缺氧依然很严重，那么，与模型对照组相比，电针干预组脑血管增生应少于模型对照组。然而，结合前期研究结果综合分析[7]，电针干预组脑血流增加，脑血管增生也多于模型对照组，实验结果与前面的研究结论相悖，然而，这却正是显示出针刺的双向调节作用，在脑梗死急性期，电针干预能够促进侧支循环快速而有效的建立，增加缺血半暗带和梗死区脑血流灌注，减轻神经损伤；急性期后，电针干预又能调节梗死区周围血管的增生，促进代谢产物的清除，为神经功能的恢复与重组创造有利条件。
结论：电针干预可促进大脑中动脉梗死模型大鼠梗死区周围脑血管内皮细胞增殖，并将血管内皮细胞增殖出现时间提前，由此可改善脑梗死的预后。

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