构建裸鼠皮下荷瘤模型：人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.27.003

摘要/Abstract

摘要：

背景：多种细胞株参与骨肉瘤动物模型的和构建。
目的：比较人骨肉瘤细胞株中MG63、U2OS和143B在裸鼠皮下的成瘤情况，为骨肉瘤的动物实验研究奠定基础。
方法：将18只裸鼠随机等分成3组：MG63组、U2OS组和143B组，分别于各组裸鼠后侧背部皮下注射MG63、U2OS和143B三种细胞株，观察成瘤情况。
结果与结论：MG63和U2OS细胞株注射的裸鼠未能成瘤。143B细胞株注射的裸鼠于(6±1) d成瘤，成瘤率100%(6/6)，肿瘤生长较迅速，2个月时平均瘤体体积为(3 475±1 544) mm³，荷瘤裸鼠存活时间为(68±10) d。苏木精-伊红染色显示瘤体组织中可见癌细胞成巢，核大深染，多分裂。说明143B细胞株成瘤良好，可用于骨肉瘤动物实验研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物, 骨及关节损伤动物模型, 骨肉瘤, 细胞株, 裸鼠, 动物模型, MG63, U2OS, 143B, 生长曲线

Abstract:

BACKGROUND: A variety of cell lines participate in the construction of animal models of osteosarcoma.
OBJECTIVE: To compare the abilities of subcutaneous tumorigenesis of human osteosarcoma cell lines MG63, U2OS and 143B in nude mice, and to establish the basis for experimental studies on osteosarcoma.
METHODS: A total of 18 nude mice were randomly divided into MG63, U2OS and 143B groups. The back of nude mice was subcutaneously injected with MG63, U2OS and 143B cell lines in corresponding groups, and the process of tumorigenesis was observed.
RESULTS AND CONCLUSION: MG63 and U2OS could not induce subcutaneous tumorigenesis in nude mice. Tumors were observed after injection with 143B cells for (6±1) days, with the tumor formation rate of 100% (6/6). The tumor grew very fast. The mean volume of tumors was (3 475±1 544) mm3 at 2 months. The survival time of nude mice burdened with tumors was (68±10) days. Hematoxylin-eosin staining revealed that in tumor tissue, cancer cells formed nest shape, nuclei were big and darkly stained, and split mostly. These results suggested that 143B cell line could well induce subcutaneous tumorigenesis, which could be used for animal research of osteosarcoma.

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Key words: Osteosarcoma, Mice, Nude, Tumor Burden, Survival Analysis

中图分类号:

R318

吴丽美，伍绍国，陈卫文，周兰，朱金妹，鲍蓓. 构建裸鼠皮下荷瘤模型：人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(27): 4277-4281.

Wu Li-mei, Wu Shao-guo, Chen Wei-wen, Zhou Lan, Zhu Jin-mei, Bao Bei. Construction of nude mouse models bearing subcutaneous tumors: human osteosarcoma cell lines MG63, U2OS and 143B[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(27): 4277-4281.

图/表（结果） 6

2.1 骨肉瘤细胞的形态原代培养的MG63呈长梭形，U2OS稍短，143B为多边形。MG63、U2OS和143B在体外生长速度不一，其生长速度为143B > MG63 > U2OS(图1，2)。

2.2 三种骨肉瘤细胞株的侵袭性观察划痕愈合实验结果显示，143B在划痕后20 h基本愈合，MG63次之，U2OS基本上没有愈合(图3)。

2.3 三种骨肉瘤细胞株的成瘤情况 MG63组裸鼠植入 3 d左右，接种部位液包消失，1周左右又可见皮下小包块，约2 mm×2 mm×2 mm，质软，缓慢增大，大约15 d消失。其中1只裸鼠肿瘤细胞植入1周左右腋下见一包块，约 2 mm×3 mm×2 mm，3周时1取皮下包块行病理检查，苏木精-伊红染色证实为淋巴组织，疑为淋巴结肿大。主要脏器病理学检查示正常(图4)。
U2OS组所有裸鼠未见成瘤，接种细胞悬液后3 d左右形成类炎症反应，接种部位一液包，质软，1周左右消失。该组裸鼠处死后主要脏器行病理检查均未见明显肿瘤细胞浸润。

143B组6 d左右可见皮下包块，质硬，活动度一般，随时间延长逐渐增大，慢慢可见其上布满血管，约40 d时可见瘤体上坏死结痂，裸鼠呈恶病质，70 d左右裸鼠死亡。2个月时平均瘤体体积为(3 475±1 544) mm³，裸鼠死亡时瘤体平均质量(9.43±2.06) g，裸鼠存活时间为(68±10) d。肿瘤的生长趋势很明显。取包块切开，可见类鱼肉，中间部分发白坏死，石块包埋组织，切片，经苏木精-伊红染色见核大，深染，瘤组织中间有坏死。主要脏器病理观察可见肺、肝正常，肾上见瘤细胞巢(图5，6)。

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引言

材料方法

设计：细胞学实验。
时间及地点：实验于2010至2012年重庆医科大学动物实验中心完成。
材料：
细胞株：人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B，购自中国典型培养物保藏中心。
实验动物：SPF级健康Balb/c裸鼠18只，雌雄不限，鼠龄4-6周，体质量14-20 g，由重庆医科大学动物中心提供，许可证号：SYXK(渝)2007-0001，喂养于严格消毒的无菌层流动物房内，环境温度维持在25 ℃，空气湿度为60%-70%，饲料和水经严格消毒后自由进食。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例并经重庆医科大学动物伦理委员会论证。

构建裸鼠皮下荷瘤模型使用的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
MTT、锥虫蓝	Sigma公司
DMEM，MEM，RPMI 1640培养液	Hyclone公司
胎牛血清	MD genics公司
CO₂饱和湿度箱	美国Thermo公司
YJ-875 SA超净工作台	苏州安泰空气技术有限公司

方法：
细胞培养：MG63，U2OS和143B分别使用MEM，DMEM和RPMI 1640培养液培养，3种细胞均为贴壁生长型，于37 ℃、体积分数5% CO2的饱和湿度箱中培养。所用DMEM，MEM和RPMI 1640内均含体积分数10%胎牛血清、青霉素和链霉素各1×105 U/L。
细胞生长曲线的绘制：3种细胞株分别接种于96孔板，每个细胞设3个复孔，实验重复3次。每孔2 000个细胞，分别于0，24，48，72 h四个时间点用MTT法测定每孔630 nm处的吸光度值，计算平均值，并绘制细胞生长曲线。
划痕愈合实验：3种细胞株分别接种24孔板，每孔5 000个细胞，细胞融合后用10 μL Tips头划痕，记为0 h，并于24，48，72 h三个时间点动态观察划痕愈合的情况。
细胞收集：对数生长期的骨肉瘤细胞用0.25%胰蛋白酶消化，生理盐水洗涤3次，以去处残留的血清，0.4%的锥虫蓝染色，计数活细胞数，无血清的培养基重悬，制成1×10¹¹ L^-1的细胞悬液，分别装在不同的EP管中，37 ℃保温。
实验动物分组：将18只裸鼠随机分成3组：MG63组、U2OS组和143B组，各6只。
细胞接种：碘酊消毒裸鼠右后侧背部皮下，再用体积分数75%乙醇拭去碘酊，混悬EP管中的细胞悬液，用1 mL注射器吸取0.2 mL注射在已消毒的裸鼠后后侧背部皮下，进针已穿透裸鼠整个皮层而又不进入肌层和腹腔为宜，待细胞悬液打进后用无菌镊子轻夹1 min，防止细胞悬液漏出。每只裸鼠进行右后侧背部皮下单点注射，注射的细胞悬液(1×10¹¹ L-¹)为0.2 mL。
大体观察：接种完成后逐日观察裸鼠的一般情况及局部情况，并记录裸鼠因瘤负荷的死亡时间。
肿瘤生长曲线的绘制：待裸鼠成瘤后每天用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)、短径(b)，按Carlsson公式[10]，V=1/2a×b2计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。
病理学观察：待其中1组所有裸鼠因肿瘤负荷死亡后，处死其他组裸鼠，取肺、肾等主要脏器及瘤体，40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，厚度为10 μm，行苏木精-伊红染色，普通光学显微镜下观察，拍照。
主要观察指标：骨肉瘤细胞形态及肿瘤体积与病理形态。
统计学分析：数据以x±s表示，采用SAS 8.0统计软件进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

无胸腺裸鼠(Nude，简称裸鼠)目前已成为医学生物学研究领域中不可缺少的实验动物模型^[11-14]。特别是在肿瘤学、免疫学、药品与生物制品的安全性评价及有效药品的筛选等实验方面，它有着特殊的价值。由于裸鼠的免疫缺陷，在一定情况下，不排斥来自异种动物的组织移植，因此可作移植人类恶性肿瘤的接受体^[15]。本实验选取的Balb/c裸鼠有稳定性好的特点。但裸鼠主要是细胞免疫缺陷，其在周龄比较大时会恢复一定的体液免疫，故本实验选取4-6周龄的裸鼠，就是为了充分利用其免疫缺陷，以便成功构建裸鼠移植骨肉瘤模型。
肿瘤的动物模型包括自发肿瘤模型、诱发肿瘤模型、同种移植肿瘤模型、异种移植肿瘤模型等，其中异种移植模型目前最常用的荷瘤动物就是免疫缺陷动物[^16-18]。关于细胞株骨肉瘤异种移植模型，常用的细胞株包括鼠源性细胞株S-SLM、K7M2、Kl2、UMR106-01、Dunn、LM7、LM8和人源性细胞株包括MG-63、POS-l、HOS-58及SAOS-2等^[19]。
本实验选取的骨肉瘤细胞株具有一定代表性，MG63为人成骨肉瘤细胞系，是目前国内报道最多的构建骨肉瘤移植瘤模型的细胞株之一，有学者专门就不同细胞量的MG63构建裸鼠移植瘤的成功率及肺转移率做过研究^[20]。也有学者通过对骨肉瘤细胞系MG-63的单克隆化，建立了具有高、低不同分化程度的2个人骨肉瘤细胞株^[21]。本实验中MG63未能成功成瘤，分析其原因，也许就是细胞株分化程度不同、恶性程度不一导致的。U2OS在体外培养过程中发现其增殖能力和迁移能力明显弱于MG63和143B，代表其本身的恶性程度就稍弱。目前，在国内尚未见关于U2OS移植瘤模型构建成功的报道。本研究也再次印证了这一点。143B也是人骨肉瘤细胞系之一，目前国内利用其来做研究的相对较少。从体外培养看，143B增殖速度快于另2株细胞，且细胞呈多形性。该细胞株构建的裸鼠移植瘤模型生长速度块，有很明显的生长趋势，恶性程度中等，裸鼠存活期大约68 d，允许研究人员有足够的时间对其进行干预和研究，且移植瘤瘤体较大，便于操作和观察，是相对理想的人骨肉瘤裸鼠移植瘤模型。但其因瘤体大导致的血供不足及坏死也是实验要克服的难点之一。

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