2.1  同种异体冻干骨的组织学观察 
苏木精-伊红染色：新鲜骨由致密的骨皮质和内侧的骨松质构成，骨皮质内部为骨松质，是由疏松多孔的组织构成，骨松质内含有大量的细胞；同种异体冻干骨的密致骨和松质骨结构清晰，骨陷窝及松质骨周围没有细胞残余(图3)。



Masson染色：新鲜骨与冻干骨的Masson染色可见骨纤维素被染成红色，胶原纤维呈蓝色，胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色，胞核黑蓝色(图4)。同种异体冻干骨与新鲜骨骨纤维及胶原纤维未见明显区别，说明冻干处理后对骨组织结构没有明显破坏。
2.2  同种异体冻干下颌骨髁突的扫描电镜观察  扫描电镜观察新鲜下颌骨髁突和同种异体冻干下颌骨髁突，可见新鲜骨骨小梁被大量的细胞包绕，而经处理后的同种异体冻干骨其上未见细胞附着(图5)。



2.3  同种异体冻干骨的生物力学测试  新鲜下颌骨抗弯曲实验的最大载荷和最大位移显著高于冻干下颌骨 (P < 0.01)，刚度显著低于冻干下颌骨( P < 0.05)，见   表1；弯曲实验的断裂部位在加压处，断裂的试样呈裂纹状。
新鲜下颌骨与冻干下颌骨压缩实验的最大载荷、刚度相比差异无显著性意义(P > 0.05)，而新鲜下颌骨的最大位移显著高于冻干组(P < 0.05)，见表1；压缩实验的断裂部位在舌侧骨皮质相对薄弱处。

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肿瘤、外伤、感染等疾病所导致的下颌骨缺损严重影响患者的生活质量和心理健康，因此，下颌骨缺损修复重建是口腔医学的重要研究领域。目前，临床常用的修复方法包括自体骨移植、同种异体骨移植及牵张成骨等，这些方法存在着许多不足，如自体骨供骨量有限，二次手术创伤，供区畸形^[1]；同种异体骨来源不足、成骨慢，存在免疫排斥反应^[2]；牵张成骨疗程长，患者依从性差等，限制了其在颌骨缺损修复的应用。 近年来，骨组织工程在下颌骨缺损修复中取得了不断进展^[3]。组织工程骨具有供体来源不受限、创伤小、无抗原性、可个性化修复的优势，是下颌骨缺损的理想修复方法。骨组织工程的核心要素包括支架、种子细胞及促骨形成的生长因子。对于支架材料的要求包括以下几方面^[4-5]：良好的生物相容性；三维多孔结构，孔隙相互连通；可降解吸收，降解产物对机体无毒副作用，降解速率和新骨形成的速率相匹配；生物力学强度与下颌骨相匹配度，能够行驶正常的咀嚼功能；易于塑形。随着计算机技术和快速成型技术的不断发展，骨组织工程支架可以按照缺损部位进行塑形和加工，满足了下颌骨缺损个性化修复的需求。根据材料属性，应用于颌骨组织工程支架可分为以下几类。①生物衍生骨：如自体骨^[6]、同种异体骨及珊瑚^[7-10]，来源于天然生物组织，具有良好的生物相容性和力学性能，能够被机体降解吸收,而且经过处理后几乎无免疫原性。珊瑚羟基磷灰石来源于珊瑚，具有天然三维多孔结构。Zhou 等^[10]通过比较CAD制作个性化钛网加载脱矿冷冻干燥骨或珊瑚羟基磷灰石复合人重组骨形态发生蛋白2预制血管化的组织工程骨修复恒河猴下颌骨缺损效果时，发现珊瑚羟基磷灰石具有较好的骨诱导性，是理想的组织工程骨支架材料。②生物陶瓷：具有良好的生物相容性和骨传导性，其主要组成元素为钙、磷，是骨组织中的主要无机成分。生物陶瓷包括生物活性陶瓷，如羟基磷灰石；生物降解陶瓷如磷酸三钙。Ciocca等^[11]采用多孔羟基磷灰石支架复合自体骨髓基质干细胞和血小板凝胶修复羊颞下颌关节髁突，4个月后有明显的新骨形成。Yuan等^[12]用β-磷酸三钙复合自体骨髓间充质干细胞修复犬下颌骨3 cm缺损，术后4周有大量新骨形成，32周达到骨愈合，认为β-磷酸三钙是一种良好的骨组织工程支架材料。虽然生物陶瓷硬度高，但是脆性大，仅用于非承重区骨缺损修复，对于大段骨缺损修复，需要复合其他材料应用。③生物高分子材料：包括天然高分子和合成高分子材料。天然高分子材料如胶原、甲壳素及其衍生物、海藻酸盐等，具有良好的生物相容性、生物活性和可降解性，但存在力学强度差、降解速率快等不足，常作为生长因子载体，可注射水凝胶或与其他材料制备复合支架。Fan等^[13]用壳聚糖和硫酸软骨素制备三维多孔支架，经磷灰石涂层改性后加载骨形态发生蛋白2、脂肪干细胞有效修复了鼠下颌骨缺损。合成高分子材料包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚己酸内酯等，性能稳定，可塑性强，降解速率可调控，但也存在降解产物为酸性、力学强度不足等缺点。Ren等^[14]将聚乳酸-聚乙二醇和聚乙醇酸两种材料分别加载骨髓间充质干细胞修复兔下颌骨缺损，12周后缺损区有大量的新骨形成，认为聚乙醇酸具有更好的成骨能力。而Chanchareonsook等^[15]将选择性激光烧结制作的多孔聚己酸内酯支架用碳酸磷灰石涂层后，复合人重组骨形态发生蛋白2或自体骨髓细胞修复猴下颌骨节段性缺损，发现术后感染率较高，聚己酸内酯支架的承重能力不足。④复合型支架：单一的生物材料无法满足颌骨缺损修复的需要，多种材料组合形成的复合型支架更符合颌骨组织工程的要求。Matusuo等^[16]采用羟基磷灰石/聚乳酸支架复合自体骨髓和富血小板血浆修复犬下颌骨缺损，1年后形成了足够的骨量，精确地修复了缺损。Zhao等^[17]用磷灰石涂层的丝素纤维支架复合自体骨髓间充质干细胞修复犬下颌骨下缘临界缺损时发现，术后12个月缺损区达到完全骨愈合，与自体骨修复无差别，认为该支架具有良好的骨传导性，极大促进了骨再生。⑤金属：钛及钛合金是骨内固定最常用的金属材料，具有良好的生物相容性和耐腐蚀性，虽然不能降解吸收，但可在体内长期存留且力学强度高。因此，常被作为组织工程支架辅助材料，增强组织工程骨的强度。Xi等^[18-20]通过钛网来加强多孔珊瑚复合骨髓细胞构建的组织工程骨，成功恢复了犬下颌骨缺损。

 

冻干处理犬同种异体下颌骨实验的主要仪器：
仪器	来源
超声波清洗器	中国北京
电锯	中国江苏
FD-1型冷冻干燥机	北京博医康公司
扫描电子显微镜	S-3400N日本
858M iniB ion ixⅡ生物力学实验机	美国MTS公司
-80 ℃的冰箱	Thermo 公司,美国
60Co照射	解放军军事医学科学院

 

 

 

主要观察指标：同种异体冻干骨的组织学与生物力学检测。
统计学分析：采用SPSS 13.0软件对新鲜骨组、冻干骨的弯曲实验及压缩实验进行最大载荷、最大位移和刚度
的配对t 检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。利用GraphPad prism 6.0 软件对弯曲实验的最大载荷、最大位移及刚度数据绘图。

设计：观察实验。
时间及地点：于2013年1月至2014年8月在解放军总医院口腔研究所完成。
材料：
实验动物：12月龄雌性比格犬16只，购于解放军总医院动物实验中心。

实验方法：
同种异体骨的处理：无菌条件下切取比格犬带髁突的半侧下颌骨，剥离附着的肌肉、血管、结缔组织及髁突表面软骨组织，采用电锯从右侧下颌髁孔处锯断，测量骨段大小，用直径为1 mm骨钻透颊舌侧及髁突表面皮质骨，孔与孔之间间距为3-5 mm(图1A)。用1∶1氯仿/甲醇溶液脱脂处理4 h，生理盐水反复加压冲洗去除残留血液和骨髓；先将移植骨放入-4 ℃的冷库中，12 h后逐渐降至-80 ℃保存，1周后将冷冻骨放入干燥机内，使骨组织内剩余水分降低到5%以下，然后进行无菌包装，辐射灭菌后，置于无菌真空器中常温保存(图1B)。

同种异体冻干骨的检测：
组织学检测：将新鲜的下颌骨和同种异体骨浸入体积分数10%中性甲醛固定24 h，EDTA脱钙至骨组织变软，流水冲洗过夜。脱水机脱水，常规石蜡包埋，3-5 µm切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察同种异体骨的组织学结构。
苏木精-伊红染色：①烤片：将骨组织石蜡切片置于  60 ℃恒温箱中烘烤过夜。②脱蜡：将骨组织的石蜡切片依次浸于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各20 min脱蜡，然后浸入无水乙醇中10 min，体积分数95%，85%，75%乙醇中各5 min梯度乙醇水化。③骨组织切片依次放入自来水中2 min，苏木精染色10 min。④自来水冲洗1 min，0.5%盐酸-乙醇快速分化数秒，流水冲洗1 min。⑤切片置于返蓝液中1 min，流水冲洗。⑥伊红染色30 s。⑦体积分数80%，95%，100%乙醇梯度脱水，使用二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ透明，然后在室温下中性树脂封固，显微镜下观察。
Masson三色染色：①骨组织石蜡切片脱蜡至水(同苏木精-伊红染色)。②自来水、蒸馏水漂洗后用Regaud苏木精染液5-10 min。③自来水冲洗5 min后，蒸馏水洗1遍。④ Masson 丽春红酸性复红液5-10 min。⑤2%冰醋酸水溶液浸洗。⑥1%磷钼酸水溶液分化3-5 min。⑦苯胺蓝液染5 min。⑧0.2%冰醋酸水溶液浸洗。⑨体积分数75%，85%，95%乙醇、无水乙醇、二甲苯透明、中性树胶封固。
扫描电镜观察：将新鲜下颌骨髁突片和同种异体冻干下颌骨髁突片在2.5%戊二醛固定2 h，体积分数30%，50%，70%，90%，100%乙醇梯度脱水(5 min 1次)，0.2%磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次10 min，醋酸异戊酯置换(15 min 1次)，空气干燥。扫描电镜观察处理后的冻干骨与未处理新鲜下颌骨髁突的微观形态及骨小梁情况。
生物力学检测：①抗弯曲生物力学测试：由于下颌骨髁突形态不规则，生物力学检测时不易固定，因此选取部分冻干下颌骨进行生物力学检测。在冻干处理后的下颌骨第二磨牙下方截取高12.0 mm、长8.0 mm的骨段做为抗压缩实验的试件，从下颌骨第一磨牙远中下方向前截取高 5.0 mm、长30.0 mm的骨段做为抗弯曲实验的试件，进行生物力学检测(图2)。冻干骨在测试前6 h放入4 ℃生理盐水中进行水化。然后将其置于实验机的工作台上，以跨距   25 mm、100 N预压3次，消除骨组织黏弹性对测试结果的影响。测试加载速度为0.5 mm/min，测量精度为0.05%。载荷-位移曲线由计算机自动绘制，其在冻干骨出现断裂变形时结束。②抗压缩生物力学测试：方法与抗弯曲生物力学测试相同，仅将预压力调整为200 N。

 

 

随着骨库的大量建立，同种异体骨处理及储存方法的改进，同种异体颞下颌关节因其良好的外形结构、生物学特性，成为解决髁突缺损的有效方法之一。但同种异体骨移植存在的最主要问题是免疫排斥和成骨速度缓慢。为了加速成骨，有学者采用血管化的同种异体骨移植，术后多数需要长期甚至终身使用免疫抑制剂^[21]，免疫抑制剂有强的细胞毒性作用，有时会带来威胁生命的不良反应，因此这种方法是不可取的。为了降低同种异体骨的免疫原性，许多学者开始对同种异体骨的处理方法进行改进^[22-23]，最成功的是冻干和深冷冻处理，特别是冻干处理后能有效降低免疫原性，这是由于异体骨的免疫原性主要来自骨组织中的细胞成分，冻干处理后活细胞全部被消除，本实验的组织病理检查及扫描电镜观察证实了这一点，因此有效降低了其免疫原性。冻干处理后的同种异体骨尽管强度有所下降，但仍能达到重建下颌骨及颞下颌关节的要求^[24-25]。但冻干后的同种异体骨又出现另一严重问题，即更加降低了成骨速度。有研究发现大段同种异体骨5年后仅20%被新骨替代^[25]。由于冻干同种异体骨长时间以死骨形式存在体内，难免会引起感染、吸收、骨折等一系列并发症。为了加速成骨，首先应明确同种异体骨移植愈合机制，国内外学者对此进行大量研究，发现有以下愈合方式：①自生成骨作用：新鲜的同种异体骨移植，存活的细胞具有早期成骨能力，但因免疫反应，供体来源的细胞被杀死，早期成骨亦被吸收，所以这种成骨作用是无效的。冷冻和冻干骨细胞成分多已死亡，不具备自身成骨能力。②骨传导作用：骨传导作用也就是支架作用，是移植骨周围组织床的血管、骨祖细胞沿植入物的机械引导侵入其内部，实现爬行替代的过程。同种异体骨移植的愈合、替代过程主要依靠骨的传导作用。③骨诱导作用：骨诱导作用是指来自植床周边宿主结缔组织中的可诱导成骨前体细胞即间充质细胞，在诱导因子的作用下被诱导成骨原细胞，经成骨细胞形成新骨，这种成骨方式是间接的，称为骨诱导。骨诱导在同种异体骨移植愈合早期发挥重要作用。

1 由于下颌骨中颞下颌关节具有特殊的结构和功能，要重建颞下颌关节的精细结构并恢复其功能，目前的组织工程支架在形态和强度上还很难达到这一要求。

3 实验对犬同种异体骨进行冻干处理，并在其表面制造一定孔隙，以提高其成骨速度，尽管强度有所下降，但仍能达到重建下颌骨及颞下颌关节的要求，组织病理检查及扫描电镜观察证实冻干处理后的同种异体骨活细胞全部被消除，有效降低了其免疫原性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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