补骨脂素抗菌双相陶瓷骨的制备及性能检测

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.25.003

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来中药在骨组织工程中应用的研究在国内处于起步阶段，尚未见到补骨脂素在骨组织工程支架材料中应用的研究报道。
目的：通过真空复合方法制备出补骨脂素抗菌双相陶瓷骨，检测材料的理化性能、抗菌性和细胞相容性。
方法：将猪椎骨经复合焦磷酸钠两次低温煅烧制备双相陶瓷骨，将双相陶瓷骨置于壳聚糖/补骨脂素复合溶液中，制备补骨脂素抗菌双相陶瓷骨。扫描电镜观察补骨脂素抗菌双相陶瓷骨的表面形貌，并检测其抗压强度；采用微生物法检测补骨脂素抗菌双相陶瓷骨对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果；将补骨脂素抗菌双相陶瓷骨与小鼠成骨细胞MC3T3-El共培养4，8 d，扫描电镜观察细胞在材料表面的附着与增殖。
结果与结论：补骨脂素抗菌双相陶瓷骨具有天然的孔隙结构，骨小梁、小梁间隙和骨内管腔系统同时存在，抗压强度为(4.69±0.50) MPa，其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有较强的抑制作用，抑菌效果明显；小鼠成骨细胞MC3T3-El可在补骨脂素抗菌双相陶瓷骨上很好的附着，保持良好的状态和功能并快速增殖，说明补骨脂素抗菌双相陶瓷骨具有良好的细胞相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 补骨脂素, 双相陶瓷, 抗菌性, 细胞相容性

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, studies on the application of traditional Chinese medicine in bone tissue engineering are still at the initial stage in China. Reports about psoralen antibiotic biphasic ceramic bone have not been seen in bone tissue engineering research.
OBJECTIVE: To fabricate the psoralen antibiotic biphasic ceramic bone by vacuum evaporator and to observe the physicochemical properties, antibiotic activity and biocompatibility of the material.
METHODS: Biphasic ceramic bone was prepared by twice low-temperature calcining pig vertebrae combined with sodium pyrophosphate, and then the ceramic bone was immersed in chitosan/psoralen compound solution to prepare psoralen antibiotic biphasic ceramic bone. The surface morphology was observed by scanning electron microscope, and the compressive strength was tested. Antibiotic activity of the psoralen antibiotic biphasic ceramic bone on Escherichia coli and Staphylococcus aureus was tested by microbiological methods. Mouse osteoblasts MC3T3-E1 were co-cultured with the psoralen antibiotic biphasic ceramic bone for 4 and 8 days, and the cell adhesion and proliferation on the scaffold surface were observed under the scanning electron microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: Psoralen antibiotic biphasic ceramic bone had natural pore structure with the trabecular bone, trabecular space and lumen system and exerted great antibiotic effect on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. The compressive strength was (4.69±0.50) MPa. Mouse osteoblasts MC3T3-E1M could be adherent to the psoralen antibiotic biphasic ceramic bone and proliferate rapidly, suggesting the psoralen
antibiotic biphasic ceramic bone has good cytocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Psoralens, Ceramics, Escherichia coli

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 1

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引言

随着近十几年来骨组织工程学的兴起和发展，人们开始用组织工程原理和技术对骨缺损进行修复，这为大范围骨缺损修复开辟了新途径。在构建组织工程化人工骨时，支架材料的选择十分重要，支架材料不仅影响成骨细胞的生物学特性和培养效率，而且决定移植后能否与受体很好地适应并结合在一起，进而发挥修复骨缺损的作用。因此，寻找理想的支架材料是目前骨组织工程的研究热点之一^[1]。猪椎骨经复合焦磷酸钠两次低温煅烧，能够制备出含有一定比例羟基磷灰石和磷酸三钙的双相陶瓷骨^[2]。羟基磷灰石降解较慢，磷酸三钙降解较快，羟基磷灰石与磷酸三钙的复合物可以通过调整两者的复合比例来控制其降解速度[3]。双相陶瓷骨化学组成与骨组织的无机成分相似，且具有良好的生物相容性、生物活性和生物安全性，解决了移植后产生免疫排斥反应的问题。经过煅烧后生成的双相陶瓷骨能保留骨的天然网状孔隙结构，其结构和组成符合生理要求，其天然孔隙结构能为细胞黏附、增殖、分化及成骨提供天然的三维空间结构。双相陶瓷骨保留了原骨的骨小梁、小梁间隙及骨内管腔系统，孔隙与松质骨结构相似，其大小适合肉芽组织长入和软骨分化形成，有利于传导成骨，解决了化学合成人工骨在孔隙率、孔隙交通、孔径大小等方面制作难题^[2]。因此含一定比例羟基磷灰石和磷酸三钙的双相陶瓷骨被认为是一种很有临床应用前景的骨组织工程支架材料。
壳聚糖是天然带正电荷的直链多糖，是由虾、蟹等甲壳类动物提取的甲壳素脱乙酰基产物。壳聚糖在自然界的资源丰富，其结构类似于细胞外基质中的糖胺聚糖，因而具有良好的细胞组织相容性、可降解性及抗菌性。壳聚糖在骨组织工程及其他组织工程中应用广泛，但力学性能差，难以应用于承重部位的骨缺损。双相陶瓷骨具有一定的抗压强度，可作为支架材料应用，与壳聚糖复合后可以克服单一材料的不足，更好地满足组织工程支架材料的需要，制备出既具有良好的生物相容性又具有一定力学性能的复合支架。
近年来中药在骨组织工程中应用的研究在国内处于起步阶段，尚未见到补骨脂素在骨组织工程支架材料中应用的研究报道。目前临床上大量应用补骨脂素及其组方治疗骨折、骨质疏松等，其有望作为一种新的成骨因子应用于骨组织工程研究^[4]。因此，实验以壳聚糖为载体，将补骨脂素复合于双相陶瓷骨，制备出与传统加载抗生素支架材料不同的抗菌活性成骨材料，拓展中药在骨组织工程的应用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

设计：观察实验。
时间及地点：于2013年1月至2014年12月在滨州医学院完成。
材料：箱式电阻炉(湖北省恒丰医疗器械有限公司，SX2-5-12型)；焦磷酸钠(广东汕头西陇化工厂，分析纯AR，批号：0206051)；壳聚糖(青岛利中甲壳质公司，试剂级，脱乙酰度90%)；补骨脂素(中国食品药品检定研究院，批号：110739-200814)；拉伸试验机(岛津AG-1S型)；环境扫描电镜(飞利浦XL30型)；二氧化碳培养箱(Thermo公司)；倒置显微镜(Olympus IX71)；小鼠成骨细胞MC3T3-El(滨州医学院人体解剖与组织胚胎实验室)。
实验方法：
补骨脂抗菌双相陶瓷骨的制备：取新鲜市售猪椎骨制成一侧含皮质骨的松质骨条，蒸馏水中煮沸，无水乙醇脱水，电热恒温干燥箱70 ℃干燥，置箱式电阻炉中800 ℃低温煅烧，制得陶瓷骨。将陶瓷骨置焦磷酸钠液中浸泡，恒温水浴中加热，24 h后将其取出，滤纸吸取多余的焦磷酸钠，再置电热恒温干燥箱70 ℃干燥，然后再次置箱式电阻炉中900 ℃煅烧，制得双相陶瓷骨。自然降温后取出，用蒸馏水在超声清洗机上清洗30 min，洗净表面及孔隙中的碎屑，干燥后高压蒸汽灭菌备用。将适量的壳聚糖加入2%乙酸溶液中，使之充分溶解成为浓度为0.2%的壳聚糖醋酸溶液^[5]。待壳聚糖醋酸溶液澄清后加入补骨脂素，使补骨脂素质量浓度达到0.25 g/L^[6]。将消毒后的双相陶瓷生物衍生骨置于补骨脂素/壳聚糖混合溶液中，真空负压抽吸，使补骨脂素/壳聚糖复合物均匀复合于支架载体，制得补骨脂抗菌双相陶瓷骨，冻干、消毒后分装备用。随机取部分样本做性能分析，同时留样品送细菌培养，证实无细菌生长。
补骨脂素抗菌双相陶瓷骨的性能检测：应用飞利浦XL30型环境扫描电镜在20 kV下对补骨脂素抗菌双相陶瓷骨材料的形貌和微结构进行观察。了解补骨脂素/壳聚糖复合物在材料表面的附着情况。材料的压缩强度用日本产岛津AG-1S型拉伸试验机测试，取8个补骨脂抗菌双相陶瓷骨制成1 cm×1 cm×2 cm的长方体，10 kN载荷，下压速度为1 mm/min，压缩至样品碎裂后停止。
补骨脂素抗菌双相陶瓷骨的抗菌性：抗菌性能检测分为金黄色葡萄球菌组和大肠杆菌组，菌种由滨州医学院微生物教研室提供，每组设5个培养皿。用接种环分别挑取少许已培养好的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌培养物于无菌生理盐水5.0 mL制成菌悬液。取菌悬液1.0 mL加到已灭菌干燥的培养皿中，加入冷却至50 ℃左右的普通营养肉汤琼脂培养基，摇匀，待充分冷凝后备用。用无菌镊子取无菌圆形滤纸浸入0.2 g/L补骨脂素/壳聚糖溶液内充分作用，分别置于已接种葡萄球菌、大肠杆菌的琼脂平板培养基中。将琼脂平板放入37 ℃普通培养箱，需氧环境下培养24 h后取出，观察细菌生长情况及纸片周围有无抑菌环，测量抑菌环直径。生理盐水滤纸做对照。
补骨脂素抗菌双相陶瓷骨的细胞相容性：将小鼠成骨细胞MC3T3-El在37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱培养，每3 d换液1次，细胞融合后用0.25%胰酶-EDTA消化，调整浓度为1×10⁹ L^-1的细胞悬液。分别将5 mm× 5 mm×2 mm补骨脂素抗菌双相陶瓷骨12块置于4块24孔培养板中预湿，每块板左上角各放3块材料。将浓度为1×109 L-1的MC3T3-El细胞0.2 mL接种于24孔培养板左上角的预湿材料上，CO₂培养箱中培养4 h后再分别加0.8 mL培养液继续培养，右上角3孔单纯加相同细胞悬液，同时培养观察，每2 d换液1次。倒置相差显微镜观察细胞在材料周围、孔隙内附着及生长情况。同时第4，8天分别取出2块复合成骨细胞的补骨脂素抗菌双相陶瓷骨，用2.5%戊二醛固定，于扫描电镜下观察细胞在材料上的附着、增殖情况。
主要观察指标：补骨脂素抗菌双相陶瓷骨的理化性能、抗菌性和细胞相容性。
统计学分析：所得数据用SPSS 13.0软件进行处理，计算结果用x±s表示。

讨论

异种骨低温锻烧后完全去除了骨中的有机成分，可以彻底消除其抗原性，避免了传染疾病的可能^[7]。同时，原有的天然孔隙结构仍然保留，有利于血管及组织长入^[8]。支架材料一般以骨小梁为参照，抗压强度应大于5 MPa^[9]。该材料经过抗压强度测试，测得抗压强度为(4.69±0.50) MPa，结果非常接近抗压强度要求，基本满足了作为骨移植材料的要求。
体外细胞培养法是检测生物材料细胞毒性的重要方法，在研究生物材料安全性、功能性方面有重要意义^[10]。体外复合细胞培养在研究生物材料的细胞毒性及其对细胞功能影响方面有如下优点^[11]：对材料毒性敏感性高；重复性好、简便、易行、快速；易于控制实验条件，使其标准化；可用人体细胞进行实验；药物剂量的范围和梯度易控制；易于定量分析；减少动物实验；费用较低廉。实验中观察到细胞在材料上能够附着，随时间增加细胞在材料上增殖，细胞数量明显增多，可见多数细胞呈长梭形，随材料表面特征成一定方向排列，细胞有多个细长突起，并交互连接，这说明细胞在补骨脂素抗菌双相陶瓷骨材料上能很好附着，保持良好的状态和功能并可快速增殖，据此推断材料具有良好的生物相容性和潜在的成骨性。
随着现代工业化机械化程度的提高，创伤、感染、肿瘤、事故、战争、地震等所致的大量污染性骨缺损发生率大幅度升高，传统治疗方法一般选择先清创，待伤口关闭且无感染迹象3-6个月后再行二期植骨修复。而一期植骨常因发生较高的感染率而被视为禁忌，且临床上细菌耐药性的问题日益严重，对抗菌剂提出了更高的要求。为解决传统治疗方法所带来的治疗时间增加、手术难度增大、增加患者痛苦和经济负担等一系列问题，近年来国内外学者改变传统观念，在抗菌骨移植材料的基础实验和临床实践方面进行了大量研究，取得了一定的进展，其中加载抗生素骨移植材料研究最多^[12]。但由于临床上抗生素滥用导致细菌耐药性的问题日益严重，植骨材料加载抗生素的作用越来越局限化，对植骨材料抗菌性能提出了更高的要求。基于上述问题，作者设想设计出不同于加载抗生素骨移植材料的具有一定抑菌性能的抗菌双相陶瓷骨。
壳聚糖无毒性，具有优良的生物相容性、生物可降解性，是理想的细胞外基质材料，可促进多种组织细胞的黏附和增殖。壳聚糖本身具有生物活性，可促进血管内皮的生长、角质细胞、成骨细胞的增生，还具有消炎、抗菌、调节免疫功能等特性，作为生长因子载体和支架材料已被用于皮肤、神经、骨和软骨及肝脏组织工程中，另外还可被用作伤口敷料、药物缓释剂、缺损填充物等。壳聚糖具有生物黏附性和多种生物活性，生物相容性好，毒性低，不溶血，可被体内溶菌酶、胃蛋白酶等多种酶生物降解，降解产物无毒且能被生物体完全吸收，比较适于作为缓控剂。近年来，在国内外其作为一种新型药用辅料在缓控释给药系统中得到了广泛应用和研究^[13-15]。壳聚糖具有抑菌性，其抑菌作用可能有两种机制：一种是壳聚糖通过正电荷的NH3+吸附带负电荷的细胞壁，细胞质壁分离，从而起到抑菌杀菌作用；另外一种机制是壳聚糖渗入细胞体内，吸附带有阴离子的细胞质，并发生絮凝作用扰乱细胞正常的生理活动，从而杀灭细菌^[16]。有实验表明，壳聚糖可降低金黄色葡萄球菌诱导家兔骨髓炎的感染率^[17]。
壳聚糖具有缓控释作用，与补骨脂素复合于双向陶瓷骨后，可以使补骨脂素缓慢持续发挥作用。实验证实，补骨脂素抗菌双相陶瓷骨能够发挥抑菌作用，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有较强的抑制效果，是一种区别于传统加载抗生素骨移植材料的双相陶瓷骨。
补骨脂素属香豆素类，是中药补骨脂中的主要化学成分，临床上应用补骨脂素及其复方治疗骨质疏松、促进骨折愈合等均有良好作用[18]。补骨脂素能促进骨再生和重建。杨荣平等[19]采用体外成骨细胞实验法，将补骨脂提取物作用于新生大鼠颅骨成骨细胞，检测成骨细胞的增殖率及碱性磷酸酶含量，结果证明补骨脂素能促进大鼠颅骨成骨细胞碱性磷酸酶活性及其增殖。张润荃等^[20]研究证明补骨脂素能抑制破骨细胞在骨上形成吸收陷窝的增加与扩张，表明补骨脂素对破骨细胞有抑制作用。另外，研究发现补骨脂素能够抑制多种细菌[21]，补骨脂素中的黄酮类成分有较强的抗金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌作用^[22]，萜酚类成分具抗幽门螺旋杆菌活性^[23]。
基于壳聚糖和补骨脂素的以上特点，利用壳聚糖的成膜性、抗菌性和缓释作用，将补骨脂素复合于支架材料，制备出与传统加载抗生素支架材料不同的抗菌性植骨材料，该支架材料具有一定抗压强度，抗压强度为 (4.69±0.50) MPa，可以满足作为骨移植材料的要求。补骨脂素抗菌双相陶瓷骨具有良好的生物相容性，细胞在其表面上能很好附着，可以保持良好的状态和功能并快速增殖，并证实补骨脂素/壳聚糖溶液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有较强的抑制作用，从侧面佐证了补骨脂素抗菌双相陶瓷骨的抑菌性能。
补骨脂素抗菌双相陶瓷骨将传统中药与现代材料技术相结合，拓展了组织工程研究的思路和方法，并且具有良好的细胞相容性、抗菌活性和潜在成骨性，作为一种新的中药抗菌植骨材料具有潜在的应用前景，值得进一步深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程