体外诱导骨髓与脐血间充质干细胞向成骨细胞分化及其成骨活性的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.23.008

摘要/Abstract

摘要：

背景：脐血与骨髓来源的间充质干细胞在一定诱导条件作用下均具有多向分化的能力。
目的：比较脐血与骨髓来源间充质干细胞向成骨细胞诱导分化能力的差异。
方法：采用密度梯度法分离培养人脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞，当细胞汇合90%后胰蛋白酶消化传代，取第3代脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞，以细胞密度为8×10⁴/孔接种，当细胞达80%融合时，加入含体积分数为10%胎牛血清、0.1 μmol/L地塞米松、50 μmol/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠的低糖型DMEM成骨细胞诱导液培养。
结果与结论：两种来源间充质干细胞的形态和生物学特性无明显差异，细胞表面均强表达CD44，CD29，不表达CD34；两者均具有向成骨细胞诱导分化的潜能，稳定表达了成骨细胞标志性的产物碱性磷酸酶、骨矿化结节，而且两种细胞的成骨活性差异无显著性意义。结果表明脐血和成人骨髓来源间充质干细胞向成骨细胞诱导分化能力相似，均可作为骨组织工程的种子细胞。

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐血间充质干细胞, 骨髓间充质干细胞, 成骨细胞, 诱导分化

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells isolated from cord blood and bone marrow have multi-directional differentiation ability under a certain condition of induction.
OBJECTIVE: To compare the difference of differentiation of umbilical cord blood and bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts.
METHODS: Human umbilical cord blood and bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured by density gradient method. When reached 90% confluency, mesenchymal stem cells were digested by trypsin for subculture. At the third passage, umbilical cord blood mesenchymal stem cells and bone marrow mesenchymal stem cells at 8×10⁴/well were incubated. When reached 80% confluency, cells were treated with low-glucose DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum, 0.1 μmol/L dexamethasone, 50 μmol/L vitamin C and 10 mmol/L β-sodium glycerophosphate.
RESULTS AND CONCLUSION: There was no significant difference in morphology and biological properties of the two kinds of mesenchymal stem cells. Cells were highly expressed CD44, CD29, but did not express CD34. They had the ability to differentiate into osteoblasts, which had a positive staining for known markers: alkaline phospatase and calcium in vitro mineralization. There was no significant difference in the activity of osteoblasts of two kinds of cells. Results verify that umbilical cord blood and adult bone marrow mesenchymal stem cells can be induced into osteoblasts with a similar ability, and they can be used as seed cells for bone tissue engineering.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐血间充质干细胞, 骨髓间充质干细胞, 成骨细胞, 诱导分化

中图分类号:

R394.2

邵帅，周晨红，徐丽丽. 体外诱导骨髓与脐血间充质干细胞向成骨细胞分化及其成骨活性的比较[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(23): 3652-3657.

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图/表（结果） 4

2.1 间充质干细胞形态学表现 Percoll分离液分离脐血得到的白膜层细胞在接种到培养瓶的48-72 h内贴壁，开始细胞生长缓慢，形态不均一，呈现梭形、多角形、小圆形等多种形态，2周左右生长较快，形成形态较均一的梭形细胞，待融合率达到80%-90%时可见细胞呈漩涡状或平行排列生长，体积略小，随培养时间延长细胞逐渐增大伸展(图1)。
原代骨髓间充质干细胞于培养24 h内贴壁，72 h后大多数细胞有胞浆突起，呈长梭形、纺锤形。培养至1周左右，细胞明显增多、变大，梭形突起变长。2周左右，细胞基本铺满皿底，细胞生长呈平行排列状或漩涡状(图2)，与脐血间充质干细胞相比，贴壁早，增殖快。

2.2 间充质干细胞的超微结构特点透射电镜观察显示：细胞核不规则，核异染色质少，核仁明显，胞质中有扩张内质网、微管、微丝以及线粒体等少量细胞器，还有少量的基质小泡(图3)。两种间充质干细胞无明显差别。

2.3 细胞表面标志物表达采用流式细胞仪测定表面抗原分子，均高表达CD44和CD29；而不表达造血干细胞标志CD34(图4)。
2.4 成骨诱导分化后细胞形态成骨诱导后细胞形态改变，由原来的梭形变成了立方形，细胞逐渐汇合呈铺路石状，细胞生长形成结节样结构(图5)。两种细胞无明显差别。

2.5 碱性磷酸酶活性测定结果碱性磷酸酶活性随着诱导培养时间的延长而呈现逐渐升高的趋势，空白对照组无碱性磷酸酶活性，脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞成骨诱导后的碱性磷酸酶活性差异无显著意义(图6)。
2.6 成骨诱导的茜素红染色结果细胞经成骨诱导2周后给予茜素红染色，可见被染成红色的钙结节，结节呈圆形、大小不一(图7)，空白对照组无钙结节形成。

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引言

间充质干细胞是中胚层发育的早期细胞，具有全能干细胞的特性。间充质干细胞在一定的条件下可以分化为成骨细胞[1]、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、内皮细胞、神经细胞而日益引起人们的关注^[2]。目前证实间充质干细胞存在于骨髓、脐带、肝脏、脾脏、皮肤等组织中。骨髓间充质干细胞存在于骨髓基质中，是一种具有很强自我复制能力的成体干细胞，在一定条件下具有多向分化的潜能。脐血是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液，含有丰富的干细胞和祖细胞^[3]。近期研究表明，脐血间充质干细胞在临床应用方面前景广阔，其具有向多种组织细胞分化的能力，可在体内外分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞^[4-6]。
骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨质脆性增加和易于骨折的代谢性骨病^[7]。人们通常将骨质疏松比喻为“无声杀手”，其起病较隐匿，如果不引起重视给予适当的干预，可造成骨折等严重的后果甚至危及生命，而且骨质疏松和骨折的康复治疗给社会和个人带来了沉重的经济负担。研究显示骨质疏松多伴有成骨细胞的减少，随着研究技术的成熟，期待成骨细胞替代疗法成为治疗骨质疏松症的新靶点^[8-9]。本实验利用骨髓间充质干细胞及脐血间充质干细胞在一定条件下均可诱导分化为成骨细胞的特点，比较两种来源间充质干细胞向成骨细胞的分化情况，以期寻求一种更简便、经济实用的方法，为临床成骨细胞再生、细胞治疗领域提供实验参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

设计：细胞水平体外对比观察实验。
时间及地点：于2014年1至12月在青岛大学附属医院中心实验室完成。
材料：
脐血：取自足月正常分娩的产妇，排除传染性疾病及各种家族遗传疾病，标本采集严格无菌操作，取血前征得产妇及其家属同意，由青岛大学附属医院妇产科提供。
骨髓：取自髂骨移植术或髋部骨折手术患者，年龄18-55岁，排除其他系统性疾病和骨质疏松，均征得患者知情同意并经青岛大学附属医院伦理委员会批准。
实验用主要试剂：低糖型DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、荧光二抗、胰蛋白酶(美国Sigma公司)；Percoll分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)。
实验方法：
骨髓间充质干细胞的分离培养：参考Azizi等[10]的方法，无菌条件下抽取患者骨髓2 mL，经肝素抗凝后用等量的PBS稀释，再缓慢加入等量的Percoll分离液中，离心 (2 000 r/min，10 min)，吸取白膜层，PBS冲洗稀释后再次离心。将离心后的沉淀细胞用含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM(LG-DMEM)培养液制成单细胞悬液，接种于培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%CO2的恒温培养箱中进行培养，去除未贴壁细胞，每隔3 d换液1次。待原代细胞融合率达90%时，室温下0.25%胰蛋白酶消化 2 min，离心后弃上清，按1︰2比例进行传代。
脐血间充质干细胞的分离培养：对采集后2 h内的脐血标本进行分离，然后再将脐血用PBS按1∶1比例进行稀释，分离及培养方法与上述骨髓间充质干细胞相同。
细胞形态学观察：在倒置显微镜下，每天观察脐血间充质干细胞及骨髓间充质干细胞的生长情况并拍照。
透射电镜观察细胞超微结构：将生长状态良好的第3代脐血间充质干细胞及骨髓间充质干细胞制备成单细胞悬液，2.5%戊二醛固定，待4 ℃过夜后用磷酸盐缓冲液洗涤，1%锇酸固定2 h后梯度乙醇脱水，Ep0812包埋，常规超薄切片。用醋酸铀及枸橼酸铅双染色，EM-100s透射电镜下观察间充质干细胞的超微结构。
细胞表面标志物的检测：取生长旺盛的第3代脐血及骨髓间充质干细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞，离心后弃上清，加磷酸盐缓冲液制成单细胞悬液，调整细胞浓度1×109 L-1，并将其分装至EP管，每管0.2 mL，再分别加入PE标记鼠抗人CD29 0.04 mL，FITC标记鼠抗人CD34、CD44各0.01 mL，对照组加入FITC、PE各0.04 mL、0.02 mL，4 ℃避光孵育30 min，离心(1 500 r/min)，加0.2 mL多聚甲醛后避光保存，上流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。
间充质干细胞向成骨细胞诱导分化：取生长旺盛的第3代脐血间充质干细胞及骨髓间充质干细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，分别以细胞密度8×104/孔直接接种于预先经多聚赖氨酸处理的6孔培养板中进行成骨细胞诱导。实验分为2组，分别为成骨诱导组和空白对照组，3个孔为空白对照组，持续用完全培养液(含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM)培养，每隔3 d换液1次。另3个孔为成骨诱导组，细胞达到80%-90%融合后，去掉原培养液，更换为成骨诱导液(体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM+0.1 μmol/L地塞米松+10 mmol/L甘油磷酸钠+50 μmol/L抗坏血酸)进行培养，每隔3 d换液1次，观察细胞的生长形态变化。
成骨细胞碱性磷酸酶活性检测：将骨髓间充质干细胞及脐血间充质干细胞在诱导4，8，12，16 d时去除培养液，PBS洗涤2次，在每孔中加入0.1%500 μL的TritonX-100，完全裂解后收集裂解液，按照碱性磷酸酶测定试剂盒说明操作，用紫外分光光度计测定波长为520 nm处各孔吸光度值，根据提供的公式计算碱性磷酸酶活性。
钙结节染色：于诱导2周后吸弃培养基，磷酸盐缓冲液清洗2次，体积分数为95%乙醇原位固定后PBS洗涤2次，加0.5%茜素红染剂，37 ℃孵育30 min后吸弃染剂，PBS清洗2遍，室温下干燥，镜下观察矿化结节形态并拍照。
主要观察指标：①细胞形态变化。②细胞超微结构。③细胞表面标志物表达。④成骨诱导后碱性磷酸酶活性。⑤成骨诱导后矿化结节形成情况。
统计学分析：数据用SPSS 10.0软件进行方差分析，并用 Student-Newman-Keuls进行组间比较。各项参数均以x±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前对间充质干细胞的鉴定无统一标准，主要依靠细胞形态、克隆增殖能力、细胞表面标记物、诱导分化能力来进行鉴定^[11-14]。实验中发现脐血的白膜层细胞在48-72 h开始贴壁，细胞生长缓慢，细胞呈克隆样生长，形态不均一，呈现梭形、多角形、小圆形等多种形态，2周左右达到80%-90%汇合，细胞呈漩涡状或平行排列生长，体积略小，随培养时间延长细胞逐渐增大伸展。原代骨髓间充质干细胞于24 h内贴壁，72 h后大多数细胞有胞浆突起，呈长梭形、纺锤形。培养至1周左右，细胞明显增多、变大，梭形突起变长。2周左右，细胞基本铺满皿底，细胞生长呈平行排列状或漩涡状，与脐血间充质干细胞相比，贴壁早，增殖快。脐血间充质干细胞的培养较骨髓间充质干细胞成功率低，倍增时间较长，培养细胞总数较骨髓间充质干细胞少，这与既往实验中所研究的相一致^[15]。利用流式细胞仪检测细胞表面抗原分子，表明与其他来源的间充质干细胞相同，高表达CD44、CD29，不表达CD34。
许多物质可以刺激间充质干细胞向成骨细胞分化^[16-17]，如骨形态发生蛋白、转化生长因子β、胰岛素样生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、降钙素等，其中较常用的方法为地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸联合促进间充质干细胞向成骨细胞分化。本实验采用成骨诱导剂(维生素C+β-甘油磷酸钠+地塞米松)，成功地诱导骨髓间充质干细胞与脐血间充质干细胞向成骨细胞分化。成骨诱导后，细胞形态发生改变，由原来的梭形变成了立方形，细胞逐渐聚集成团并汇合呈铺路石状。经茜红素染色，可见被染成红色的钙化结节，经检测成骨细胞维持较高的碱性磷酸酶活性。既往有研究证实，维生素C可以促进体外培养细胞合成胶原，形成钙化，调节碱性磷酸酶活性并影响蛋白质合成的作用^[18-20]；β-甘油磷酸钠可以提供磷离子作为碱性磷酸酶的底物，在培养液中迅速将其水解后产生大量磷酸离子，促进生理性钙盐的沉积和钙化，是间充质干细胞发生矿化结节沉积的必要条件^[21]；地塞米松可以促进间充质干细胞碱性磷酸酶活性增强，早期以促进基质合成为主，而后期则以促进钙化为主^[22]。实验结果显示，脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞的分化能力无明显差异。
骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的重要标志之一是碱性磷酸酶活性的提高，常用细胞中碱性磷酸酶活性的高低来检测成骨细胞的存在及其分化成熟程度[23]。本实验在诱导后的第4，8，12，16天，分别对脐血成骨诱导组与骨髓成骨诱导组以及空白对照组的细胞进行碱性磷酸酶活性测定。实验结果表明随诱导培养时间的延长，脐血成骨诱导组与骨髓成骨诱导组碱性磷酸酶活性逐渐增加，在诱导第12天达到最高值，并且各时间点碱性磷酸酶活性均明显高于空白对照组，但脐血成骨诱导组与骨髓成骨诱导组之间无明显差异。成骨细胞的另一重要特性为矿化结节的形成，通过茜素红可以结合钙剂的特点来鉴定钙结节。碱性磷酸酶与矿化结节两者结合起来可以作为成骨细胞鉴定和功能状态评价的指标。实验证实两种细胞的成骨活性差异无显著意义。
现阶段治疗骨质疏松主要以药物方法为主，但是这种治疗方法存在着花费高、药物存在毒副作用、治疗疗程较长、疗效并不理想的缺点，所以需要寻求更理想的方法^[24]。骨质疏松症的主要机制是：①骨量丢失和骨质破坏是由于过度的骨吸收所致。②适合生长发育最佳的骨骼力学基础未形成。③骨形成不足无法更替受损骨^[25]，骨形成减少的病理核心是成骨细胞数量和功能下降[26]，因此骨质疏松症可以通过诱导间充质干细胞向成骨细胞分化来增加成骨细胞的数量从而达到治疗的效果。理想的种子细胞需要具备以下特征：①具有较强的增殖能力。②具有向成骨细胞分化的功能。③低免疫原性。④具有较好的迁徙能力，移植后能向病变部位迁移^[27]。脂肪源干细胞、胎鼠皮肤间充质干细胞和骨髓间充质干细胞是目前常用于治疗骨质疏松的干细胞。
骨髓间充质干细胞是骨髓基质系统中的一类多能干细胞，具有向中胚层和神经外胚层来源组织细胞分化的能力。骨髓间充质干细胞有获取简便、分离培养较容易、分化能力强、植入反应较为理想等优点。哺乳动物来源的骨髓间充质干细胞是具有多向分化潜能的成体干细胞，相关研究证实其有强烈的成骨潜能^[28]。骨髓间充质干细胞也存在一些缺陷，如成人骨髓中间充质干细胞的量非常少(0.001%-0.01%)，随年龄增加和病发疾病的情况下，骨髓间充质干细胞的数量和分化能力日益下降，而且抽取骨髓的过程是有创伤性的^[29-32]。因此，探寻其他可替代的间充质干细胞来源尤为重要。
人脐血中除含有丰富的干细胞和祖细胞，还富含间充质干细胞这一类非造血干细胞^[33]。从临床的角度，相比骨髓来源，人脐血获取更容易，避免了自体髂骨穿刺获取骨髓的局限性，采集和保存较容易，不给产妇和孩子造成伤害，不涉及伦理问题；其次，人脐血细胞类似于胚胎细胞，其相关的免疫发育尚未成熟，降低了排斥的风险，而且微生物和肿瘤细胞污染的可能性较小。有研究从冷冻保存长达半年至五年的脐血中成功培养出脐血间充质干细胞，相比其他来源的间充质干细胞，脐血间充质干细胞有其所不具备的优势^[34]。
实验研究表明成人骨髓间充质干细胞与脐血间充质干细胞均具有向成骨细胞定向分化的功能，且两种来源细胞的成骨活性差异无显著性意义。虽然脐血间充质干细胞存在着与骨髓间充质干细胞相比无法克服的缺点：频度低且培养相对较困难^[35]，但鉴于综上所述脐血间充质干细胞的优势，推测脐血将有可能成为治疗骨质疏松的理想细胞来源。

文章快阅

延伸阅读

近些年来，如何获取大量的间充质干细胞供临床使用成为干细胞领域研究的热点之一。目前对骨髓间充质干细胞的研究较多，诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的研究多在体外进行，且需要特定的诱导条件、优良的诱导剂及合适的剂量。骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化受到包括细胞周围生理环境在内等多种因素的影响，如何更真实的模拟细胞在体内发挥成骨作用时的细胞生理环境，将成为今后研究探索的重点和难点。其次，骨髓间充质干细胞经体外大量扩增后如何能很好地保持其多能干细胞的生物学特性尚有待解决，如既能控制骨髓间充质干细胞增殖，又能在适当的时候调控骨髓间充质干细胞定向分化等。由于骨髓间充质干细胞的来源有限，获取的过程为有创性，随着年龄增长，其细胞数量和分化能力明显下降，所以其作为种子细胞用于治疗疾病的能力受到了一定的限制，人们开始研究从人脐血中分离培养间充质干细胞的可行性及具体方法。脐血间充质干细胞具有取材容易、来源丰富、免疫原性较弱等优点，在细胞替代治疗、基因治疗以及组织工程学中具有重要的研究和应用价值，日渐受到国内外学者的关注。但目前对脐血间充质干细胞的研究尚处于初级阶段，仍存在许多尚待解决的间题，如：目前还未找到最佳有效扩增条件，缺乏可靠的鉴定间充质干细胞的统一标准，脐血间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的分子机制尚未明了等，这些问题都有待于进一步研究和探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程