脱细胞基质软骨支架的制备

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.16.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：脱细胞基质材料去除了天然材料中的细胞成分，保留了基质成分，有效降低了天然材料的免疫原性，同时能够保持材料的机械强度。
目的：拟利用洗脱方法去除兔肋软骨中的细胞基质，制备天然生物支架材料。
方法：取新西兰大白兔肋软骨，清除周围组织后随机分组处理，以未经处理的肋软骨作为正常对照组；48 h处理组以去污剂-酶化学消化48 h；96 h处理组以去污剂-酶化学消化96 h，3组均通过苏木精-伊红染色及电镜观察脱细胞效果。同时收集诱导第7天的兔骨髓间充质干细胞3×109 L-1，与同种异体肋软骨脱细胞基质体外复合培养，于第3，7天取复合物行电镜观察细胞在脱细胞基质表面的黏附生长情况。
结果与结论：新鲜肋软骨标本每个软骨陷窝内均有排列紧密的二三个软骨细胞，去污剂-酶化学消化后软骨陷窝内的细胞逐渐脱失，至消化处理96 h后，软骨陷窝内的细胞完全脱失。共培养第3天时，脱细胞基质表面有大量骨髓间充质干细胞分布，细胞为多角形，有伪足伸出，锚定在基质表面，部分区域可见细胞在基质表面增殖分裂；第7天时，脱细胞基质表面大部分均为细胞覆盖，细胞呈扁平状，有多个足突充分伸展，细胞之间互相连接，分泌大量细胞外基质沉积在基质表面，呈冰霜样改变，表明制备的脱细胞基质具有良好的细胞相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 软骨生物材料, 脱细胞基质, 组织工程, 软骨支架, 山东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Acellular matrix which is decellularized but retains the matrix components in the nature materials can reduce the immunogenicity of natural materials effectively and keep the material mechanical strength.
OBJECTIVE: To prepare the natural biological scaffold material by using elution method to remove the cells in the rabbit costicartilage matrix.
METHODS: After removal of the surrounding tissues, the costicartilage samples from New Zealand white rabbits were randomly divided them into three groups: costicartilages untreated as normal control group, detergent-enzyme digestion for 48 hours as 48-hour treatment group, detergent-enzyme digestion for 96 hours as 96-hour treatment group. Hematoxylin-eosin staining and electron microscope were used to observe decellularized effects. At 7 days of induction, bone marrow mesenchymal stem cells, 3×109/L, were collected and co-cultured with allogeneic acellular costicartilage matrix in vitro. At 3 and 7 days of co-culture, the composite was taken for observation of cell growth on the cell-free substrate surface under electron microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: Two or three cartilage cells were closely packed in each cartilage pit, began to depigment using the detergent-nuclease digestion method, and then completely depigmented at 96 hours after treatment. At 3 days of co-culture, there were a large amount of polygon-shaped adherent cells with pseudopodias observed on the acellular matrix surface in vitro, and cells could proliferate and divide in partial regions. At 7 days of co-culture, adherent cells spread mostly throughout the acellular matrix surface, these cells were flat-shaped and extended with multiple interconnected processes. Mass of secreted excellular matrixes were deposited on the matrix surface and showed frost-like changes, indicating the prepared acellular matrix has favorable cytocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: Tissue Engineering, Stem Cells, Chondrocytes

中图分类号:

R318

孙良,李丕宝，栾保华. 脱细胞基质软骨支架的制备[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(16): 2494-2499.

Sun Liang, Li Pi-bao, Luan Bao-hua. Preparation of an acellular cartilage matrix scaffold [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(16): 2494-2499.

图/表（结果） 2

2.1 大体观察新鲜肋软骨去除多余组织充分冲洗后，标本色淡黄，弹性良好(图1)。经脱细胞处理后，标本变成乳白色，软骨弹性良好(图2)。

2.2 组织学观察正常未经脱细胞处理的新鲜肋软骨苏木精-伊红染色切片，可见每个软骨陷窝内均有排列紧密的二三个软骨细胞，其细胞基质中的胶原红染，分布较为均一，细胞核明显蓝染(图3A)。随着消化处理时间延长，软骨陷窝内细胞逐渐脱失(图3B)，至96 h时，标本软骨陷窝内的细胞完全脱失(图3C)。

2.3 干细胞生长及诱导后染色观察原代骨髓间充质干细胞培养5 d后可见细胞集落单位形成(图4A)；诱导14 d后可见Ⅱ型胶原阳性细胞较多，阳性位置位于胞浆内，呈棕黄色至棕褐色细密颗粒，在胞核周围更加明显(图4B)，大部分细胞胞浆被染成蓝色，分布均匀一致，而胞核呈蓝黑色，异染明显(图4C)。

2.4 微观结构观察扫描电镜下可见，新鲜肋软骨标本软骨陷窝内软骨细胞生长，无脱失(图5A)；化学消化48 h组标本可见软骨细胞脱失随消化时间增长而增多(图5B)，至化学消化96 h仅见塌陷的细胞基底存在，软骨表面较新鲜标本光滑，软骨细胞脱失，软骨陷窝结构清晰可见(图5C)。

2.5 骨髓间充质干细胞与脱细胞软骨基质的联合培养第3天电镜下可见脱细胞基质表面有大量细胞成分分布，细胞为多角形，有伪足伸出，锚定在基质表面(图6A)，部分区域可见细胞在基质表面增殖分裂(图6B)；第7天时，脱细胞基质表面大部分均为细胞成分覆盖，细胞呈扁平状，有多个足突充分伸展，细胞之间互相连接，三四层细胞成层排列，局部可见6-8层，分泌大量细胞外基质沉积在基质表面，呈冰霜样改变(图6C)。

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引言

构建组织工程化软骨，除了需要种子细胞、细胞因子以外，寻找适合细胞生存的支架材料也是重要课题之一^[1]。而只有满足以下几个方面要求的支架材料才能称得上是理想的组织工程支架材料^[2-6]：①首先，该材料应具备良好的生物及组织相容性，这就要求材料除了应具有无毒、无致畸性以外，同时应无免疫原性并利于细胞在支架材料上的黏附及生长，如果以干细胞作为种子细胞，该支架材料还应有利于细胞的定向分化。②其次，可降解性。在工程化组织形成的同时，支架材料逐渐降解，其降解速率应与组织形成的速率一致，降解产物应该是无毒无害的。③第三，为了更有利于种子细胞的黏附、长入，细胞外基质的分泌，支架材料应该具有一定的孔隙率。④第四，根据不同部位软骨组织的特点，所形成的组织工程化软骨最好应有相应的三维立体结构，比如组织工程化气管，最好具有预定型管状结构或者易于制成管状结构，并且能够维持一定的大小和立体形状，能承受一定的压力，以期能够保持良好的气道生物力学特性，有效避免气道塌陷的发生。⑤第五，相对于其他材料在制备上更方便、更易储存及消毒等。

满足以上条件的支架材料主要有两种：人工合成材料支架及天然生物材料支架。后者相对于前者有着更多的优势，也是目前研究的热点，本实验通过脱细胞方法制备新型天然支架材料，通过观察移植细胞在支架上的生长情况，为进一步探讨组织工程中天然支架材料的制备提供了实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外观察。

时间及地点：于2012年8至12月在山东省立医院实验室、山东省交通医院再生医学研究中心完成。

材料：

实验动物：新西兰大白兔，体质量2.0-2.5 kg，购自山东省农科院，动物质量合格证号：scxk(鲁)20120013，实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

主要仪器：温控摇床由山东大学附属省立医院中心实验室提供；Leica-RM2135生物组织切片机、显微光学摄影系统均来自德国莱卡公司；S520扫描电镜(HITACHI公司，日本)。

实验方法：

获取软骨标本：取健康新西兰大白兔4只，处死后迅速以0.2%碘伏常规消毒。剥离胸壁皮肤，暴露并剪下肋软骨，剔除多余组织，所取肋软骨以每五六块作为1个样本(图1)，4 ℃ D-Hank’s清洗保存备用，热缺血时间少于15 min。

制备脱细胞基质^[7-14]：第1步，将兔肋软骨样本置于含0.35 mmol/L蛋白质阻断剂PMSF的低渗及高渗Tris-HCl缓冲液中，先后振荡漂洗24 h；第2步，将样本经D-hank’s缓冲液4 ℃洗净后，置于含体积分数1%Triton-X100的低渗Tris-HCl缓冲液4 ℃漂洗24 h；第3步，将样本置于1 g/L RnaseA、500 U/mL Dnase I混合消化酶液中37 ℃振荡消化4 h；第4步，再次加入含体积分数1%Triton-X100的低渗Tris-HCl缓冲液4 ℃漂洗，根据此步骤所需时间将实验分为化学消化48 h组、化学消化96 h组。最后将依次经以上4步处理后的样本置于D-hank’s缓冲液4 ℃持续漂洗后，置于-80 ℃低温冰箱冷冻过夜，于16 mm紫外线灯下20 cm照射交联24 h，环氧乙烷灭菌后室温保存备用。

大体观察：观察样本颜色、外观及形状变化。

苏木精-伊红组织学染色：将样本经体积分数4%中性甲醛室温固定后，入新鲜脱钙液(甲酸450 mL+盐酸45 mL+双蒸水300 mL)脱钙11 h，自来水冲洗4 h，然后经梯度乙醇脱水(依次经体积分数30%，50%，70%，85%，95%直至纯乙醇脱水)，二甲苯透明，浸蜡、包埋，切片机连续切片，切片厚度5 μm，制作ACTM石蜡切片。各组石蜡切片行苏木精-伊红染色。

扫描电镜观察：固定、脱水→临界点干燥→真空镀膜→SEM-520扫描电子显微镜下观察。以新鲜软骨标本同法处理作正常对照。

骨髓间充质干细胞的分离培养及诱导分化：取4只新西兰大白兔，各取骨髓液3-5 mL，用PBS稀释，吹打，加入密度为1.073 g/L的Percoll分离液，2 500 r/min离心20 min，取白色云雾状细胞及单个核细胞，计数后调整细胞密度，接种于L-DMEM培养基中进行培养，取传代后细胞，在细胞培养基内加入10 µg/L转化生长因子β1、10 µg/L胰岛素样生长因子1、37.5 mg/L维生素C、6.25 mg/L转铁蛋白进行诱导，采用Ⅱ型胶原免疫组化染色法及甲苯胺蓝染色法对诱导后细胞进行鉴定。

骨髓间充质干细胞复合同种异体软骨脱细胞基质培养：取诱导第7天的骨髓间充质干细胞，以胰蛋白酶消化，离心后重悬，调整细胞悬液浓度为3×10⁹L^-1。吸出12孔板中L-DMEM培养液，按照2 mL每个样本将骨髓间充质干细胞悬液均匀滴加在化学消化96 h组脱细胞软骨基质表面。将12孔板置于体积分数5%CO₂、37 ℃细胞培养箱内孵育 4 h。每孔添加适量完全培养基(含转化生长因子β、胰岛素样生长因子1、维生素C、转铁蛋白等条件诱导剂)，使液面没过样本。继续置于细胞培养箱内培养，隔日换液。7 d后更换普通完全培养基，隔日换液。按照接种第3，7天分别取复合物样本进行电镜观察，观察骨髓间充质干细胞在脱细胞软骨基质黏膜面的生长及细胞外基质分泌情况。

主要观察指标：电镜观察脱细胞效果，以及骨髓间充质干细胞在脱细胞软骨基质黏膜面的生长及细胞外基质分泌情况。

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讨论

组织工程另一个重要的环节就是如何获得能够提供种子细胞生长和细胞因子发挥作用的良好支架，三维支架材料在组织工程的构建中起着核心的作用^[15]，它能为软骨细胞提供三维空间结构，有利于细胞的黏附、增殖，为细胞生长提供良好的生长环境。目前的支架材料主要有天然生物材料：包括天然脱细胞基质材料、胶原材料、纤维蛋白、糖胺多糖、凡丁质、藻酸盐、蚕丝蛋白等；人工合成支架材料主要有聚乳酸、聚羟基乙酸等。

3.1 人工合成支架材料合成支架材料相对于天然支架材料有其独特的优点，但目前合成材料的研究又相对滞后，究其原因是由于于其生物活性相对较差，组织相容性并不理想。近年来在这方面研究较多的是聚羟基乙酸和聚乳酸等合成支架材料。

聚羟基乙酸：相对于其他合成材料来讲，聚羟基乙酸具有明显优势，主要原因是因为它是羟基乙酸的聚合物，当其被移植到人体后，随着时间的延长，可以降解为羟基乙酸单体结构，而这种化学物质的主要优点便是具有良好的组织相容性，在人体内不会产生毒性，同时有利于细胞的黏附与增殖。用这种材料作为组织支架，在复合上种子细胞后经培养可以保持细胞本身所具有的特性^[16]。这种材料的优点已被许多学者所证实^[17]。当然，与其他合成材料一样，聚羟基乙酸也存在着诸多不足，比如，降解速度与细胞生长速度不符，其过快的降解速度会导致降解产物在局部积聚，从而最终引起细胞中毒死亡。

聚乳酸：众所周知，乳酸是人体内糖酵解后的产物，而乳酸的聚合物便是聚乳酸(生物降解聚乳酸)的主要成分。因此，当其作为支架材料种植于人体之后，其最终降解物与人体组织将有更好的亲和性，不会对人体产生毒性。由此可见，其生物性能接近于天然的脱细胞基质材料。但作为一种聚合材料，聚乳酸也有其不可改变的缺点，即容易导致炎性反应。为了克服这一不足，许多学者试图通过将这种材料与其他生物材料复合移植的手段来改善他的生物性能。其中具有代表性的有Cook等^[18]、周长忍等^[19]分别将含有精氨酸结构的单体及甲壳素与聚乳酸相聚合，合成了新型复合人工支架材料，经证实用此种方法复合后的材料能够有效促进细胞在其上的扩散与定植，不仅如此，复合后的材料也同时具有良好的组织相容性。但现代技术无法改变的是，与其他材料相复合后聚乳酸仍然具有大多数人工材料的特点。因此其在实际应用方面仍需进一步改进制备工艺。

目前软骨组织工程在合成支架材料方面迫切需要解决的问题主要包括材料引起的炎症与免疫反应等^[20]。另外，材料的可塑性、可降解性及费用方面的问题也需进一步的克服。

3.2 天然生物材料

天然脱细胞基质：众多研究已经证实，细胞表面存在有特异性的免疫球蛋白，能够引起抗原抗体反应。因此，如果能够去除天然材料中的细胞成分并保留其基质成分，将会有效降低天然材料的免疫源性，同时能够保持材料的机械强度。而具备这种特点的天然生物材料便是脱细胞基质材料。由此可见，构成这种材料的主要成分是由细胞合成并分泌至胞外的成分，其中有起支持作用的纤维成分，包括胶原蛋白、弹性蛋白等；也有起连接作用的纤维粘连蛋白、层粘连蛋白；还有发挥充填作用的糖胺聚糖等成分。以上细胞外基质共同对细胞的生长产生调控，从而有利于细胞在支架材料上黏附、增殖。本课题所制备的脱细胞基质材料较其他天然生物材料及人工合成材料有较高的组织相容性，并且具有一定的力学强度。由于实验中只是对脱细胞后肋软骨表层做了大致观察，至于其内部的孔隙率并未有深入研究，因此脱细胞处理后的支架是否适合细胞向深层生长还有待进一步研究。

胶原：胶原是细胞外基质中的一种张力强度很高的纤维状蛋白质，富含甘氨酸和脯氨酸。人体中胶原蛋白的含量最高，约占30%，而它也是构成细胞外基质的主要物质，它的存在为细胞生长提供了良好的支架，有利于细胞的黏附与增殖，有学者在分别用Ⅰ型和Ⅱ型胶原做支架培养细胞时发现，细胞在这一天然支架上的增殖及分化能力较强^[21-22]，这也进一步证实，胶原蛋白中含有可供细胞识别的信号，以此来促进细胞表型的表达。然而这种天然材料也有其自身的严重不足，主要表现在其抗张性较差，在较大强度下容易断裂，不利于细胞的生长。而其过快的降解速度也是阻碍其应用的一大弊端。

纤维蛋白：是一类主要的不溶于水的蛋白质，多存在于血液中。与其他天然支架材料相似，其组织相容性良好，其促进细胞黏附及增殖生长的主要因素是能够释放两种活性因子，即血小板衍生生长因子和转化生长因子。而这一过程的需要由其单体结构聚合成凝胶后得以实现。由此可见纤维蛋白也是一种理想的天然的组织工程支架材料，然而其缺点与胶原蛋白相似，即机械强度差、抗张力较低^[23]，并且来源范围较窄、无法大量提取，目前仅应用于小范围非承重区的软骨修复。

以上所列举几种天然生物支架材料的共同特点均是由生物体本身所分泌物质，所以较合成材料有更好的生物相容性，更高的降解率。其降解过程与体内代谢产物的分解过程极为相似，不会对人体产生不良刺激与毒性反应。可以肯定的是，天然材料在这些方面的优势是合成材料无法达到的。当然通过制作脱细胞软骨基质材料也发现制备过程中尚有诸多问题需要解决：由于每次实验的客观条件会有所差异，所以制备出的材料的孔隙率与基质的保存率等并不完全统一，因此在制备过程中需要统一材料的制作标准，以更好的控制产品的质量；合成及混合生物材料应该在增强其生物相容性、降低其免疫原性等方面做进一步的研究，因此应该从材料的性质及制备方法上进行探索，以生产出复合组织工程学中细胞生长特性的理想材料；目前存在的天然支架材料及其衍生物的应继续进行研发，以克服其强度差、降解快的缺点，以期生产出适合细胞粘附增殖的理想材料；虽然制备出了具有一定孔隙率的脱细胞基质材料，但材料与细胞复合后的生长情况并未进行进一步的研究，这方面的内容将会在本课题后期试验中继续探讨。

实验中用脱细胞方法制备的基质材料是近10年随着组织工程学的发展而逐渐发展起来的一种新兴支架材料，目前用这种方法制备的脱细胞真皮支架已经上市并应用于临床^[24]。同时运用天然脱细胞材料进行其他组织器官修复的研究也屡见不鲜^[25]，其研究结果比较满意。这些研究均为制备脱细胞软骨提供了可靠的理论依据，在制备过程中为了有效去除软骨细胞表面存在的组织相容性抗原，防止表面抗原暴露导致移植失败^[26]，采用了酶-去污剂的化学消化法对软骨进行处理。而以往在降低天然软骨支架的免疫原性方面曾出现过各种不同的方法，但最终结果均不甚理想。后来研究发现所制备支架材料的免疫原性主要存在于基质内的细胞成分中^{[27 -28]}，因此如何去除软骨基质内的细胞，成为后来研究的重点。其中Courtman等^[29]提出的去污剂- 酶法取得了一定的效果。本实验证实运用此种方法结合以往冻干、照射等方法可以脱出软骨基质中的各种细胞成分，同时可以保留弹性蛋白、胶原等细胞外基质材料，由于在制备过程中反复用去污剂及酶对细胞成分进行处理，充分去除了其内的软骨细胞及细胞表面的组织相容性抗原，最终降低了支架的免疫原性^[30]。另一方面，为了尽可能减少消化酶对破坏基质中的胶原纤维，避免降低支架材料的机械性能，在其中加入了蛋白酶阻断剂，既去除了细胞成分又可以保留胶原纤维等基质成分，以利于细胞在材料表面的增殖分化。用此方法制备的支架材料表面具有供细胞识别的特定信号，通过识别该种特殊信号，细胞可以有效黏附于支架表面并增殖分化。

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