设计：体外观察性实验。
时间和地点：于2012年9月至2013年10月在青岛大学附属医院山东省创伤骨科研究所完成。
材料：
|
组织工程骨软复合体构建实验试剂：
|
|
试剂
|
来源
|
|
DMEM培养基及胎牛血清
|
Hyclone公司，美国
|
|
地塞米松、转化生长因子β、胰岛素、
胰酶、抗坏血酸、转铁蛋白及二甲基亚砜
|
Sigma公司，美国
|
|
Trizol说明书
|
Invitrogen公司
|
|
引物合成
|
广州英骏生物技术有限公司
|
|
实验动物：间充质干细胞取自10月龄健康雄性中国青山羊，体质量15 kg，由青岛大学实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
实验材料：自行设计的双腔搅拌式生物反应器由2个玻璃容器构成(图1)，用强力夹将两部分牢固结合而不漏液。中央由隔板封闭，隔板上嵌有多个内径5 mm孔道，恰能插入β-磷酸三钙柱状支架。上方预留开口可向软骨腔室和骨腔室内分别注入成软骨和成骨诱导培养基。双腔室内各有一磁力转子，置于磁力搅拌仪上，可在培养基内旋转产生涡流即剪切应力。
β-磷酸三钙支架由贝奥路生物材料有限公司提供，直径5 mm，长度10 mm，支架的孔隙率达(75±10)%且完全相通，平均孔隙直径为(530±50) μm。
实验方法：
羊骨髓间充质干细胞的体外分离扩增：取10月龄健康中国青山羊，无菌条件下行髂骨穿刺，抽取骨髓10 mL，置于含15 000 U肝素和10 mL DMEM离心管中，离心过滤后接种入培养瓶内，加含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，置37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱内培养。待细胞生长融合达近80%后，经胰酶消化后传代培养，第3代细胞备用。
构建组织工程骨软骨复合体：将第3代细胞制成细胞浓度5×1010 L-1的悬液约1 mL，利用负压吸引种植技术将单细胞悬液吸入β-磷酸三钙支架，于37 ℃、体积分数5%CO2恒温培养箱静置4 h。然后将上述细胞支架复合物插入生物反应器中央隔板上，使2 mm长位于软骨腔室内，其余位于骨腔室内。用1.2%藻酸钠和102 mmol/L氯化钙形成的凝胶状物质封闭支架材料与隔板结合的部分以及支架材料的两室分界处，避免两个腔室之间的培养基互相渗漏。分别向双腔室内注入成软骨培养基(含体积分数10%胎牛血清、 6.25 mg/L胰岛素、6.25 mg/L转铁蛋白、0.2 mol/L抗坏血酸、0.1 µmol/L地塞米松及10 µg/L TGF-β的DMEM培养基)和成骨培养基(含体积分数10%胎牛血清、0.1 µmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.05 mol/L抗坏血酸的DMEM培养基)。根据施加剪切应力与否分为两组，一组为动态培养组，双腔室内的磁力转子以旋转速度5 r/min旋转；另一组为静态培养组，在静态环境下进行诱导。每3 d更换1次培养基。分别在培养7 d和14 d将构建的细胞支架复合体分成软骨部分和骨部分进行检测。
主要观察指标：
MTT法检测细胞在支架材料上的增殖活性：分别将成骨和成软骨构建体放置24孔板，加入MTT (5 g/L) 200 µL，37 ℃ CO2孵箱内孵育4 h，小心吸取MTT后，加入二甲基亚砜0.5 mL，振荡15 min，酶标仪上选择波长570 nm，测定吸光度值。
RT-PCR检测细胞在支架材料上的成骨和成软骨诱导分化：成骨方向检测碱性磷酸酶和骨钙素基因表达，成软骨方向检测Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因表达。引物设计参考文献报道，由广州英骏生物技术有限公司引物合成。碱性磷酸酶引物序列：上游CCT TCC AGT TAA ACC GAC CA，下游TCT TTG GGA AGC TCG TCA CT，扩增片段长度为600 bp；骨钙素引物序列：上游AAA GCC TGG TGA TGC AGA GT，下游TTA TTC TAG AGC AGC GGG GA，扩增片段长度为 329 bp；Ⅱ型胶原引物序列：上游TTC AGC TAT GGA GAT
.jpg)
GAC AAT C，下游AGA GTC CTA GAG TGA CTG AG，扩增片段长度为472 bp；蛋白聚糖引物序列：上游GAG ATG GAG GGT GAG GTC，下游ACG CTG CCT CGG GCT TC，扩增片段长度为443 bp；GAPDH引物序列：上游CTC AGA CAC CATG GGG AAG GTG A，下游ATG ACT TGA GGC TGT TGT CAT A，扩增片段长度为450 bp；按Invitrogen公司Trizol说明书提取总RNA，RT-PCR步骤按常规进行。取5 µL PCR扩增产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳成像，Image Proplus 6.0分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化，以目的基因灰度值/内参基因灰度值表示mRNA相对表达量。
扫描电镜检测细胞黏附生长：将培养14 d的材料取出，3%戊二醛固定，梯度乙醇脱水，临界点干燥，表面喷金后进行扫描电镜观察细胞黏附生长状况。
统计学分析：实验数据以x±s表示，采用SPSS 13.0行独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。
