炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基修复小肠黏膜急性辐射损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.013

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (10): 1544-15550.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.013

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基修复小肠黏膜急性辐射损伤

刘婉薇¹，陈韵²，郑跃¹，沙卫红¹，王启仪¹，叶山亮¹，陈浩¹

¹广东省人民医院消化内科，广东省医学科学院，广东省广州市 510080；²广东医学院第一临床学院，广东省湛江市 524023

出版日期:2015-03-05 发布日期:2015-03-05
通讯作者: 陈浩，博士，医师，广东省人民医院消化内科，广东省医学科学院，广东省广州市 510080
作者简介:刘婉薇，女，1964年生，广东省广州市人，汉族，1989年中山医科大学毕业，副主任医师，主要从事胃肠病的诊治、干细胞的基础和临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81300279)；中国博士后科学基金项目(2012M521579)；广东省自然科学基金项目(S2013040013549)；广东省医学科研基金项目(A2014020)

Effects of bone marrow mesenchymal stem cell conditioned medium with and without inflammatory activation on radiation-induced intestinal injury

Liu Wan-wei¹, Chen Yun², Zheng Yue¹, Sha Wei-hong¹, Wang Qi-yi¹, Ye Shan-liang¹, Chen Hao¹

¹Department of Gastroenterology, Guangdong General Hospital and Guangdong Academy of Medical Science, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China; ²First Clinical School of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, Guangdong Province, China

Online:2015-03-05 Published:2015-03-05
Contact: Chen Hao, M.D., Physician, Department of Gastroenterology, Guangdong General Hospital and Guangdong Academy of Medical Science, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Liu Wan-wei, Associate chief physician, Department of Gastroenterology, Guangdong General Hospital and Guangdong Academy of Medical Science, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81300279; China Postdoctoral Science Foundation, No. 2012M521579; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. S2013040013549; the Medical Science Research Foundation of Guangdong Province, No. A2014020

摘要/Abstract

摘要：

背景：间充质干细胞条件培养基被认为是干细胞移植的良好替代方案。既往研究表明，炎症因子的诱导激活能增强间充质干细胞多种生物学潜能，而正常状态的间充质干细胞可能由于免疫活性和迁徙能力不足，无法有效修复损伤组织。

目的：探讨炎症预激活前后骨髓间充质干细胞条件培养基对急性辐射损伤小肠上皮治疗作用的差异。

方法：分离、培养、鉴定SD幼鼠骨髓间充质干细胞，分别与正常对照和辐射损伤的小肠隐窝细胞株IEC-6在Transwell培养板中共培养24 h，预刺激的骨髓间充质干细胞继续单独培养48 h，收集到的上清液分别为正常状态间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^NOR)和辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^IR)。将成年SD大鼠随机分为4组，正常对照组、辐射损伤组、MSC-CM^NOR治疗组和MSC-CM^IR治疗组，以14 Gy剂量一次性腹部局部照射制备急性小肠辐射损伤大鼠模型，模型制备后尾静脉注射和植入式胶囊渗透压泵腹腔植入联合给药。于治疗后第1，3，7天取小肠组织检测短回路电流和血清木糖水平观察小肠分泌、吸收功能变化。治疗后第3天取小肠组织行电镜观察超微结构改变，治疗后第1，3，5，7，14天取小肠组织行苏木精-伊红染色观察小肠黏膜组织学改变。记录各组大鼠生存状态及生存时间。

结果与结论：输注MSC-CM^IR后，大鼠小肠短回路电流差值、血清木糖水平较辐射损伤组升高，差异有显著性意义(P < 0.05)。苏木精-伊红染色和电镜观察显示从治疗后第3天起MSC-CM^IR组小肠黏膜病理改变明显减轻，上皮厚度、紧密连接间隙明显优于辐射损伤组。生存分析显示MSC-CM^IR组生存率和平均生存时间明显改善(P < 0.05)，而MSC-CM^NOR组的各项指标与辐射损伤组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。结果表明炎症激活状态下的骨髓间充质干细胞条件培养基可促进辐射损伤小肠结构和功能的修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 移植, 骨髓间充质干细胞, 条件培养基, 小肠, 辐射损伤, 细胞疗法, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Conditioned medium from mesenchymal stem cells (MSC-CM) may represent a promising alternative to MSCs transplantation. Previous studies have shown that inflammatory activation can strengthen the multiple biological potencies of MSCs; however, normal MSCs with insufficiency of immunocompetence and migration ability are not effective for tissue damage repair.

OBJECTIVE: To investigate differential effects of MSC-CM with and without inflammatory activation on radiation-induced intestinal injury.

METHODS: MSCs from the bone marrow of SD rats were separated, cultured and identified, and then co-cultured with non-irradiated IEC-6 or irradiated IEC-6 in a transwell system for 24 hours. Then, MSCs with inflammatory activation were cultured alone for another 48 hours. After that, the supernatant was collected as non-activated MSC-CM (MSC-CM^NOR) and MSC-CM under radiation-induced inflammatory condition (MSC-CM^IR). Rats were exposed to 14 Gy whole abdominal irradiation and randomly divided into four groups: control group, radiation injury group (DMEM/F12), MSC-CM^NOR group and MSC-CM^IR group. Continuous administration was given via tail vein and intraperitoneal implantation of Alzet microosmotic pumps. Intestinal samples were collected at 1, 3, 7 days after radiation for analysis of short circuit variation, at 3 days after radiation for analysis of intestinal epithelium ultrastructure, and at 1, 3, 5, 7, 14 days after radiation for histological observation of the intestinal epithelium using hematoxylin-eosin staining. Blood samples were collected at 1, 3, 7 days after radiation for analysis of serum xylose levels. In addition, the survival state and survival time of rats were observed and recorded.

RESULTS AND CONCLUSION: The short circuit variation responding to electrical field stimulation was significantly reduced at all frequencies, but it was significantly improved in the MSC-CM^IR group. Similarly, the intestinal absorption (serum xylose levels) was also significantly impaired by irradiation, but improved by delivery of MSC-CM^IR (P < 0.05). At 3 days after MSC-CM^IR infusion, the intestinal epithelium exhibited an increase in crypt size and villous length (P < 0.05). Under the electron microscope, a reduction in intestinal microvilli and open tight junctions in irradiated intestinal epithelium was found, and the intestine from rats treated with MSC-CM^IR had more obvious tight junctions. In addition, treatment with MSC-CM^IR dramatically improved the survival rate and mean survival time of irradiated rats as compared to those treated with DMEM/F12 or MSC-CM^NOR (P < 0.05). Taken together, the present study demonstrated that MSC-CM^IR, but not non-activated MSC-CM, improves the structural and functional restoration of the small intestine after radiation-induced intestinal injury.

全文链接：

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Culture Media, Radiation Injuries, Intestine, Small

中图分类号:

R394.2

刘婉薇，陈韵，郑跃，沙卫红，王启仪，叶山亮，陈浩. 炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基修复小肠黏膜急性辐射损伤[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(10): 1544-15550.

Liu Wan-wei, Chen Yun, Zheng Yue, Sha Wei-hong, Wang Qi-yi, Ye Shan-liang, Chen Hao. Effects of bone marrow mesenchymal stem cell conditioned medium with and without inflammatory activation on radiation-induced intestinal injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(10): 1544-15550.

图/表（结果） 5

2.1 骨髓间充质干细胞的形态学观察和免疫学表型鉴定接种48 h后，圆形细胞逐渐伸展成为纺锤形、短梭形、三角形，并以克隆集落方式散在分布(图1A)。在第1代时，细胞形态趋向均一，以梭形为主，细胞克隆呈束状、漩涡状或放射状，第2代时杂细胞进一步减少，间充质干细胞更为纯化(图1B)。

用流式细胞仪对第2代间充质干细胞的免疫表型进行检测，间充质干细胞表面抗原CD29、CD44阳性率分别为(99.17±1.36)%和(98.24±1.01)%；造血前体细胞表面标志抗原CD34以及白细胞表面标志抗原CD45阳性率分别为(2.79±0.24)%和(1.69±0.19)%(图2)。

2.2 间充质干细胞条件培养基对小肠黏膜分泌、吸收功能的影响将小肠标本置于Ussing小室，用电位钳的电流刺激能引起短暂的短回流电路变化，该电流变化反映了小肠浆膜和黏膜间Cl^-分泌的变化。

由图3A可见，辐射损伤后第3天，多个频率刺激后 (5，10，25 Hz)MSC-CM^IR治疗组的?I_sc值较辐射损伤组和MSC-CM^NOR组均明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)。

在辐射损伤后第7天，MSC-CM^IR的?I_sc值进一步改善，恢复至正常对照组水平(图3B)。

相似的，大鼠血清D-木糖水平在辐射损伤后显著下降，但输注MSC-CM^IR后其含量明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，并在第7天恢复至正常对照组水平(图3C)。

2.3 间充质干细胞条件培养基对辐射损伤小肠上皮结构的影响显微镜下可见小肠黏膜病变从照射后第1天开始出现，病变以照射后第3-5天最重。辐射损伤组小肠上皮细胞变性坏死脱落，绒毛缩短，隐窝深度变浅。而MSC-CM^IR组大鼠小肠黏膜的病理改变明显减轻(图4A)，从治疗后第3天起小肠上皮厚度显著优于MSC-CM^NOR组和单纯辐射组，差异有显著性意义(P < 0.05)，并在第5天接近正常对照组水平(图4B)；MSC-CM^NOR组较辐射损伤组有所改善，但效果并不明显，差异无显著性意义(P > 0.05)。

电镜中可观察到辐射损伤组小肠微绒毛缩短，紧密连接间隙增宽，细胞膜表面不平整。而MSC-CM^IR组细胞紧密连接间隙完整紧密，与MSC-CM^NOR组和单纯辐射组相比，细胞微结构得到明显改善(图4C)。

2.4 间充质干细胞条件培养基对辐射损伤大鼠生存率的影响 14 Gy电离辐射后大鼠表现为弓背、耸毛、活动明显减少等不良症状。

单纯照射组在第3天开始出现死亡，高峰期在第4-6天，2周存活率为30%，平均生存期(8.2± 1.1) d。MSC-CM^IR治疗组未观察到辐射损伤致死现象(图5)，虽然MSC-CM^NOR组与辐射损伤组比较，死亡出现时间推后，存活率升高，平均生存期延长，但二者差异无显著性意义(P > 0.05)。

参考文献

[1]Sémont A, Mouiseddine M, François A, et al. Mesenchymal stem cells improve small intestinal integrity through regulation of endogenous epithelial cell homeostasis. Cell Death Differ. 2010;17(6):952-961.
[2]Keating A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 2012;10(6):709-716.
[3]Marx J. Cancer research. Mutant stem cells may seed cancer. Science. 2003;301(5638):1308-1310.
[4]Menasché P. Stem cells for clinical use in cardiovascular medicine: current limitations and future perspectives. Thromb Haemost. 2005;94(4):697-701.
[5]Sell S. On the stem cell origin of cancer. Am J Pathol. 2010; 176(6):2584-2494.
[6]Khubutiya MS, Vagabov AV, Temnov AA, et al. Paracrine mechanisms of proliferative, anti-apoptotic and anti-inflammatory effects of mesenchymal stromal cells in models of acute organ injury. Cytotherapy. 2014;16(5): 579-585.
[7]van Poll D, Parekkadan B, Cho CH, et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology. 2008;47(5): 1634-1643.
[8]Gao Z, Zhang Q, Han Y, et al. Mesenchymal stromal cell-conditioned medium prevents radiation-induced small intestine injury in mice. Cytotherapy. 2012;14(3):267-273.
[9]Chang YH, Lin LM, Lou CW, et al. Bone marrow transplantation rescues intestinal mucosa after whole body radiation via paracrine mechanisms. Radiother Oncol. 2012; 105(3):371-377.
[10]da Silva AF, Silva K, Reis LA, et al. Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells and Their Conditioned Medium Attenuate Fibrosis in an Irreversible Model of Unilateral Ureteral Obstruction. Cell Transplant. 2015. [Epub ahead of print]
[11]Duijvestein M, Wildenberg ME, Welling MM, et al. Pretreatment with interferon-γ enhances the therapeutic activity of mesenchymal stromal cells in animal models of colitis. Stem Cells. 2011;29(10):1549-1558.
[12]Hou Y, Ryu CH, Jun JA, et al. IL-8 enhances the angiogenic potential of human bone marrow mesenchymal stem cells by increasing vascular endothelial growth factor. Cell Biol Int. 2014;38(9):1050-1059.
[13]Soleimani M, Nadri S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 2009;4(1):102-106.
[14]Ren G, Zhang L, Zhao X, et al. Mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression occurs via concerted action of chemokines and nitric oxide. Cell Stem Cell. 2008; 2(2):141-150.
[15]Gunn WG, Conley A, Deininger L, et al. A crosstalk between myeloma cells and marrow stromal cells stimulates production of DKK1 and interleukin-6: a potential role in the development of lytic bone disease and tumor progression in multiple myeloma. Stem Cells. 2006;24(4):986-991.
[16]Ko IK, Kim BG, Awadallah A, et al. Targeting improves MSC treatment of inflammatory bowel disease. Mol Ther. 2010; 18(7):1365-1372.
[17]Cui X, Chen J, Zacharek A, et al. Nitric oxide donor upregulation of stromal cell-derived factor-1/chemokine (CXC motif) receptor 4 enhances bone marrow stromal cell migration into ischemic brain after stroke. Stem Cells. 2007; 25(11):2777-2785.
[18]Xun CQ, Thompson JS, Jennings CD, et al. Effect of total body irradiation, busulfan-cyclophosphamide, or cyclophosphamide conditioning on inflammatory cytokine release and development of acute and chronic graft-versus-host disease in H-2-incompatible transplanted SCID mice. Blood. 1994;83(8):2360-2367.
[19]Hill GR, Crawford JM, Cooke KR, et al. Total body irradiation and acute graft-versus-host disease: the role of gastrointestinal damage and inflammatory cytokines. Blood. 1997;90(8):3204-3213.
[20]Gonzalez-Rey E, Anderson P, González MA, et al. Human adult stem cells derived from adipose tissue protect against experimental colitis and sepsis. Gut. 2009;58(7):929-939.
[21]Polchert D, Sobinsky J, Douglas G, et al. IFN-gamma activation of mesenchymal stem cells for treatment and prevention of graft versus host disease. Eur J Immunol. 2008; 38(6):1745-1755.

引言

材料方法

设计：细胞学体内观察实验。

时间及地点：实验于2011年3月至2012年9月在中山大学北校区动物实验中心、中山大学孙逸仙纪念医院中心实验室及广东省人民医院(广东省医学科学院)中心实验室完成。

材料：

实验动物：雌性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠83只(6-8周龄，平均体质量约250 g，SPF级)用于建立辐射小肠损伤模型；雌性SD幼鼠10只(三四周龄，体质量60-80 g，SPF级)用于获取骨髓间充质干细胞，均由中山大学北校区实验中心提供。所有动物经检疫符合实验动物标准。

细胞株：大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6，购于American Type Culture Collection (ATCC)。辐射损伤的IEC-6用于诱导间充质干细胞，模拟间充质干细胞在小肠辐射炎症环境下的诱导激活。

主要试剂与材料：DMEM-F12培养基、胎牛血清(美国Hycolne公司)；TrypLE^Express胰酶替代物(美国Invitrogen公司)；小鼠抗大鼠CD29-FITC，CD34-FITC，CD44-FITC，CD45-FITC和CD90-FITC单克隆抗体(美国Biolegend公司)；5 ku离心超滤管(Millipore公司)；D-木糖试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20100801)。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的原代培养和鉴定：①原代分离：雌性SD幼鼠颈椎脱臼处死，完整提取双侧胫骨、股骨，无菌条件下暴露骨髓腔。用5 mL注射器反复冲洗骨髓腔内细胞，再用含体积分数为10%胎牛血清的完全培养基重新悬浮细胞收集于25 cm²培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、湿度90%的细胞培养箱内培养，此细胞记为原代。②原代培养：在文献[13]基础上加以改良，以改良的频繁换液法纯化骨髓间充质干细胞，4 h后首次全量更换培养液，随后3 d内每8 h全量更换1次。至原代的克隆集落长至约70%融合时(约3 d)，用性质温和的TrypLE^Express胰酶替代物常温消化，避免胰酶-EDTA对原代骨髓间充质干细胞的消化损伤。收集原代分离后剩余的大鼠股骨和胫腓骨，钳碎后加入含体积分数为10%胎牛血清的完全培养基细胞培养箱孵育3 d，使用0.22 μm滤器过滤，此为原代和第1代细胞培养基，目的在于避免频繁换液造成骨髓间充质干细胞生长微环境破坏，以碎骨中丰富细胞因子模拟骨髓间充质干细胞生长微环境。原代细胞1︰1传代，37 ℃，体积分数为5%CO₂细胞培养箱继续培养，此为第1代。第2代以后细胞1︰3传代，随后使用常规含体积分数为10%胎牛血清的培养基继续培养。③免疫表型鉴定：待骨髓间充质干细胞生长至第2代时，取部分细胞悬液与CD29，CD34，CD45，CD90单抗充分混匀，室温避光孵育20 min，上流式细胞仪做细胞表型鉴定。

骨髓间充质干细胞条件培养基的制备：①辐射炎症激活状态间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^IR)制备：辐射损伤的IEC-6用于诱导间充质干细胞，模拟间充质干细胞在小肠辐射炎症环境下的诱导激活。IEC-6细胞以3×10⁴的密度种植于6孔Transwell板(0.4 μm；Costar，Cambridge，MA)上室，加入体积分数为10%胎牛血清的DMEM培育；第2代的骨髓间充质干细胞以5×10⁴的密度接种于6孔Transwell板下室，加入体积分数为10%胎牛血清DMEM-F12培育，在辐射之前上室和下室分开培养。待细胞融合度达到70%-80%后，取上室的IEC-6细胞用PRIMUS^®H直线加速器(X射线)以300 cGy/min的速率一次性照射，总剂量为10 Gy。辐射后上下室细胞共培养，弃去原来含血清的培养液，无血清DMEM-F12共培养24 h，随后将上室的IEC-6细胞移走，下室的骨髓间充质干细胞再次更换2 mL新鲜的无血清培养基培养48 h后收集该培养液，用5 ku离心超滤管3 000 r/min离心20 min；培养基浓缩约50倍，0.22 μm滤器过滤灭菌，此为辐射炎症激活状态间充质干细胞条件培养基，-20 ℃冷冻保存备用。②正常对照间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^NOR)制备：步骤同上，但不与辐射损伤IEC-6交互激活，共培养对象为正常IEC-6细胞，无血清DMEM-F12培养基孵育48 h后收集培养液，超滤后收集储存。

辐射损伤模型建立：大鼠麻醉后除腹部外均用铅砖覆盖屏蔽，采用PRIMUS^® H直线加速器(X射线)以300 cGy/min的速率一次性照射，总剂量14.0 Gy进行腹部局部照射。随机将83只大鼠分为4组，正常对照组20只、辐射损伤组20只、MSC-CM^NOR治疗组23只和MSC-CM^IR治疗组20只。

小肠辐射损伤大鼠的治疗：造模后4 h内，各模型组大鼠采用尾静脉注射+植入式胶囊渗透压泵(Alzet microosmotic pumps，model 2ML1；DURECT Corp)腹腔植入的方式分别输注DMEM-F12、MSC-CM^NOR和MSC-CM^IR，每只大鼠每天尾静脉一次性注射200 μL，连续注射3 d，胶囊泵内含2 mL浓缩条件培养基，植入腹腔后以10 μL/h的速率匀速释放。

标本的留取：每组取10只大鼠，分别于造模后第1，3，5，7，14天处死后取材，开腹，将屈氏韧带以下的小肠段分为4份2.5 cm肠段，用PBS将肠腔冲洗干净，第1份投入液氮罐保存用于Real time-PCR检测小肠上皮干细胞标记物Lgr5及Bmi1(研究进展中)；第2份用于Western Blots检测小肠上皮干细胞标记物Lgr5及Bmi1(研究进展中)；第3份用40 g/L多聚甲醛固定，行苏木精-伊红染色常规病理检查和免疫组化检测；第4份用于制作标本行电镜观察超微结构改变以及用于检测短回路电流观察小肠分泌功能变化。上述各组大鼠于造模后第1，3，7天经内眦取血检测血清木糖水平。剩余每组约10只大鼠治疗后密切观察生存状态，记录死亡时间，进行生存分析。

小肠黏膜分泌功能测定：采用恒温灌流装置体外测定小肠分泌功能，将肠段置于Ussing小室中进行电生理测定。黏膜标本垂直方向置于左、右两半小室的开口处，顶膜朝右，基膜朝左。加入充氧的Kreb缓冲液，实验参数：体积分数为95%O₂，体积分数为5%CO₂，pH 7.4，37 ℃。用连接于电位钳放大器的参考电极测量黏膜电位差，应用外来电流和液体电阻补偿使黏膜电位差被持续的钳在零电位，测得的跨上皮电流为短回路电流的变化(Short circuit variation, ?I_sc)。通过检测?I_sc评价小肠黏膜的分泌功能。

小肠黏膜吸收功能测定：采用木糖吸收实验检测小肠吸收功能。用去离子水将D-木糖溶解至50 g/L，按每只大鼠0.5 g/kg的剂量灌胃，2 h后取血，按照D-木糖测定试剂盒说明书测定各组大鼠血清木糖含量。

小肠黏膜形态学评估：①苏木精-伊红染色评估组织学改变：小肠组织石蜡切片常规脱蜡入水，苏木精染色5 min，返蓝30 min，伊红复染10 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，随后光镜观察，并测量小肠黏膜厚度。②透射电镜评估超微结构改变：标本投入4 ℃的3%戊二醛-15 g/L多聚甲醛-0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，用1%锇酸 4 ℃固定1.5 h。乙醇、丙酮脱水，环氧树脂618包埋。超薄切片90 mm，醋酸铀、枸橼酸铅各浅染1 min后，透射电镜观察紧密连接情况。

大鼠生存分析：治疗后每组约取10只密切观察大鼠生存状态，记录辐照后14 d内各组大鼠的存活情况，并用 Kaplan-Meier生存曲线作图。

主要观察指标：①骨髓间充质干细胞形态学和免疫学表型鉴定。②间充质干细胞条件培养基对辐射损伤小肠黏膜分泌、吸收功能的影响。③间充质干细胞条件培养基对辐射损伤小肠黏膜形态结构的影响。④间充质干细胞条件培养基对辐射损伤大鼠生存率的影响。

统计学分析：计量资料以x(_)±s表示，均数的比较正态分布者组间比较用方差分析与t 检验，非正态分布者用秩和检验；生存分析采用Kaplan-Meier检验。采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

全文链接：

讨论

3.1 间充质干细胞条件培养基是替代间充质干细胞移植的可行手段干细胞移植是目前治疗组织损伤最具前景的治疗手段。然而，随着研究的深入，越来越多的问题被发现，制约着干细胞移植的临床应用。虽然目前还没有明确的直接证据报道，但是已有报道发现正常培养的间充质干细胞有能力转化为兼具干细胞和癌症干细胞特性的细胞^[3^，^5]，表明移植入体的干细胞具有成瘤癌变的危险。

其次，移植入体的干细胞植入率低^[4]，进一步分化成特定功能的细胞不仅比例更低，而且需要足够长的时间，对急性损伤治疗早期主要依靠少部分在损伤部位存活的干细胞所分泌的旁分泌因子或膜微泡(Microvesicles)。与之相比，富含旁分泌因子和膜微泡的干细胞条件培养基无疑是替代干细胞移植的一种可行手段。

间充质干细胞条件培养基可以从已经建立的细胞株中获取，作为一种现成的治疗药物提前大量的制备，能够快速起效，有效成分更高，且没有干细胞移植中常见的植入率分化率低、成瘤癌变、血管栓塞等问题。在大量的实验室研究中，也已证明其具有间充质干细胞相似的生物学特性，如促进细胞增殖、血管生成，抑制细胞凋亡、炎症反应、组织纤维化等^[8-11]。

3.2 不同状态间充质干细胞条件培养基对小肠修复作用差异的原因既往研究表明间充质干细胞是一种可塑性很强的多潜能干细胞，在诸如炎症因子、缺氧或者受损细胞的诱导激活下^[11^，^14-15]，能增强其多种生物学潜能。比如，目前已有报道多种炎症因子具有增强间充质干细胞旁分泌活性(肿瘤坏死因子α、γ-干扰素、白细胞介素8)、免疫学活性(肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、γ-干扰素、白细胞介素1α)和迁徙活性(白细胞介素1β、一氧化氮、血管细胞黏附分子1)的能力^[11-17]。

既往研究表明辐射炎症环境富含肿瘤坏死因子α、白细胞介素1α、白细胞介素1β和白细胞介素6等多种前炎因子^[18-19]，在本部分实验中，将骨髓间充质干细胞置于辐射炎症环境中预激活，促进其旁分泌因子的释放，并将激活前后收集的间充质干细胞条件培养基对辐射小肠损伤的作用进行了比较。研究的结果表明炎症激活状态的间充质干细胞条件培养基能够显著改善辐射损伤大鼠的小肠功能结构和生存状态，而正常培养的间充质干细胞条件培养基未能观察到明显的修复作用，这种不同的小肠修复作用很可能是由于骨髓间充质干细胞激活前后不同的旁分泌谱所形成的。

3.3 炎症预激活对间充质干细胞条件培养基治疗作用的重要性虽然不少干细胞移植实验在移植前没有进行间充质干细胞预激活，但移植入体的间充质干细胞能够在体内受到炎症因子的激活。最近已经有报道在疾病发生前移植间充质干细胞^[20-21]，由于体内缺乏炎症因子，无法激活间充质干细胞，导致间充质干细胞的免疫活性和迁徙能力不足，无法有效修复损伤肠黏膜。与间充质干细胞移植相比，间充质干细胞条件培养基缺乏体内激活的程序，因此，炎症激活前后间充质干细胞条件培养基对小肠修复的显著差异，无疑表明体外炎症预激活对于间充质干细胞条件培养基的应用具有重要的作用。总之，炎症激活状态的间充质干细胞条件培养基能够显著改善辐射损伤大鼠的小肠功能结构和生存状态。本研究为间充质干细胞条件培养基在小肠黏膜损伤的临床应用奠定了基础，进一步的研究将集中在以下4个方面：①明确炎症激活状态的间充质干细胞条件培养基修复小肠损伤的主要活性成分，是旁分泌因子还是膜微泡？②辐射炎症环境激活骨髓间充质干细胞旁分泌或膜微泡的具体炎症因子和信号通路。③辐射炎症激活前后间充质干细胞条件培养基所含旁分泌谱或所含膜微泡中MicroRNA谱的差异和关键旁分泌因子或关键MicroRNA鉴定。④间充质干细胞条件培养基治疗小肠损伤的分子细胞机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

文章快阅

延伸阅读

目前对间充质干细胞条件培养基的研究尚处于由实验室向临床应用转化的过渡期，制约间充质干细胞条件培养基临床应用的瓶颈主要包括以下几点：①常规制备的间充质干细胞条件培养基的旁分泌因子含量偏低，容易影响治疗的效果。利用炎症因子增强间充质干细胞旁分泌、迁徙和免疫活性等潜能，是解决办法之一，本文研究也表明炎症因子的预刺激在间充质干细胞条件培养基的组织修复作用中起着关键作用。②旁分泌因子成分复杂，既含有有益成分，也含有有害成分；对间充质干细胞条件培养基芯片筛查也发现包括肿瘤坏死因子α在内的多个能抑制小肠损伤修复的因子在间充质干细胞条件培养基中含量丰富；寻找含量丰富的有害因子并将其敲除或中和，无疑能增强间充质干细胞条件培养基的治疗作用。③条件培养基中的基础培养基含有酚红、HEPS等不适宜人体应用的成分；最近有报道称，由维生素、氨基酸等成分组成的复合剂能替代基础培养基，不影响间充质干细胞的生长和分泌，如果属实，这一发现无疑将极大的推动间充质干细胞条件培养基的临床应用。④间充质干细胞条件培养基在体内作用时间短，不能像移植入体的间充质干细胞一样持续分泌旁分泌物质。目前的研究表明，可以借助生物材料，例如纳米纤维水凝胶等，来延长间充质干细胞条件培养基的作用时间和稳定性。⑤近年研究表明，间充质干细胞条件培养基不仅存在分子量较低的旁分泌因子，还存在分子量较高的膜微泡（Microvescles），包括直径不等的膜微粒（Microparticles）和外泌体（Exosomes），其内含有多种蛋白质、酶类、mRNA和miRNA成分，能够通过融合、直接释放、胞吞或与受体靶细胞表面配体结合等方式进行定向的多靶点的投递，调控目的细胞的损伤修复和表观遗传学改变，同时由于其具有脂质膜结构，可以避免投递过程中内容物的快速降解，不失为干细胞移植的良好替代手段，但是其在小肠损伤中的作用机制以及与肿瘤生长的关系仍待进一步阐明。

全文链接：

炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基修复小肠黏膜急性辐射损伤

Effects of bone marrow mesenchymal stem cell conditioned medium with and without inflammatory activation on radiation-induced intestinal injury

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 5

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.