骨形态发生蛋白7腺病毒基因转染对骨髓基质干细胞生物学功能的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.004

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (6): 837-842.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.004

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骨形态发生蛋白7腺病毒基因转染对骨髓基质干细胞生物学功能的影响

蒲志超，谢伟勇，王延斌，薛剑，张兴世

武警广东省总队医院番禺分院，广东省广州市 511430

收稿日期:2015-01-09 出版日期:2015-02-05 发布日期:2015-02-05
通讯作者: 谢伟勇，副主任医师，武警广东省总队医院番禺分院，广东省广州市 511430
作者简介:蒲志超，男，1970年生，甘肃省天水市人，副主任医师，主要从事脊柱脊髓损伤方面的研究。
基金资助:
2012年广东省医学科研基金项目(A2012456)

Effect of bone morphogenetic protein 7 adenovirus transfection on biological function of bone marrow stromal stem cells

Pu Zhi-chao, Xie Wei-yong, Wang Yan-bin, Xue Jian, Zhang Xing-shi

Panyu Branch, Guangdong Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Guangzhou 511430, Guangdong Province, China

Received:2015-01-09 Online:2015-02-05 Published:2015-02-05
Contact: Xie Wei-yong, Associate chief physician, Panyu Branch, Guangdong Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Guangzhou 511430, Guangdong Province, China
About author:Pu Zhi-chao, Associate chief physician, Panyu Branch, Guangdong Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Guangzhou 511430, Guangdong Province, China
Supported by:
the Medical Science Research Foundation of Guangdong Province in 2012, No. A2012456

摘要/Abstract

摘要：

背景：基因转染技术正积极地应用于组织再生治疗之中，研究表明骨形态发生蛋白7具有骨诱导特性，可以有效促进成骨细胞的发育以及新骨的形成。
目的：探讨骨形态发生蛋白7腺病毒基因转染对骨髓基质干细胞生物学功能的影响。
方法：分离、培养羊骨髓基质干细胞，利用重组骨形态发生蛋白7腺病毒(adenovirus bone morphogenetic protein 7，Adeno-BMP7)对第2代骨髓基质干细胞进行基因转染，透射电镜观察转染后细胞超微结构。流式细胞仪检测转染后的细胞周期，Western blot检测骨形态发生蛋白7的表达，Von Kossa染色观察钙结节形态情况。取转染后第3天及相应未转染的骨髓基质干细胞制备珊瑚-细胞复合物，于裸鼠脊柱两侧背部皮下注射4周和8周后进行大体观察和组织学检测。
结果与结论：体外细胞超微结构观察可见Adeno-BMP7基因转染骨髓基质干细胞存在活跃的物质合成代谢；流式细胞仪检测发现转染不会对骨髓基质干细胞的细胞周期产生明显影响；Western blot检测转染后的骨髓基质干细胞存在骨形态发生蛋白7蛋白的表达；Von Kossa染色可见转染Adeno-BMP7后的骨髓基质干细胞形成较大的钙结节。经裸鼠皮下回植实验发现，Adeno-BMP7转染后骨髓基质干细胞的成骨能力和成骨质量明显提高。以上结果表明经Adeno-BMP7转染可以有效促进骨髓基质干细胞成骨分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨形态发生蛋白7腺病毒基因, 转染, 骨髓基质干细胞, 生物学功能, 细胞周期, 钙结节, 成骨分化, 超微结构

Abstract:

BACKGROUND: Gene transfer techniques have been actively used in tissue regeneration therapy. Bone morphogenetic protein 7 with osteoinductive properties can effectively promote osteoblast growth and new bone formation.
OBJECTIVE: To explore the influence of bone morphogenetic protein 7 adenovirus gene transfection on the biological function of bone marrow stromal stem cells.
METHODS: Goat bone marrow stromal stem cells were isolated, cultured and transfected by recombinant adenovirus containing bone morphogenetic protein 7 (Adeno-BMP7). Cell ultrastructure was observed by transmission electronic microscope, cell cycle was detected by flow cytometry, expression of bone morphogenetic protein 7 was measure by western blot assay, and Von Kossa staining was used to observe the formation of calcium nodules. Bone marrow stromal stem cells transfected for 3 days and untransfected were used to prepare coral-cell complexes that were injected subcutaneously into the back of nude mice for 4 weeks and 8 weeks, followed by gross observation and histological examination.
RESULTS AND CONCLUSION: Adeno-BMP7-transfected bone marrow stromal stem cells appeared to have active substance synthesis and metabolism. Adeno-BMP7 transfection played no effect on the cell cycle of bone marrow stromal stem cells. Bone morphogenetic protein 7 was expressed in the transfected bone marrow stromal stem cells. Larger calcium nodules were visible after Adeno-BMP7 transfection. Adeno-BMP7-transfected bone marrow stromal stem cells showed stronger osteogenic capability and higher bone quality. These results demonstrate that Adeno-BMP7 transfection can effectively promote the osteogenic differentiation of bone marrow stromal stem cells.

全文链接：

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Bone Morphogenetic Protein 7, Genes

中图分类号:

R394.2

蒲志超，谢伟勇，王延斌，薛剑，张兴世. 骨形态发生蛋白7腺病毒基因转染对骨髓基质干细胞生物学功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(6): 837-842.

Pu Zhi-chao, Xie Wei-yong, Wang Yan-bin, Xue Jian, Zhang Xing-shi. Effect of bone morphogenetic protein 7 adenovirus transfection on biological function of bone marrow stromal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(6): 837-842.

图/表（结果） 2

2.1 Adeno-BMP7基因转染后骨髓基质干细胞超微结构透射电镜观察Adeno-BMP7基因转染后的骨髓基质干细胞，粗面内质网数量增加显著，细胞核常染色质丰富，且可观察到清晰的核仁。

未转染的骨髓基质干细胞胞浆内也存在丰富细胞器，但较之经过转染的骨髓基质干细胞，高尔基复合体以及粗面内质网数量明显偏少。

2.2 Adeno-BMP7基因转染对骨髓基质干细胞的细胞周期的影响经流式细胞仪检测，由图1可以看出，在经过Adeno-BMP7基因转染之后，处于G₀-G₁期骨髓基质干细胞的比例为(57.45±7.42)%，而未转染的骨髓基质干细胞为(62.36±18.97)%。转染后骨髓基质干细胞的增殖指数为(42.55±7.42)%，未转染的骨髓基质干细胞为(37.64± 18.97)%，经比较差异无显著性意义(P > 0.05)，可见转染不会对骨髓基质干细胞的细胞周期产生明显影响。

2.3 Western blot检测 Western blot检测转染后的骨髓基质干细胞存在骨形态发生蛋白7表达，见图2。

2.4 Von Kossa染色 Von Kossa染色可见转染Adeno- BMP7后的骨髓基质干细胞可形成较大的钙结节，见图3。

2.5 珊瑚-细胞复合物皮下成骨骨髓基质干细胞植入4，8周时观察皮下回植物外观，转染组和未转染组的8只裸鼠比较未发现变相的区别，体积也未出现明显变小现象。分别对裸鼠进行X射线检查，可以观察到裸鼠脊柱两侧出现高密度影，但不同时间点比较未发现明显差异(图4)。

苏木精-伊红染色：4周时，可见转染组的珊瑚空隙中有大量的编织骨以及有序排列的成骨细胞，在珊瑚表面出现新生成熟骨，但数量较少；未转染组的珊瑚空隙中大量的核深染的细胞排列无序，充满类骨质，少量新生的编织骨较幼稚，没有成熟骨形成(图5A，B)。

8周时，可见转染组空隙中有间充质细胞，珊瑚表面形成数量较多的成熟骨；未转染组空隙中有呈网状分布的少量细胞，珊瑚表面有成熟骨形成，但数量较之转染组明显偏少(图5C，D)。

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引言

材料方法

设计：体外细胞培养、动物实验。

时间及地点：实验于2012年9月至2014年7月在南方医科大学实验中心完成。

材料：

实验动物：成年山羊，体质量19.5-22.5 kg，平均 21.3 kg，雌雄随机；雄性裸鼠8只，六七周龄，体质量 18-29 g。实验动物均由南方医科大学动物实验中心提供，饲养严格遵守SPF级标准要求，合格证号为SCXK(粤) 2007-0010。

骨形态发生蛋白7腺病毒基因转染骨髓基质干细胞的生物学功能检测所用主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
One•Step RT-PCR试剂盒	北京百泰克生物技术有限公司
PBS	上海双螺旋生物科技有限公司
DMEM培养基	上海卡迈舒(Kmaels)科技实业有限公司
透射电镜	上海釜诚生物科技有限公司
培养箱	上海旦鼎国际贸易有限公司
兔抗人骨形态发生蛋白7一抗	上海瑞齐生物技术有限公司
生物素化二抗(Vector)、	上海研盟生物科技有限公司

透射电镜观察Adeno-BMP7基因转染后细胞超微结构：取出相应转染及未转染骨髓基质干细胞，PBS洗涤2次，之后分别利用2%戊二醛PBS固定液和1%锇酸PBS固定液予以2 h固定，固定结束之后均用PBS洗涤2次。然后用乙醇进行脱水，环氧乙烷洗涤2次。洗涤结束后，将618包埋液与环氧丙烷进行1︰1混合，予以2 h浸透，浸透结束后将618包埋液与环氧丙烷进行2︰1混合，再次过夜浸透。浸透完毕利用纯618包埋液进行6 h浸透，并置于烘箱内，在60 ℃条件下进行48 h的烘烤。烘烤结束进行切片，枸橼酸铅染色液染色，透射电镜观察细胞超微结构。

流式细胞仪检测细胞周期：转染后第3天，将骨髓基质干细胞装入10个离心管，用PBS对每管细胞洗涤2次。洗涤结束加入1 mL柠檬酸缓冲液，1 h后用PBS调整细胞浓度。取20 mL，离心后弃去上清液，加入胰酶消化液。作用完毕之后加胰酶抑制酶液，等待数分钟，加入碘化丙啶等待15 min，过滤，上机检测细胞周期。

Western blot检测骨形态发生蛋白7的表达情况：取转染和未转染的骨髓基质干细胞，加入裂解液进行处理，使之充分裂解。将上样液和裂解产物进行充分混合后电泳。电泳结束后利用蛋白条带转膜至硝酸纤维素膜，置于封闭液中过夜。次日，分别加入兔抗人骨形态发生蛋白7一抗和生物素化二抗，充分反应后加入DAB显色底物。

钙结节染色：取转染后2，3周和相应未转染干细胞培养皿，用PBS洗涤2次，并利用2%戊二醛PBS进行固定。PBS洗涤2次之后自然晾干，加入2%硝酸银溶液5 mL。置于紫外线下进行照射，照射10 min后利用三蒸水进行冲洗，并加入5%硫代硫酸钠水溶液进行浸染。浸染2 min之后水洗，显微镜观察。

珊瑚-细胞复合物的制备方法：取转染后第3天以及相应的未转染骨髓基质干细胞，处理后得到细胞悬液，利用注射器将其滴入到珊瑚，充分浸匀之后静置于体积分数为5%CO₂，37 ℃孵育箱中，孵育4 h后加入DMEM条件培养基进行培养。

动物体内实验：上述珊瑚-细胞复合物孵育5 d后，分别于裸鼠脊柱两侧背部皮下注射，右侧为转染后骨髓基质干细胞，左侧为未转染骨髓基质干细胞。皮下回植后4周和8周，观察小鼠的大体外观，并行脊柱正位X射线检查，以及苏木精-伊红染色组织学检查结果。

主要观察指标：①透射电镜观察转染后的骨髓基质干细胞的超微结构。②转染后骨髓基质干细胞的细胞周期变化。③转染后骨髓基质干细胞植入裸鼠皮下之后大体观察和组织学检查。

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讨论

在骨组织工程研究过程中，种子细胞来源一直是一个十分重要的研究课题。以往，成肌细胞和成纤维细胞是主要的骨外组织来源，可以得到具有成骨潜能的细胞。二者来源广泛，取材容易，且具有较强的体外传代扩增能力^[8-9]。关于二者的成骨机制和性能目前尚不完全明确，有待进一步分析研究^[10-11]。但是，在取材和来源等方面则受到一定的限制，最终获得的细胞数量相对较少，且容易出现老化。而骨髓基质干细胞具有多向分化潜能，具备以下4个特征：第一，骨髓基质干细胞具有成骨潜能，在诱导条件下可使其向成骨细胞系分化，表现出成骨潜能^[12-14]；第二，骨髓基质干细胞来源广泛，取材方便，对机体损伤小；第三，骨髓基质干细胞易于分离培养，并且在体外增殖快，研究表明，骨髓基质干细胞在体外连续培养20-30个细胞周期后仍可保持较强的增殖能力；第四，骨髓基质干细胞经连续传代仍具有稳定的成骨潜能^[15-17]。因此，在进行体外培养过程中，骨髓基质干细胞在传代繁殖方面可以显示出较为明显的优势，并具备十分明确的成骨性能。而且，获取骨髓基质干细胞的操作较为简单快捷，可以避免对机体造成过大的损伤。因此，利用骨髓基质干细胞进行体外培养是一种较为理想的获得种子细胞的方式^[18-21]。

目前，体外培养骨髓基质干细胞方法已得到广泛的应用。但是，采用体外培养骨髓基质干细胞的方式会导致各种细胞的混杂，例如成脂细胞和成软骨细胞，以及成骨细胞和成纤维细胞等^[22-26]。对于骨髓基质干细胞成骨定向诱导分化的最佳条件，目前尚无确定的结论。而关于各种诱导物的详尽作用机制，例如骨形态发生蛋白和维生素D、维生素C以及糖皮质激素等的研究还相对较少。

骨形态发生蛋白是一种诱导成骨细胞分化的生长因子，骨形态发生蛋白7与骨形态发生蛋白家族中的其他成员一样，它在间充质干细胞向骨和软骨的转化中起了关键作用^[27-29]。骨形态发生蛋白7可以促进骨髓基质干细胞成骨定向诱导分化，国外一些学者即通过研究发现，在不同的动物体内植入骨形态发生蛋白7复合支架材料，均能够获得相应的新骨，且新骨具有良好的力学和生化特点^[30-32]。随着基因技术的发展，基因转移技术的应用进一步推动了骨形态发生蛋白7的应用发展^[33-35]。利用基因转移技术将骨形态发生蛋白7基因转移到相关的细胞之中，然后移植到需要进行骨再生的局部位置，可以通过释放大量的骨形态发生蛋白7，有效提高局部骨形态发生蛋白7的浓度，达到促进骨再生的目的，而腺病毒载体是最适合用来转移骨形态发生蛋白7基因^[36-38]。本次研究结果显示，基因转染之后，骨髓基质干细胞在细胞代谢功能和物质合成以及形成钙结节的能力等方面均得到了显著的增强。而且，细胞内的高尔基体数量显著增加，粗面内质网数量也随之明显上升，还可以观察到较高水平的骨形态发生蛋白7蛋白表达现象。而进行体内成骨分析也可以发现，修饰之后的骨髓基质干细胞的成骨能力等均出现显著的增加。即表明，通过Adeno-BMP7转染可以有力推进骨髓基质干细胞的成骨定向分化进程。较之转染前，转染后骨髓基质干细胞在增殖指数方面并没有出现明显的差异，说明转染Adeno-BMP7可以有效促进骨髓基质干细胞的成骨定向分化，并不会对其原本的增殖能力产生较大的影响。另外，在以往的一些研究中，有学者通过研究发现，经地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠对骨形态发生蛋白7的成骨定向诱导^[39]，可以有效促进骨髓基质干细胞多方面合成功能的增强，包括骨桥蛋白合成、磷酸酶合成以及骨钙蛋白合成等，并向成骨细胞分化。而且，肌袋内血供丰富，为骨生长提供了良好的生长环境。较之Adeno-BMP7转染后，成骨诱导后骨髓基质干细胞中成骨细胞含量相对偏低。将珊瑚与未经修饰的骨髓基质干细胞进行体外复合培养，可以使骨髓基质干细胞在珊瑚表面实现贴附和生长^[40]。骨形态发生蛋白7还可以产生诱导作用，作用于成纤维细胞等，促进其向成骨细胞分化，以促进形成新骨。

综上所述，在经过Adeno-BMP7转染之后，可以达到有效促进骨髓基质干细胞成骨分化的效果，在组织工程化骨构建中，转染Adeno-BMF7的骨髓基质干细胞增加了成骨质量。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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