小脑颗粒神经元细胞凋亡中caspase-8基因变化与二乙酰吗啡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.02.010

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (2): 213-219.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.02.010

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小脑颗粒神经元细胞凋亡中caspase-8基因变化与二乙酰吗啡的影响

苏丽萍¹，刘小山²，王雪梅³，陈晓¹，张丽萍¹，蒲红伟⁴，王治国⁵，王华¹，李凯超⁶

1新疆医科大学基础学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；2广州中山大学医学院，法医学系，广东省广州市 510080；3新疆医科大学第一附属医院临床研究院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；4新疆医科大学第一附属医院科教中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；5新疆维吾尔自治区司法鉴定科学技术研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830002；6新疆维吾尔自治区阿勒泰地区哈巴河县公安局法医室，新疆维吾尔自治区哈巴河县 836700

收稿日期:2014-11-07 出版日期:2015-01-08 发布日期:2015-01-08
通讯作者: 蒲红伟，在读博士，副教授，新疆医科大学第一附属医院科教中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011
作者简介:苏丽萍，女，四川省南充市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事毒理方向研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81260464)；新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(青年科学基金项目) (2011211B20)

Effects of diacetylmorphine on caspase-8 gene in apoptosis of cerebellar granule neurons

Su Li-ping_¹, Liu Xiao-shan², Wang Xue-mei³, Chen Xiao¹, Zhang Li-ping¹, Pu Hong-wei⁴, Wang Zhi-guo⁵, Wang Hua¹, Li Kai-chao⁶

1College of Basic Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Department of Forensic Medicine, Medical School of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China; 3Clinical Research Institute, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 4Center of Science and Education, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 5Institute of Forensic Science of the Xinjiang Uygur Autonomous Region Bureau of Justice, Urumqi 830002, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 6Forensic Room, the Public Security Bureau of Habahe County, Altay Prefecture of the Xinjiang Uygur Autonomous Region, Habahe 836700, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2014-11-07 Online:2015-01-08 Published:2015-01-08
Contact: Pu Hong-wei, Studying for doctorate, Associate professor, Center of Science and Education, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Su Li-ping, Studying for master’s degree, College of Basic Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81260464; the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2011211B20

摘要/Abstract

摘要：

背景：半胱-天冬氨酸蛋白酶8(Caspase-8)是细胞凋亡过程起始的重要因子，二乙酰吗啡可致神经元细胞凋亡，其与二乙酰吗啡致小脑颗粒神经元细胞凋亡之间关系尚未见报道。
目的：验证二乙酰吗啡诱导小脑颗粒神经元细胞凋亡与caspase-8基因表达情况，明确caspase-8参与二乙酰吗啡致神经元凋亡过程。
方法：取出生7 d SD大鼠小脑颗粒神经元细胞进行体外培养，第7天后，以不同质量浓度的二乙酰吗啡(10，40，80，100，120 mg/L)和C-jun氨基末端激酶通路特异性抑制剂SP600125作用小脑颗粒神经元细胞24 h，并分对照组(0 mg/L二乙酰吗啡)，80 mg/L二乙酰吗啡组，二乙酰吗啡+SP 600125组；采用Hoechst 33258 荧光染色观察细胞形态学改变，流式细胞仪测细胞凋亡率，免疫荧光、RT-PCR及Western Blotting检测caspase-8 mRNA和蛋白表达情况。
结果与结论：①施加不同质量浓度二乙酰吗啡致神经元细胞凋亡，凋亡细胞出现透亮深蓝色的凋亡小体，细胞核呈现固缩、凝聚及断裂，随给药浓度增加细胞凋亡率呈现升高趋势(P < 0.05)。②与对照组相比，在80 mg/L二乙酰吗啡干预时caspase-8 mRNA和蛋白表达明显明显表达(P < 0.05)；caspase-8 mRNA随给药浓度增加呈现升高趋势(P < 0.05)，二乙酰吗啡+SP600125组中caspase-8 mRNA和蛋白较80 mg/L二乙酰吗啡组明显下调(P < 0.05)。结果提示caspase-8参与二乙酰吗啡致小脑颗粒神经元细胞凋亡过程，同时也是C-jun氨基末端激酶信号通路中的重要候选促凋亡因子。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 二乙酰吗啡, 小脑颗粒神经元, 凋亡, 半胱天冬氨酸蛋白酶8(caspase-8), HSLE, JNK, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Caspase-8 plays an important role in starting the process of cell apoptosis, and diacetylmorphine can induce neuronal apoptosis. The relationship between the apoptosis of cerebellar granule neurons cells induced by diacetylmorphine and caspase-8 has not been reported.
OBJECTIVE: To investigate the effect of caspase-8 on diacetylmorphine-induced neuronal apoptosis.
METHODS: Cerebellar granule neurons from Sprague-Dawley rats aged 7 days were cultured in vitro. At 7 days, the cells were cultured with different dosage of diacetylmorphine (10, 40, 80, 100, 120 mg/L) and SP600125 for 24 hours, and were divided into control group, 80 mg/L diacetylmorphine group, diacetylmorphine+SP600125 group. Cell morphology was observed by Hoechst 33258 fluorescent staining, and cell apoptosis rate was measured by flow cytometry. Immunofluorescence staining, RT-PCR and western blot assay were used to detect caspase-8 mRNA and protein expression.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After different dosage of diacetylmorphine was used to induce neuronal apoptosis, dark blue translucent apoptotic bodies were found in apoptotic cells, appearing with nucleus condensation, cohesion and fracture, and the apoptosis rate presented an increasing trend with increasing of drug dosage (P < 0.05). (2) Compared with the control group, caspase-8 mRNA and protein expression was remarkable under the intervention of 80 mg/L diacetylmorphine (P < 0.05); caspase-8 mRNA expression exhibited an increasing trend with increasing dosage of diacetylmorphine (P < 0.05), while caspase-8 mRNA and protein expression in the diacetylmorphine+SP600125 group was significantly lower than that in the 80 mg/L diacetylmorphine group (P < 0.05). These findings indicate that caspase-8 is involved in the process of diacetylmorphine-induced neuronal apoptosis, and meanwhile, it is also an important candidate of pro-apoptotic factors in the c-jun N-terminal kinase signaling pathway.

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Key words: Heroin, Neurons, Apoptosis, Caspase 8

中图分类号:

R318

苏丽萍，刘小山，王雪梅，陈晓，张丽萍，蒲红伟，王治国，王华，李凯超. 小脑颗粒神经元细胞凋亡中caspase-8基因变化与二乙酰吗啡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(2): 213-219.

Su Li-ping1, Liu Xiao-shan2, Wang Xue-mei, Chen Xiao, Zhang Li-ping, Pu Hong-wei, Wang Zhi-guo, Wang Hua, Li Kai-chao. Effects of diacetylmorphine on caspase-8 gene in apoptosis of cerebellar granule neurons[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(2): 213-219.

图/表（结果） 3

2.1 二乙酰吗啡对小脑神经元细胞核形态学改变的影响在荧光显微镜下Hoechst 33258以非嵌入式结合DNA碱基区并形成特异性形态。在不同质量浓度二乙酰吗啡作用小脑颗粒神经元24 h，通过Hoechst 33258荧光染色发现部分神经元出现高亮蓝色的特征性凋亡小体，其细胞核呈现固缩、凝聚或碎裂样改变(图1B)；随着二乙酰吗啡浓度的升高，凋亡细胞数量逐渐增多(图1C，D，E)；与对照组(图1A)相比，在40 mg/L二乙酰吗啡干预下，神经元细胞凋亡数量开始增多(P < 0.05)，随着二乙酰吗啡浓度的增加凋亡细胞的数量明显增多(P < 0.05)，见表1。

2.2 细胞凋亡率流式细胞仪检测结果显示，不同质量浓度的二乙酰吗啡可致神经元细胞出现不同凋亡率(图2A-E)，

随二乙酰吗啡药物浓度的越高，细胞凋亡数量增多、凋亡率越高(表1)。流式细胞能够精确表达细胞凋亡率，进一步证实了二乙酰吗啡致神经元细胞凋亡。

2.3 Caspase-8 蛋白免疫荧光检测结果与对照组相比，Caspase-8蛋白在80 mg/L的二乙酰吗啡处理下，胞质中的Caspase-8被大量激活，呈高表达状态，进一步级联激活下级促凋亡因子而产生凋亡(图3A)，Caspase-8蛋白相对表达量较对照组明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05，图3B)。

2.4 检测caspase-8 mRNA和蛋白表达 Caspase-8是凋亡过程中重要调节因子，其改变是否参与了二乙酰吗啡诱导神经元凋亡? C-Jun氨基末端激酶通路已证实参与细胞凋亡过程^[4-5]，那么Caspase-8是否也参与二乙酰吗啡诱导凋亡过程的C-Jun氨基末端激酶途径呢。为了探索这个机制，首先观察caspase-8 mRNA在不同质量浓度的二乙酰吗啡作用下，其mRNA表达水平情况。半定量PCR所示(图4A)，在以GAPDH为内参基因基础上，发现在不同质量浓度二乙酰吗啡影响下，caspase-8 mRNA 出现显著上调，并呈现相应的升高趋势；通过反转录聚合酶链反应在 80 mg/L二乙酰吗啡时，与对照组相比Caspase-8 mRNA水平明显高表达，在加入C-Jun氨基末端激酶通路特异性抑制剂SP600125后，二乙酰吗啡+SP600125组中caspase-8 mRNA表达与单因素二乙酰吗啡(80 mg/L)作用小脑颗粒细胞表达水平比较，有明显下降趋势(图4B)。

同时，在以β-Tubulin为内参的基础上，与对照组相比，Caspase-8蛋白量分别在10，40 mg/L开始上调80，100，和120 mg/L 出现高表达(图4C)。

同理，加入SP600125抑制剂后，二乙酰吗啡+ SP600125组中caspase-8 蛋白表达水平与80 mg/L二乙酰吗啡组作用小脑颗粒细胞表达水平比较，有明显下降趋势(图4D)。这表明SP 600125在二乙酰吗啡致神经元凋亡过程中具保护作用。在二乙酰吗啡及SP 600125作用影响下，caspase-8 mRNA和蛋白水平改变，提示caspase-8参与二乙酰吗啡诱导凋亡过程并被C-Jun氨基末端激酶通路相应调节。

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引言

海洛因即二乙酰吗啡，长期摄入会致白质脑病，又名为海洛因海绵状白质脑病^[1]，在脑白质中形成海绵空泡样状特征性病理改变。有文献报道，二乙酰吗啡可致神经元脱髓鞘改变^[2-3]，在成瘾大鼠中脑腹侧被盖区和伏隔核神经元超微结构中可发生明显空泡样病理改变。在大量及长时间二乙酰吗啡作用下，神经元细胞可发生大量凋亡^[4-5]。目前对细胞凋亡在海洛因成瘾机制、致脑组织病变机制、治疗机制等多方面的研究较少，深入探讨海洛因致神经元凋亡机制可为揭示猝死及海洛因海绵状白质脑病的发生机制提供相应的理论依据。

半胱-天冬氨酸蛋白酶8(cysteinyl aspartate specific protease，caspase)为凋亡途径发生的主要诱导因子^[6-7]，可直接激活下游效应caspase，例如Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7及Caspase-9等^[8]。Caspase-8还可间接作用线粒体而释放cytc，进而募集和激活Caspase-9，活化的Caspase-9又激活其他凋亡执行分子，最终导致细胞凋亡^[9]。C-Jun氨基末端激酶家族是促分裂原活化蛋白激酶超家族成员之一，在生长因子、细胞网子、应激(辐射、休克、氧化损伤、炎症)等多种因素下可被激活。大量实验数据显示C-Jun氨基末端激酶信号通路在细胞分化、细胞凋亡、应激反应等多种人类疾病的发生与发展中起着至关重要的作用，可见C-Jun氨基末端激酶信号通路是正常与疾病状态时细胞的重要调节信号通路。Caspase-8与二乙酰吗啡致神经元凋亡之间关系尚未见报道，其与C-Jun氨基末端激酶信号通路相互作用需要更深入探究。本实验采用二乙酰吗啡直接作用原代小脑颗粒神经元细胞，研究二乙酰吗啡诱导神经元凋亡与Caspase-8的关系。

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材料方法

设计：分组对照观察、细胞学实验。

时间及地点：实验于2013年12月至2014年4月在新疆医科大学第一附属医院临床研究院实验室平台完成。

材料：

实验动物：出生7 d龄SPF级SD大鼠，雌雄不限，由新疆医科大学实验动物中心提供。

二乙酰吗啡对小脑颗粒神经元细胞凋亡中caspase-8基因影响实验主要试剂：
试剂	来源
二乙酰吗啡	新疆维吾尔自治区公安厅缉毒总队提供
DMEM/F12培养基，Neurobasal A培养基，胎牛血清，B27无血清补充物、 L-谷氨酰胺(200 mmol/L)、0.25%的胰蛋白酶	Gibco公司
Heochst 33258、阿糖胞苷(Ara-C)、SP600125抑制剂、多聚赖氨酸	Sigma公司
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD公司
无Ca²⁺ D-Hank’s液(pH 7.2)，40 g/L多聚甲醛	北京索莱宝公司
DAPI	Roche公司
Caspase-8、β-tubμLin Ⅲ及Alexa Fluor^®594、488抗 Abcam公司	Abcam公司
Pierce^® BCA protein Assay Kit	Thermo公司
Western blot二抗试剂盒	Invitrogen 公司

实验方法：

体外培养小脑颗粒神经元：参照Lai等^[4]和Kubota等^[10]的方法，结合预实验情况进行。取出生7 d的SD大鼠，每一批5只，体积分数75%乙醇消毒后，断头取小脑组织。在解剖显微镜下去除小脑组织软脑膜和外周血管，剪碎至0.5 mm³大小，全程冰上操作。37 ℃水浴中利用0.125%胰蛋白酶消化30 min，加入含体积分数10%胎牛血清及Dnase Ⅰ酶(100 mL/L)DMEM/F12终止消化。200目筛网过滤、离心、弃上清，混匀至细胞悬液，计数并稀释至4×10⁹L^-1，孵箱培养24 h后，全量换2% B27的Neurobasal A+ Ara-C (10 μmol/L)维持液，此后每隔48 h半量换液1次，Ara-C要持续应用到实验结束。

实验分组：第7天后，神经元分化成熟后，加入不同质量浓度二乙酰吗啡并分为对照组(0 mg/L)，低剂量组(10 mg/L)，中剂量组(40 mg/L)，高剂量组(80 mg/L)及极高剂量组(120 mg/L)；同时，分对照组，80 mg/L二乙酰吗啡组及二乙酰吗啡+SP600125组(80 mg/L二乙酰吗啡+10 μmol/L SP 600125)分别作用小脑颗粒神经元细胞24 h，用于后续相关实验。为了观察caspase-8 mRNA和蛋白在不同质量浓度二乙酰吗啡作用下是否有趋势变化，故增加100 mg/L二乙酰吗啡干预神经元细胞组；SP 600125为粉剂，用二甲基亚砜进行溶解，最终使用浓度为10 μmol/L。

Hoechst 33258 核染色观察：细胞培养至第7天，分别加入质量浓度为10，40，80和120 mg/L二乙酰吗啡作用神经元细胞24 h后，PBS清洗，室温干燥。Hoechst 33258染色10 min，PBS洗3遍，干燥，荧光显微镜下观察统计并拍照。凋亡细胞所占面积：在高倍镜(×200)视野下，随机选取5个区域，对每个小皿凋亡细胞进行双盲法分析计数，凋亡细胞面积=凋亡细胞/相同类型细胞总数(%)，0分为 < 1%；1分为1%-25%；2分为26%-50%；3分为> 50%。

Annexin V-FITC双染法检测细胞凋亡：细胞培养至第7 天，取不同质量浓度二乙酰吗啡分组细胞(同上处理)，弃培养基，PBS清洗2遍，用不含EDTA的胰酶消化并终止，用PBS清洗2遍，1 000 r/min离心5 min，收集(1-5)×10⁵个细胞。加入100 μL Binding Buffer促使细胞悬浮，再加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL Propidium Iodide充分混匀，室温避光孵育15 min，加入400 μL Binding Buffer混匀，立即上流式细胞仪检测，3次独立重复实验。

免疫荧光检测Caspase-8蛋白：细胞培养至第7天，PBS清洗3遍，40 g/L多聚甲醛固定40 min，PBS浸洗3遍，每遍5 min，0.3% Triton X-100的PBS中孵育30 min (37 ℃)，5% BSA封闭1 h(37 ℃)，用0.3% Triton X-100 PBS液稀释1∶500 Anti-beta III TubμLin(β-tubμLin Ⅲ)与1∶800 Caspase-8抗体，4 ℃孵育过夜。第2天室温放置30 min，PBS洗3遍，加Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa Fluor^® 594)和Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor^® 594)二抗孵育40 min，PBS洗3遍，DAPI染色10 min，PBS洗3遍，上激光共聚焦进行相应检测。每个培养皿随机选择3个区域，Caspase-8蛋白表达的定量分析^[11]，以荧光指数(FI)表示Caspase-8蛋白表达的相对含量。公式如下：FI=(实验样品的平均荧光强度一对照样品的平均荧光强度)/正常组织样品的平均荧光强度。数据结果判定：FI>1.0为阳性表达，FI≤1.0为阴性表达。

RT-PCR检测细胞中caspase-8 mRNA的表达：收集对照组，低剂量组，中剂量组，高剂量组，极高剂量组及100 mg/L二乙酰吗啡组；对照组，80 mg/L二乙酰吗啡组及二乙酰吗啡+SP 600125组(80 mg/L二乙酰吗啡+10 μmol/L SP 600125)处理的细胞，Trizol提取细胞总RNA，按Therom试剂盒说明书，进行RT-PCR操作。Invitrogen有限公司设计合成引物序列。caspase-8上游引物5’gga aga gct gcc agt ttc tg 3’，下游引物5’ctc ccg tgc ttt gct gaa at 3’；扩增片段长度为178 bp；GAPDH上游引物：5’caa ctg gga gat atg gag aag 3’，下游引物：5’tct cct tct gca tcc tgt cag3’，扩增片段长度为139 bp。取PCR产物10 μL，置1.2%琼脂糖凝胶电泳成像。

Wester Blotting 检测Caspase-8蛋白的表达：收集不同组处理的细胞(分组同上)；RIPA裂解液提取细胞总蛋白，以5%牛血清白蛋白(BSA，fraction V)为标准蛋白进行每组蛋白定量。将20 μg蛋白样品上样于SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，以湿转法电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h后加caspase-8一抗，4 ℃孵育过夜，取出，洗膜3次，然后加入二抗，室温1 h，洗膜3次，显色。图像处理仪分析caspase-8蛋白表达情况。

主要观察指标：①二乙酰吗啡对小脑神经元细胞核形态学改变的影响。②细胞凋亡率。③Caspase-8 蛋白免疫荧光检测结果。④RT-PCR检测Caspase-8 mRNA和蛋白表达。

统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件进行结果分析，各组实验数据以x(_)±s表示，两组间比较用t 检验，多组间采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

凋亡又名程序性细胞死亡，当外界某种信号刺激真核细胞后，胞内自身遗传机制开始启动，释放一些活化后的内源性DNA内切酶，从而导致自身细胞发生自动化死亡。其机制是生理性，在形态学、生物化学及分子生物学过程的改变与坏死有着本质的区别。程序性细胞死亡参与人类生命的整个时期并起着重要作用，如胚胎的发育、免疫调节、组织重建及肿瘤退化等生理各个环节^[12]。凋亡发生的关键是核酸内切酶的激活，活化的核酸内切酶裂解染色质DNA，因此，可见凋亡的细胞胞核出现核质浓缩、碎裂、DNA片段化、凋亡小体形成为主要表现^[13]。

在神经系统疾病研究领域中，凋亡机制起着举足轻重的作用，尤其是对退行性疾病如老年性痴呆、阿尔次海默病、癫痫发作、脑缺血、脑损伤及某些慢性神经变性疾病引起的神经元缺失病理改变有着重要作用^[12^、^14]。在长期或大量滥用二乙酰吗啡死亡的案例中，大多数可见缺血性神经改变、神经元损伤、淤血及脑组织水肿等病理学改变，以静脉注射方式为主的案例中，大脑两边呈对称性缺血性坏死，部分可见神经元密度降低；在加热后吸食二乙酰吗啡的人员中，可见海绵状白纸脑病病理改变，蒲肯野氏细胞层及灰质海马神经元细胞减少^[15]。

目前研究确证了细胞凋亡在海洛因成瘾致神经系统损伤中起着重要作用，并且有证据表明，在海洛因长期依赖致神经系统损伤过程中，调控细胞凋亡可降低脑组织损伤程度。然而，多数研究着重于影像学及凋亡细胞形态学改变，对海洛因致神经元细胞凋亡机制研究较少，而Caspase-8在二乙酰吗啡诱导小脑颗粒神经元凋亡作用关系研究尚未见报道。半胱氨酸蛋白酶家族是在人类进化上高度保守序列得特异性家族，主要参与细胞凋亡过程，通过依赖线粒体途径和非依赖线粒体途径(死亡受体通路)两条路径执行细胞凋亡^[16]。全长为479个氨基酸的Caspase-8，作为半胱氨酸蛋白酶家族的重要成员，是执行凋亡过程中主要启动者，通过“诱导接近模式”激活，促使下游Caspase“瀑布式”活化^[17]，不同程度放大凋亡信号，将信号通过非依赖线粒体途径传递到线粒体途径，把死亡受体通路与线粒体通路结合起来，扩大凋亡信号^[18]。细胞外源性凋亡途径中主要以死亡受体(Fas、Fasl、和DR5等)为代表，而caspase-8是其关键的启动型因子。Caspase-8在“诱导接近模式”活化后，能够引发caspase蛋白酶级联反应，并进一步链式水解激活其下游的同源酶(如caspase-6、caspase-7)，最后激活其效应物caspase-3发生生物效应^[19]。同时，细胞内源性途径也可被活化的caspase-8激活，caspase-8主要在胞浆中裂解Bcl-2家族成员Bid，裂解产物主要是羧基端片段tBid并转移至线粒体上，促使线粒体膜通透性改变而释放细胞色素c诱发凋亡。Caspase-8作为细胞内外源性凋亡途径的重要桥梁，将细胞外途径间接作用于细胞内途径，从而使死亡受体通路与线粒体通路相结合，有效地放大了凋亡信号更大程度增加了细胞凋亡^[20]。已有文献报道，二乙酰吗啡诱导神经元凋亡并与C-Jun氨基末端激酶通路有密切关系^[4]。C-jun氨基末端激酶在细胞生长、分化、凋亡、胚胎发育及免疫应答等都有着至关重要的作用。C-jun氨基末端激酶信号通路在被多种细胞刺激如紫外线照射、热休克或炎症刺激等通过MAPKKK．MAPKK．MAPK(C-jun氨基末端激酶)逐级系统激活。活化的C-jun氨基末端激酶将细胞外信号传导至细胞核，从而激活转录因子进而调控相应靶基因的激活^[21-22]。所以，C-jun氨基末端激酶在细胞增殖、细胞凋亡、炎性因子的产生等多种生命活动中起着重要作用^[23]。有研究提示SP600125具有神经保护作用，比如在短暂性脑缺血或缺血再灌注，可逆磷酸腺苷环化酶(ATP)的竞争性抑制剂，可对C-jun氨基末端激酶各亚型高选择性抑制^[24-25]。C-jun氨基末端激酶是凋亡中的重要通路，其主要参与内源性凋亡途径，那casase-8是否也参与了C-jun氨基末端激酶信号途径呢？

实验培养原代大鼠小脑颗粒神经元细胞，细胞分化成熟后加入质量浓度为0-120 mg/L的二乙酰吗啡药物作用小脑颗粒细胞24 h，Hoechst 33258荧光染料染色形态学观察，10 mg/L的二乙酰吗啡，仅存在少量凋亡神经细胞。40 mg/L二乙酰吗啡则使凋亡神经元细胞数量增多，其体积比正常神经元体积缩小，细胞核变小、固缩或碎裂，形状不规则，核内块状呈高亮蓝色，并可见不规则的核碎片及凋亡小体。凋亡细胞在80 mg/L二乙酰吗啡中数量明显增多，120 mg/L时凋亡细胞数量最多，提示高质量浓度二乙酰吗啡可引起较严重的细胞凋亡，并呈剂量依赖性地诱导大鼠小脑颗粒细胞凋亡。同样，流式细胞仪检测发现0-120 mg/L浓度的二乙酰吗啡作用小脑颗粒细胞24 h，随给药浓度增加凋亡率也呈现上升趋势，进一步确证了二乙酰吗啡可直接诱导神经元细胞凋亡并呈剂量依赖性的变化。

在二乙酰吗啡诱导神经元凋亡时，作者检测了caspase-8蛋白在80 mg/L二乙酰吗啡干预下明显增多，细胞形态变小或缺失，数量减少。随着二乙酰吗啡质量浓度的升高即10，40，80，100和120 mg/L，caspase-8 mRNA和蛋白也呈现上升趋势，caspase-8 mRNA和蛋白在80 mg/L二乙酰吗啡浓度下出现明显上调(P < 0.05)，caspase-8表达量随浓度的增加而呈现升高趋势。这表明caspase-8参与二乙酰吗啡致神经元细胞凋亡过程。本实验加入利用C-jun氨基末端激酶特异性抑制剂SP 600125抑制C-jun氨基末端激酶通路来检测caspase-8因子表达量变化，排除其他信号通路参与的可能。实验结果与预期相符，二乙酰吗啡+SP 600125组caspase-8 mRNA和蛋白较80 mg/L二乙酰吗啡组明显下调(P < 0.05)，提示caspase-8参与二乙酰吗啡致神经元凋亡过程，可被C-jun氨基末端激酶通路相应调节。

实验通过Hoechst 33258从形态证实了二乙酰吗啡可以诱导小脑颗粒细胞凋亡，流式细胞技术进一步明确了二乙酰吗啡致神经元凋亡呈剂量依赖性。caspase-8 mRNA和蛋白随二乙酰吗啡浓度的增加而升高，明确了caspase-8参与了二乙酰吗啡致神经元凋亡过程，C-jun氨基末端激酶可相应的调节caspase-8 mRNA和蛋白表达量。那么二乙酰吗啡是直接与caspase-8作用还是通过与其C-jun氨基末端激酶途径中哪些靶基因结合而诱发凋亡作用？因此，Caspase-8在二乙酰吗啡致神经元凋亡的变化证据，还需进一步深入研究和探索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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小脑颗粒神经元细胞凋亡中caspase-8基因变化与二乙酰吗啡的影响

Effects of diacetylmorphine on caspase-8 gene in apoptosis of cerebellar granule neurons

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