设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2012年1月至2013年7月在辽宁医学院研究生学院骨科实验室完成。
材料：
实验动物：雄性新西兰大耳白兔25只，清洁级，体质量(3.0±0.5) kg，常规饲养，由辽宁医学院实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
实验试剂：DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Western blot化学试剂盒、RT-PCR试剂盒、胎牛血清、腺病毒真核表达载体。
实验仪器：A101439电泳仪、电泳槽、1703940转膜仪、凝胶成像系统、CPH-500倒置相差显微镜、CX31-32C02荧光倒置显微镜。
溶液配制：
电泳缓冲液的配制：Tris-base 27 g，硼酸13.75 g，0.5 mol/L EDTA 10 mL加入475 mL三蒸水中，磁力搅拌器搅拌至完全溶解，加入三蒸水定容为500 mL，4 ℃保存，使用时稀释10倍。
1%琼脂糖凝胶的配制：电泳缓冲液稀释10倍后加入适量琼脂糖，在微波炉中加热使琼脂糖彻底稀释后将其放置于室温下，待其温度降至50 ℃时加入预先配制好的0.5 mg/L的溴化乙锭，使其与琼脂糖溶液充分混合，接着加入到胶槽内，放入电泳梳子。待琼脂糖溶液彻底成形后，取出电泳梳子。在电泳槽里加入适量的缓冲液，然后将准备好的胶槽置入其中，要注意缓冲液液面一定要高于所配制的凝胶高度。
磷酸盐缓冲液的配制：称取氯化钾0.2 g、氯化钠8.0 g、磷酸钠3.15 g、磷酸钾0.2 g，同时置于大量筒中，加入蒸馏水，使其总量1 L。用搅拌器使其充分溶解，保证配制的溶液pH值维持在中性。分装入试剂瓶中，瓶塞上插入注射针头，68 kPa高压锅中消菌30 min，取出后4 ℃保存备用。
DEPC水的配制：DEPC水1 mL加至999 mL蒸馏水中，充分混匀，所有RT-PCR反应中用到的相关用具均需用DEPC水浸泡过夜后使用。
0.1%Ⅰ型胶原酶的配制：PBS、Ⅰ型胶原酶、牛血清白蛋白的量分别为100 mL、100 mg、2.0 g。置于量筒中，充分混合，过滤，除菌后-20 ℃保存备用。
Western实验中所需试剂：①丙烯酰胺储存液：称取甲叉双丙烯酰胺和丙烯酰胺各1 g和29 g，加入量筒中，向其内倒入蒸馏水，使其刻度至1 L，一次性滤器滤过后，于避光环境下4 ℃保存。②普通缓冲液：电泳缓冲液的配制：900 mL蒸馏水加入Tris-base 30 g、SDS 10 g、Glycine 144 g，充分混合，调整pH为8.3，补充蒸馏水至1 L，4 ℃保存，稀释10倍使用；TBST缓冲液的配制：量取10×TBS 10 mL加入量筒中，倒入蒸馏水至刻度为100 mL，再加入0.1 mL的0.1%Tween-20，4 ℃保存待用。③10×TBS缓冲液的配制：称取NaCl和Tris-base各44 g和30 g，加入量筒中，倒入蒸馏水至刻度为0.4 L，调整pH为中性后再补充蒸馏水至刻度为0.5 L，4 ℃保存，稀释10倍使用。④电转缓冲液的配制：蒸馏水900 mL、Tris-base 30 g、SDS 3.7 g、Glycine 148 g，充分调匀，将pH值调节为8.0，4 ℃保存，稀释10倍后加入10%甲醇使用。⑤封闭液配制：100 mL TBST、脱脂奶粉5 g，4 ℃保存备用。
实验方法：
脂肪来源干细胞的提取、培养：新西兰大白兔1只，空气栓塞处死后，沿颈背部正中线切开，取颈后部脂肪组织置于无菌盘中，获得的脂肪组织应用PBS及青霉素、链霉素充分洗涤，使用无菌手术剪刀将洗涤后的脂肪组织剪碎成1 mm3左右大小；切碎的组织在37 ℃下加入0.15%Ⅰ型胶原酶酶促解离45 min。加入体积分数为10%胎牛血清培养基中止消化过程，再用200目滤网过滤，去除因脂肪组织块过大尚未消化的部分，滤后获得的细胞悬液装入离心管中，离心10 min，获得目的细胞；PBS充分中和清洗，应用滤网再次过滤，离心，弃上清；将沉淀的细胞以2×109 L-1的细胞浓度度重新悬浮于添加有体积分数为10%胎牛血清和10% KSR的DMEM/F12培养基中。细胞置于37 ℃恒温、湿润的细胞培养箱中孵育。5 d后首次换液，以后每三四天换液1次，待细胞长至80%左右时倒掉旧培养液，用PBS冲洗3次，向瓶中加入1 mL胰酶充分覆盖细胞，置于显微镜下观察，当大部分细胞漂浮于瓶中且悬浮的细胞突起消失时，加入含体积分数为10%胎牛血清培养基中和以终止消化，反复吹打瓶底贴壁细胞并将吹下来的细胞吹打均匀，补足培养基，放入细胞培养箱中。4 d后首次换液，以后每三四天换液1次。依上述传代方法将细胞传至第3代备用。
脂肪干细胞向脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞分化：
向脂肪细胞分化：第3代脂肪干细胞用胰蛋白酶消化并按每25 cm2 5×105的密度平铺于培养瓶中。将细胞置于含 3 mL体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中恒温孵育24 h。然后将细胞接种到脂肪诱导培养基中。每3 d更换1次培养液，直至培养两三周，采用红油O染色对其成脂分化进行评估。染色前将细胞用PBS漂洗，并在体积分数为4%的甲醛溶液中固定30 min，在30 ℃下置于2%的红油O试剂。最后应用PBS洗涤3次以去除过量的杂物。
向软骨细胞分化：第3代脂肪干细胞用胰蛋白酶消化并按每25 cm2 5×105的密度平铺于培养瓶中。将细胞置于含 3 mL体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中恒温孵育24 h。然后将细胞接种到成软骨诱导培养基中。每3 d更换1次培养液，直至培养两三周。采用阿利辛蓝染色对其成软骨分化进行评估。染色前将细胞用PBS漂洗，并在体积分数为4%的甲醛溶液中固定30 min。在30 ℃室温下置于1%阿利辛蓝染色3 h。最后应用PBS洗涤3次以去除过量的杂物。
向骨细胞分化：第3代脂肪干细胞用胰蛋白酶消化并按每25 cm2 5×105的密度平铺于培养瓶中。将细胞置于含3 mL体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中恒温孵育24 h。然后将细胞接种到成骨诱导培养基中培养。应用茜素红染色法对其成骨分化进行评估，染色前将细胞用PBS漂洗，并在体积分数为4%的甲醛溶液中固定15 min。在30 ℃室温下置于茜素红试剂中3-5 min。最后应用PBS洗涤3次以去除过量的杂物。
骨形态发生蛋白14转染脂肪干细胞：①转染组：取制备好的第3代脂肪干细胞接种于细胞培养板中，接种密度为5×105/孔，置于37 ℃恒温、湿润的细胞培养箱中孵育24 h，待细胞贴壁长满80%左右后吸去上清。Ad-CMV-BMP-14- IRES-hrGFP-1病毒液以感染复数(MOI)值为150转染脂肪干细胞，再补充2 mL无血清DMEM培养基。②对照组：在培养板中单纯接种脂肪干细胞不做任何处理。将所有培养板置于37 ℃恒温、湿润的细胞培养箱中孵育3 h，之后再加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基2 mL，继续培养两三天。腺病毒转染细胞成功后，于倒置显微镜下观察荧光成像清晰，细胞未发生变形且细胞聚合反应很少见。将转染成功的第3代脂肪干细胞接种于37 ℃、体积分数为5%CO2、100%饱和湿度培养箱中孵育5 d后，取标本进行检测。
Western blot检测骨形态发生蛋白14和Ⅱ型胶原蛋白表达：留取转染组、对照组贴壁生长的细胞应用PBS反复冲洗，加入蛋白裂解液裂解细胞，经离心后，测定上清液中蛋白含量；转膜，封闭，羊抗兔单克隆抗体作为一抗、辣根过氧化物酶标记的驴抗羊IgG作为二抗，使用Tween-20 PBS稀释，与滤膜共温浴，显色。将膜置于凝胶成像系统中以分析其目的条带与内参照，测各自的吸光度值。重复以上操作3次，计算净吸光度值。
RT-PCR检测Sox-9基因表达：TRIzol法提取转染组、对照组细胞总RNA：首先取1 μg RNA进行反转录，得到第1股cDNA，产物用于扩增目的基因。根据已知基因序列，设计合成引物序列，引物序列：sox-9上游5’-GAA CGC ACA TCA AGA CGG AG-3’，下游5’-TCT CGT TGA TTT CGC TGC TC-3’。所有反应结束后，取PCR反应液进行1%琼脂糖凝胶电泳40 min，观察电泳结果，置于凝胶成像系统中检测目的条带的吸光度值。重复以上操作3次。
Ⅰ型胶原海绵支架搭载脂肪干细胞复合体制备：转染 3 d后将脂肪干细胞消化为细胞悬液，将Ⅰ型胶原海绵支架(广州创尔生物技术有限公司)修整为直径4 mm长度2 mm的圆柱体放入培养瓶中，将两组细胞悬液用移液枪滴加至培养瓶中至完全覆盖支架，种植数量约为1×106个，恒温孵育3 d使细胞完全吸附于Ⅰ型胶原海绵支架中，制成细胞载体复合物。
兔关节软骨缺损修复：将24只成年新西兰大白兔随机分为3组，每组8只，20%速眠新1.0 mg/kg肌肉注射麻醉后，将大鼠仰卧固定于手术台上，双下肢备皮，常规消毒，铺无菌洞巾，取膝关节髌前内侧弧形切口，向两侧掀开皮肤、皮下筋膜，经髌骨内侧缘切开膝关节内侧支持韧带，将髌骨向外侧脱位，使股骨髁间髌骨滑车部充分显露，用直径4 mm钻头在股骨髁间窝关节负重面造成软骨及软骨下骨缺损，深度约3 mm，见创面有少量渗血为止。实验组于缺损区植入支架搭载经骨形态发生蛋白14转染后的脂肪干细胞，对照组于缺损区植入支架搭载脂肪干细胞，空白组植入单纯支架。分组处理后，复位髌骨，严密缝合膝关节囊内侧支持韧带，缝合皮肤切口，局部加压包扎。术后抗生素处理，肌注青霉素80×104 U，1次/d，连续3 d，分笼饲养，定期换药，按照标准动物饲养法饲养，于术后12周取材，对3组关节软骨分别进行大体观察、切片染色后组织学观察。
软骨修复的形态学检查及评分：于术后12周处死实验兔，取双侧膝关节股骨下端在内的关节面按Wakitani评分标准进行评价，该评分标准由5项指标组成：细胞形态完整性、基质染色是否清晰、表面是否光滑平整、新生软骨厚度及与周围是否融合。
软骨修复的组织学检查及评分：取手术修复的组织标本，PBS反复冲洗，40 g/L多聚甲醛固定1周，10% Formiacal脱钙液脱钙1个月，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋，选择损伤区中央部组织沿关节面横向做5 μm厚切片。对切片进行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原蛋白免疫组化检测，显微镜下观察切片判断组织愈合情况。
.jpg)
苏木精-伊红染色：标本常规脱钙、石蜡包埋和切片，二甲苯及梯度乙醇脱蜡水化，分别进行苏木精染色，盐酸乙醇分化，促蓝液返蓝，伊红液染色，最后脱水、透明和封固，光镜下观察组织形态。
甲苯胺蓝染色：标本经甲醛固定、脱钙、石腊包埋、沿矢状面垂直于缺损区进行切片, 二甲苯及梯度乙醇脱蜡水化，甲苯胺蓝染色12 h，水洗2 min，脱水、透明和封固，光镜下观察组织形态。
免疫组织化学染色：PBS冲洗标本，滴加动物血清，封闭非特异性抗原，滴加一抗工作液37 ℃孵育1.0-2.0 h，冲洗，滴加二抗工作液室温下孵育30 min，再次冲洗后用显色剂显色冲洗，复染，脱水，透明，封固。
主要观察指标：①骨形态发生蛋白14转染的脂肪干细胞骨形态发生蛋白14和Ⅱ型胶原蛋白表达，Sox-9基因表达。②Ⅰ型胶原海绵支架搭载经骨形态发生蛋白14转染脂肪干细胞修复软骨缺损的形态学和组织学检测结果。
统计学分析：采用SPSS 18.0统计软件进行分析，数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。
