过氧化氢对胚胎干细胞移植治疗心肌梗死的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.01.001

摘要/Abstract

摘要：

背景：干细胞移植治疗心肌梗死的具体机制一直不十分清楚。
目的：探讨H₂O₂体外预处理小鼠胚胎干细胞对治疗心肌梗死疗效的影响。
方法：选取24只9周龄C57BL/6小鼠随机分为心肌梗死组、胚胎干细胞组、H₂O₂预处理胚胎干细胞组，每组8只，所有小鼠制备心肌梗死模型1周后，分别于尾静脉分别注入150 μL的PBS、150 μL的胚胎干细胞(1×10⁶)、150 μL的H₂O₂预处理胚胎干细胞(1×10⁶)。移植后第3周超声测量各组小鼠左心室舒张末内径、左心室收缩末内径和左心室射血分数。超声心动图检查后取心肌组织行天狼星红染色检测心肌胶原含量，计算平均胶原容积分数。
结果与结论：与心肌梗死组比较，胚胎干细胞组和H₂O₂预处理胚胎干细胞组左心室舒张末内径和左心室收缩末内径明显下降，左心室射血分数明显升高(P < 0.05)，全心质量/体质量、左心室质量/体质量、平均胶原容积分数明显降低(P < 0.05)；与胚胎干细胞组比较，H₂O₂预处理胚胎干细胞组小鼠左心室舒张末内径和左心室收缩末内径明显下降，左心室射血分数明显升高(P < 0.05)，全心质量/体质量、左心室质量/体质量、平均胶原容积分数明显降低(P < 0.05)。所以体外H₂O₂预处理胚胎干细胞减轻了心肌梗死后心肌纤维化，心功能改善更为明显。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 胚胎干细胞, 过氧化氢, 心肌梗死, 血管内皮生长因子类, 胶原容积分数, 心肌缺血预适应, C57BL/6小鼠

Abstract:

BACKGROUND: Specific mechanism of stem cell transplantation for treatment of myocardial infarction has been not very clear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of H₂O₂-pretreated mouse embryonic stem cells in vitro for treatment of myocardial infarction.
METHODS: Twenty-four C57BL/6 mice, 9 weeks old, were randomized into myocardial infarction group, embryonic stem cells group, H₂O₂ pretreatment group, with eight mice in each group, which were respectively injected 150 μL PBS, 150 μL embryonic stem cells (1×10⁶), and 150 μL H₂O₂-pretreated embryonic stem cells (1×10⁶) at 1 week after modeling. At 3 weeks after transplantation, left ventricular end-diastolic diameter, left ventricular end-systolic inner diameter and left ventricular ejection fraction of mice in each group were measured by ultrasound. Myocardial collagen content was detected by Sirius red staining and the average collagen volume fraction was calculated.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the myocardial infarction group, the left ventricular end-diastolic diameter and left ventricular end-systolic inner diameter were significantly decreased in the embryonic stem cells group and H₂O₂ pretreatment group, while the left ventricular ejection fraction was significantly increased (P < 0.05). Heart weight/body weight, left ventricular weight/body weight, and average collagen volume fraction were significantly lower in the embryonic stem cells group and H₂O₂ pretreatment group than the myocardial infarction group (P < 0.05). Therefore, in vitro H₂O₂ pretreatment enhances reduce the post-myocardial infarction myocardial fibrosis and greatly improve heart function.

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Key words: Embryonic Stem Cells, Hydrogen Peroxide, Myocardial Infarction, Interleukin-6

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 5

2.1 体外培养胚胎干细胞的形态 在荧光倒置显微镜下可观察到较典型的鼠胚胎干细胞形态：细胞呈克隆样生长，边界光滑清晰，折光性好，形状为椭圆形或圆形，克隆内部细胞边界不清(图1)。

2.2 免疫荧光检测结果 在荧光显微镜观察胚胎干细胞，同一视野用激光共聚焦显微镜观察胚胎干细胞免疫荧光染色结果，可见呈红色荧光的Oct-4、SSEA-1的表达，Oct-4表达在细胞核(A1)，SSEA-1表达在细胞膜(B1)，说明培养的细胞的确为胚胎干细胞(图2)。

2.3 H₂O₂预处理对胚胎干细胞旁分泌功能的影响 ELISA法检测显示，H₂O₂预处理胚胎干细胞上清液中白细胞介素6水平较未处理胚胎干细胞显著升高(P < 0.05)，而血管内皮生长因子水平与未处理组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，提示H₂O₂预处理胚胎干细胞提高其了分泌细胞因子白细胞介素6水平，见表1。

2.4 实验动物数量分析 24只实验小鼠全部进入结果分析，中间无脱落。

2.5 H₂O₂预处理对小鼠心肌梗死疗效的影响 与心肌梗死组比较，胚胎干细胞组和H₂O₂预处理胚胎干细胞组小鼠的心功能明显改善，左心室舒张末内径和左心室收缩末内径明显下降，左室射血分数明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；与胚胎干细胞组相比，H₂O₂预处理胚胎干细胞组小鼠左心室舒张末内径和左心室收缩末内径进一步下降，左室射血分数进一步升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，提示H₂O₂预处理胚胎干细胞能更好的改善心功能，见图3。

2.6 小鼠心肌胶原含量的比较 与心肌梗死组比较，胚胎干细胞组和H₂O₂预处理胚胎干细胞组全心质量/体质量、左心室质量/体质量、平均胶原容积分数明显降低(P < 0.05)。与胚胎干细胞组比较，H₂O₂预处理胚胎干细胞组全心质量/体质量、左心室总质量/体质量、平均胶原容积分数(CVF)也显著降低(P < 0.05)，提示H₂O₂预处理胚胎干细胞组心肌肥厚减低程度更为显著，见表2。

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引言

心肌梗死是在冠状动脉粥样硬化基础上发生的冠状动脉血栓形成或分支阻塞，使心肌血液循环突然全部中断而导致该部位心肌损伤，可并发心律失常、休克或心力衰竭，常可危及生命。每年全球约有1 700万人死于心血管病，其中占总数1/2的患者死于急性心肌梗死^[1]。目前，中国老年人近2亿，数量还在不断增加，心肌梗死发病率也将不断上升。在过去30年中，心肌梗死的病死率(30 d内)虽然已降至10%，但年病死率仍为20%左右^[2]。成年人心肌细胞缺乏再生修复能力，一旦坏死，细胞的绝对数量将减少，梗死区心肌细胞转化为瘢痕组织而失去功能，致使心功能难以恢复，可最终导致死亡。目前，心肌梗死的治疗方法以药物治疗、介入治疗和外科手术治疗为主。虽然这些方法可以解除血管阻塞，缓解心室重构，延缓和改善心功能的恶化及心律失常的发生，但无法逆转坏死心肌，使已梗死的心肌细胞再生。心脏移植是包括心肌梗死在内的多种严重心脏病的治疗方法之一，但由于供体来源缺乏、移植排斥、移植组织功能衰竭及费用高昂等原因，临床难以广泛应用。对于重症心肌梗死和心力衰竭患者，尽管采取了以上诸多治疗方法，但在改善心肌供血和心功能方面仍然存在难题，而干细胞治疗给人们带来了新的希望^[3]。

胚胎干细胞具有无限增殖和全能分化的潜力，理论上胚胎干细胞具有分化为各种细胞的潜能^[4]，目前已成功将胚胎干细胞诱导分化为多种终末组织细胞，成为细胞和器官移植领域最具潜在优势的资源^[5-7]。大量动物实验已证实，移植骨髓间充质干细胞能够定植并分化为心肌细胞和血管内皮细胞，动员自体心脏干细胞，并且分泌大量抗凋亡和促血管新生的细胞因子^[8]，但干细胞移植存活率低、疗效有限，成为其临床应用的瓶颈^[9]。

既往研究发现，心肌缺血预适应可以减轻缺血再灌注损伤，减少梗死心肌面积。这一过程中，因代谢紊乱会产生具有细胞毒性作用的活性氧产物(包括H₂O₂、氧自由基等)，造成心肌损伤和微环境的紊乱，但这些产物同时又是缺血预适应重要的触发因素^[10]。有研究发现，非致死浓度的H₂O₂预处理间充质干细胞，可以通过激活磷脂酸肌醇-3激酶/丝氨酸激酶信号通路，预防其后H₂O₂引起的细胞死亡^[11]。本实验将采用H₂O₂体外预处理小鼠胚胎干细胞，观察其对治疗心肌梗死疗效的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年10至12月在郑州大学干细胞研究中心完成。

材料：

实验动物：9周龄雌性健康C57BL/6小鼠24只，体质量18-22 g，购自河南省实验动物中心。实验过程中对动物的处理符合伦理学标准。

实验方法：

E14细胞培养：参考相关文献^[12-14]，首先将适量1 g/L明胶溶液加入到100 mm细胞培养皿中，轻轻振荡，使明胶溶液可以覆盖培养皿的细胞生长面，25 min后将明胶溶液吸出，干燥后使用。将E14细胞接种于该培养皿中，细胞培养液为含体积分数为20%胎牛血清，0.1 mmol/L β-巯基乙醇，0.1 mmol/L非必需氨基酸，1 mmol/L丙酮酸钠，2mmol/L谷氨酰胺，1 000 U/mL 白血病抑制因子的高糖DMEM培养液，于37 ℃、体积分数为5% CO₂饱和湿度条件下培养。原代培养至细胞达70%-80%汇合时，弃培养液，以无Ca²⁺、Mg²⁺ PBS洗1次，0.5 g/L胰酶、0.2 g/L EDTA于37 ℃下消化3-5 min，按1︰3比例常规传代。将处于对数生长期的第5代细胞用于后续实验。

免疫荧光检测胚胎干细胞表面标志物：第5代细胞用0.01 mol/L PBS洗3次后，以45 g/L多聚甲醛固定15 min，0.01 mol/L PBS洗涤，视情况用0.01 mol/L PBS+体积分数为0.2% Triton-X 100室温穿透细胞20 min，再以即用型二抗宿主血清封闭25 min。弃血清后，加入一抗抗体Oct-4(1∶200稀释)和SSEA-1(1∶50稀释)，并于4 ℃孵育过夜。PBS洗涤，再以Cy3标记二抗室温孵育1.5 h后，重复PBS洗涤，以1 mg/L Hoechst33344染细胞核，激光共聚焦显微镜及荧光显微镜下观察拍照。

H₂O₂预处理胚胎干细胞：将80%铺满胚胎干细胞的培养皿中的培养液暴露在37 ℃，200 μmol/L的H₂O₂中3 h，然后用PBS冲洗细胞3次，重悬于DMEM培养液中备用。

ELISA检测：将未预处理细胞和H₂O₂预处理细胞以3×10⁵/cm²的密度分别培养72 h后收集上清液，通过0.2 μm的微多孔膜过滤，用ELISA法分析血管内皮生长因子和白细胞介素6水平。

心肌梗死模型制备及细胞移植：参照文献[15]制作小鼠心肌梗死动物模型，以戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，接心电监护、气管插管并接上小动物呼吸肌，于心前区肋间隙进入胸腔并刺破心包，暴露视野后找到动脉圆锥，在与左心耳交界处下方0.2 cm处缝扎左前降支动脉，可见心电监护ST段显著抬高。术后关胸常规肌注30×10⁴ U青霉素。

24只复制成功的心肌梗死模型小鼠于术后1周随机分为3组：心肌梗死组、胚胎干细胞组和H₂O₂预处理胚胎干细胞组，每组8只，于尾静脉分别注入150 μL的PBS、150 μL的胚胎干细胞(1×10⁶)、150 μL的H₂O₂预处理胚胎干细胞(1×10⁶)。

心功能检测：移植后3周，每组小鼠在无麻醉状态下固定体位，于左心室短轴腱索水平切面，二维多普勒超声仪检测小鼠左心室舒张末内径(left ventricular end-diastolic dimension，LVDd)、左心室收缩末内径(left ventricular end- systolic dimension，LVDs)，按照公式计算左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)，所有结果取自至少3个独立心动周期的平均值。

LVEF=[(LVDd)³-( LVDs)³]/ ( LVDd)³×100%。

心脏组织病理学检测：行超声心动图检测后，氯化钾注射处死小鼠，心脏取材测量全心质量，分离并测量左心室质量，计算心肌肥厚指数：全心质量/体质量，左心室质量/体质量。以左心室中位横截面为中心将心脏组织制备成5 μm的切片，天狼星红染色^[16]，400倍偏振光显微镜下随机选取10个视野观察，采用pro-plus 5.1成像系统分析平均胶原容积分数(CVF)。

主要观察指标：①荧光显微镜下观察胚胎干细胞标志物的表达。②ELISA法分析胚胎干细胞培养液中的血管内皮生长因子和白细胞介素6水平。③应用多普勒超声仪检测各组动物的心功能。④pro-plus 成像系统分析小鼠心肌平均胶原容积分数。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件，数据以x(_)±s表示，两组比较采用t 检验，α=0.05。

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讨论

干细胞移植改善受损心脏功能是目前心血管疾病治疗的全新策略，目前，已有多种干细胞应用于心肌梗死临床治疗研究^[17-19]，包括骨髓间充质干细胞、造血干细胞和心脏干细胞等，但他们向心肌细胞分化的能力有限，这些干细胞起到提高心功能水平的机制目前认为是通过旁分泌发挥作用的^[20-25]。现已发现多种干细胞因子包括胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子、间质细胞衍生因子1、分泌型卷曲相关蛋白2等通过组织间隙扩散作用于周围临近细胞，广泛参与调节细胞凋亡、血管再生、瘢痕形成、炎症反应和内源性干细胞增殖等病理生理效应^[26-28]。有研究证实，单纯收集干细胞培养上清液中细胞因子即可促进组织修复^[29]。适宜浓度的白细胞介素6可抗炎、抗细胞凋亡，促进干细胞的增殖和迁移^[30]。本实验发现，H₂O₂体外预处理胚胎干细胞增加了白细胞介素6的分泌，所以胚胎干细胞对心肌梗死的治疗作用可能是通过细胞因子发挥作用的。

有研究表明，不同浓度H₂O₂对干细胞的影响是有差异的^[31]，H₂O₂浓度为600 μmol/L时，骨髓间充质干细胞凋亡明显升高，而H₂O₂浓度小于300 μmol/L时，凋亡不明显，且有刺激骨髓间充质干细胞增殖的作用；以400 μmol/L H₂O₂作用骨髓间充质干细胞24 h后，β-半乳糖苷酶染色阳性率显著增加，p21、p16、p53基因表达显著升高，可造成骨髓间充质干细胞衰老；低浓度短时间H₂O₂预处理人脐带间充质干细胞对高浓度长时间H₂O₂预处理人脐带间充质干细胞损伤具有适应性保护作用，且需要适宜的预处理强度及时间间隔^[32]。而本次实验采用的H₂O₂浓度为200 μmol/L，与以前研究相符。

研究发现，在静脉注射干细胞后1周，大部分干细胞都被阻滞在鼠肺内，只有不到1%的干细胞能够迁移到梗死的心肌^[33]。本实验也采用了静脉移植胚胎干细胞治疗心肌梗死，在这一过程中，干细胞迁移到梗死心肌并与宿主细胞融合、转(分)化为心肌或内皮细胞的概率也应相当微小，其后的心功能显著改善，印证了干细胞旁分泌功能在组织修复中的重要作用。

目前研究认为缺血再灌注损伤与氧自由基、钙超载、中性粒细胞、微血管损伤以及补体激活有关，其中氧自由基学说是关键的机制。Zweier等^[34]利用电子顺磁共振和自旋捕获技术证实，在再灌注的最初几分钟内，自由基爆发性的产生超过了机体内源性的抗氧化酶系统的清除能力，从而造成了后续的氧化损伤，但也有研究发现，缺血预适应时产生的低浓度活性氧可改变细胞的氧化还原状态，减轻其后的再灌注损伤^[35]。有研究发现，低氧预处理脂肪来源间充质干细胞可以改善损伤局部血供、促进组织修复^[36]。Brocheriou等^[37]利用转基因技术将人的Bcl-2的基因转染入小鼠的心肌细胞中，使之表达大量的Bcl-2蛋白，这些转基因鼠的心肌缺血再灌注损伤模型的凋亡细胞数目和梗死面积与对照组相比显著下降，提示Bcl-2具有抗心肌细胞凋亡的作用。而有研究表明低浓度的H₂O₂不仅可以减少活性氧生成，还可以增加凋亡抑制蛋白Bcl-2表达^[38-39]，从而保护PC12细胞，减轻在其之后暴露于致死性氧化应激时的凋亡，从而有利于恢复心功能。

Angeloni等^[39]发现，非致死浓度H₂O₂可降低凋亡酶caspase-3的活性，增加Bcl-2表达，并且通过上调因子Nrf1和Nrf2选择性地增加抗氧化剂和二阶段酶的表达和活性。本实验采用H₂O₂预处理干细胞明显增强了胚胎干细胞的组织修复功能。氧化应激是机体缺血、缺氧及炎症时的生理反应。因此，H₂O₂预处理在某种程度上，可看做模拟心肌梗死缺血预适应的自然过程。在规避基因修饰等途径带来致癌风险同时简单有效地提高了干细胞移植效率。

总之，胚胎干细胞静脉移植可减轻心肌梗死后心室重构、改善心功能，而H₂O₂体外预处理胚胎干细胞通过提高细胞因子白细胞介素6表达从而显著提高了胚胎干细胞治疗心肌梗死作用，为临床提高干细胞移植治疗效率，提供了一种简便、安全、有效的选择。