慢性胰腺炎模型大鼠转化生长因子β1/Smads通路被秋水仙碱的抑制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.49.023

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (49): 8001-8006.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.49.023

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慢性胰腺炎模型大鼠转化生长因子β1/Smads通路被秋水仙碱的抑制

陆宏伟，张亚飞，吉鸿，王晋龙，黎一鸣

西安交通大学医学院第二附属医院普通外科，陕西省西安市 710004

修回日期:2014-09-19 出版日期:2014-11-30 发布日期:2014-11-30
通讯作者: 黎一鸣，教授，博士生导师，西安交通大学医学院第二附属医院普通外科，陕西省西安市 710004
作者简介:陆宏伟，男，1974年生，陕西省宝鸡市人，博士，副主任医师，主要从事肝胆胰脾方面的研究。
基金资助:
陕西省社发攻关项目(2007k14-02(17))

Inhibitory effect of colchicine on transforming growth factor β1/Smads pathway in rat models of chronic pancreatitis

Lu Hong-wei, Zhang Ya-fei, Ji Hong, Wang Jin-long, Li Yi-ming

Department of General Surgery, Second Affiliated Hospital, School of Medicine, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China

Revised:2014-09-19 Online:2014-11-30 Published:2014-11-30
Contact: Li Yi-ming, Professor, Doctoral supervisor, Department of General Surgery, Second Affiliated Hospital, School of Medicine, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China
About author:Lu Hong-wei, M.D., Associate chief physician, Department of General Surgery, Second Affiliated Hospital, School of Medicine, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China
Supported by:
the Research Project of Social Development in Shaanxi Province of China, No. 2007k14-02(17)

摘要/Abstract

摘要：

背景：胰腺星状细胞内转化生长因子β1/Smads信号通路活化可能是导致胰腺组织纤维化的主要分子学机制。如能阻断这一通路，就可能抑制慢性胰腺炎组织的纤维化进程。

目的：探讨秋水仙碱对慢性胰腺炎模型大鼠转化生长因子β1/Smads通路的抑制作用。

方法：健康雄性SD大鼠随机分为慢性胰腺炎组及秋水仙碱干预组，慢性胰腺炎造模成功后，秋水仙碱干预组大鼠每日腹腔内注射秋水仙碱150 μg/ kg，慢性胰腺炎组则每日腹腔内注射等体积的生理盐水。3个月后取胰腺组织，苏木精-伊红染色观察胰腺组织的病理学改变，免疫组化观察胰腺组织转化生长因子β1表达，Western blot 法测定胰腺星形细胞内P-Smad2、P-Smad3、α-SMA蛋白表达水平。

结果与结论：苏木精-伊红染色结果显示：与秋水仙碱干预组相比，慢性胰腺炎组胰腺组织内腺体组织减少，而纤维结缔组织、炎细胞明显增多并取代胰腺腺体组织。免疫组化结果显示：秋水仙碱干预组胰腺组织内转化生长因子β1阳性表达级别和阳性细胞指数显著低于慢性胰腺炎组(P < 0.05)。Western blot 结果显示：慢性胰腺炎组胰腺星形细胞内P-Smad2/β-actin、P-Smad3/β-actin、α-SMA/β-actin表达明显低于秋水仙碱干预组(P < 0.05)。结果提示秋水仙碱可以抑制慢性胰腺炎大鼠转化生长因子β1/Smads信号通路及胰腺组织纤维化。因此，秋水仙碱可作为治疗慢性胰腺炎纤维化的一种新的候选方案。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织工程, 转化生长因子β1, P-Smad2, P-Smad 3, α-SMA, 慢性胰腺炎

Abstract:

BACKGROUND: Pancreatic stellate cells transforming growth factor β1/Smads signaling pathway activation is probably a main molecular mechanism of pancreatic fibrosis. If this pathway can be blocked, the progression of fibrosis of tissues with chronic pancreatitis will be inhibited.

OBJECTIVE: To study the inhibitory effect of colchicine on transforming growth factor β1/Smads pathway in chronic pancreatitis rat models.

METHODS: Healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into colchicines-treated group and chronic pancreatitis group. After successful establishment of rat models of chronic pancreatitis, the rats in the colchicines-treated group were intraperitoneally injected with colchicine 150 μg/kg daily. The rats in the chronic pancreatitis group were intraperitoneally injected with equal volume of physiological saline daily. Pancreatic tissues were collected after 3 months. Hematoxylin-eosin staining was used to observe histopathological changes of pancreatic tissue. Immunohistochemical staining was used to detect the expressions of transforming growth factor β1 in pancreatic tissue. Western blot assay was utilized to detect the expressions of P-Smad2, P-Smad3 and α-SMA protein in pancreatic stellate cells.

RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining results revealed that compared with the colchicines-treated group, glandular tissue had reduced, while fibrous connective tissue and inflammatory cells had increased obviously and replaced the pancreatic gland tissue in the chronic pancreatitis group. Immunohistochemical staining results demonstrated that the expression levels of transforming growth factor β1 and the index of positive cells were significantly lower in the colchicines-treated group than those in the chronic pancreatitis group (P < 0.05). Western blot assay results revealed that the results of P-Smad2/β-actin, P-Smad3/β-actin and α-SMA/β-actin in pancreatic stellate cells were significantly lower in the chronic pancreatitis group than those in the colchicines-treated group (P < 0.05). Results suggested that colchicine could inhibit the activity of transforming growth factor β1/Smads pathway and pancreatic tissue fibrosis in chronic pancreatitis rats. Therefore, colchicine can be used as a new candidate therapeutic scheme for chronic pancreatitis fibrosis.

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Key words: transforming growth factor beta 1, smad2 protein, smad3 protein, pancreatitis, chronic

中图分类号:

R318

陆宏伟，张亚飞，吉鸿，王晋龙，黎一鸣. 慢性胰腺炎模型大鼠转化生长因子β1/Smads通路被秋水仙碱的抑制[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(49): 8001-8006.

Lu Hong-wei, Zhang Ya-fei, Ji Hong, Wang Jin-long, Li Yi-ming. Inhibitory effect of colchicine on transforming growth factor β1/Smads pathway in rat models of chronic pancreatitis [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(49): 8001-8006.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 选取20只SD大鼠，分为慢性胰腺炎组及秋水仙碱干预组，每组10只，造模成功，实验过程无动物脱失，全部进入结果分析。

2.2 慢性胰腺炎大鼠模型的建立及秋水仙碱对慢性胰腺炎大鼠胰腺组织内纤维化的抑制作用 实验后3个月取大鼠胰腺组织制成冰冻切片，进行病理学观察。慢性胰腺炎组胰腺组织内腺体组织减少，而纤维结缔组织、炎细胞明显增多并取代胰腺腺体组织；而秋水仙碱干预组胰腺组织内腺体基本正常，但腺体间有纤维结缔组织增生及炎细胞浸润显著少于慢性胰腺炎组(图1)。

2.3 秋水仙碱能够抑制慢性胰腺炎大鼠胰腺组织内TGF-β1的表达 秋水仙碱干预组TGF-β1阳性表达级别为+，慢性胰腺炎组为+++；秋水仙碱干预组TGF-β1表达阳性细胞指数为11.92±6.57，慢性胰腺炎组为60.53±5.57。秋水仙碱干预组TGF-β1阳性表达级别和阳性细胞指数显著低于慢性胰腺炎组，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

2.4 秋水仙碱能够抑制慢性胰腺炎大鼠胰腺组织内P-Smad2、P-Smad3的表达 两组均在实验后3个月时取材，Western blot法测定胰腺组织中的P-Smad2、P-Smad3及β-actin，将所拍照片结果应用Image Pro图像分析软件处理后，分别得出其积分吸光度值，然后分别计算出两组P-Smad2、P-Smad3与β-actin积分吸光度之比值，数据经统计学处理并进行比较。结果所示，术后3个月时慢性胰腺炎组胰腺组织内P-Smad2/β-actin、P-Smad3/β-actin达到了1.02±0.38和0.87±0.26，而秋水仙碱干预组则分别为0.21±0.11和0.34±0.14，两组间差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.5 秋水仙碱能够抑制慢性胰腺炎大鼠胰腺组织内α-SMA的表达 Western blot法测定胰腺组织中的α-SMA及β-actin，将所拍照片结果应用Image Pro图像分析软件处理后，分别得出其积分吸光度值，然后分别计算出两组α-SMA与β-actin积分吸光度之比值，数据经统计学处理并进行比较。结果所示，术后3个月时慢性胰腺炎组胰腺组织内α-SMA/β-actin达到了1.86±0.73，而秋水仙碱干预组则为0.42±0.15，两组间差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

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引言

慢性胰腺炎是一种胰腺的破坏性炎性病变，可因胰腺组织纤维化而发生不同程度的腺体萎缩或胰管变形，部分或广泛的胰腺纤维化或钙化，最终将导致胰腺内、外分泌功能的部分或全部丧失^[1]。慢性胰腺炎的病因复杂，目前尚不完全清楚^[2-3]。临床表现为疼痛，体质量减轻，内、外分泌功能不全等，显著影响患者的生存质量，病死率高，一部分患者最终需要外科治疗^[4-6]。慢性胰腺炎发病机制复杂，至今尚未完全阐明，临床上亦缺乏有效防治胰腺纤维化的药物，目前只有蛋白酶抑制剂甲磺酸卡莫司他已在日本应用于临床治疗，很多研究大多还处于实验研究阶段^[7-9]。最近研究报道，胰腺组织中存在一种在形态和生物学特性上与肝星状细胞相似的肌成纤维样细胞——胰腺星状细胞，其细胞形态、结构及功能与慢性胰腺组织纤维化密切相关^[10-11]。研究发现胰腺受损时，在各种刺激因子作用下使胰腺星状细胞活化，导致细胞形态、功能发生变化，促使基质增生、胶原蛋白的大量生成及不规则沉积，最终导致胰腺纤维化的发生^[12-14]。

转化生长因子β1(transforming growth factor-, TGF-β1)是一种多功能细胞因子，通过在细胞表面与其受体结合形成复合物并进行信号传递，是目前较为明确的促纤维化生成因子^[15-16]。TGF-β的信号从细胞膜到细胞核需要通过细胞内的多种蛋白进行转导，其中研究最多的是Smad蛋白家族，活化的R-Smad与Co-Smad形成异聚复合体，并在核内聚集，核内Smad复合体可以直接或通过作用于Smad2、3，使其MH 2结构域的SSXS基序磷酸化，随后Smad2、3与Smad4形成异源寡聚体复合物移入核内。在核内通过直接与DNA结合、与其他转录因子协同作用及与转录复合活化物或复合抑制物结合调节靶基因转录^[17-22]。

胰腺星状细胞内TGF-β1/Smads信号通路活化可能是导致胰腺组织纤维化的主要分子学机制^[23-24]。作者设想：如能阻断这一通路，就应该能够抑制慢性胰腺炎组织的纤维化进程。研究表明，秋水仙碱具有抗纤维化的作用，能够抑制肝硬化、硬化性肾小球肾炎等纤维化病程，并具有安全性好，不良反应小，价格便宜的优点^[25-27]。目前秋水仙碱是否能够抑制胰腺炎纤维化进展还未见报道。文章拟通过动物实验的研究方法，采用苏木精-伊红染色，免疫组织化学染色，Western blot技术检测胰腺星状细胞内TGF-β1/Smads信号通路活化是否是导致胰腺组织纤维化的主要分子学机制，以及秋水仙碱是否能够阻断这一通路和抑制纤维化，从而探索一条防治慢性胰腺炎组织纤维化的新方法。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年5至12月在西安交通大学实验中心完成。

材料：

实验动物：成年健康雄性SD大鼠20只，体质量200-250 g，由西安交通大学医学院动物实验中心提供，实验过程中对动物处理符合动物伦理学标准。

实验方法：

慢性胰腺炎动物模型制备：将SD大鼠随机分为慢性胰腺炎组及秋水仙碱干预组，每组10只。两组大鼠乙醚麻醉后，经鼠尾静脉一次性注射0.8 mg/kg二氯二丁基酯(配制方法为：将400 mg DBTC溶解在400 mL无水乙醇中，然后再慢慢加入生理盐水100 mL，摇动至清亮)，之后大鼠正常饮食，保持昼夜生物节律；秋水仙碱干预组大鼠注射二氯二丁基酯后每日腹腔内注射秋水仙碱150 μg/kg，共注射3个月，慢性胰腺炎组则每日腹腔内注射等体积的生理盐水。两组大鼠均在3个月后处死，取胰腺组织分别用甲醛溶液及液氮冷冻固定保存。

苏木精-伊红染色观察胰腺组织的病理学改变：将胰腺组织用冰冻切片机作连续矢状面切片，片厚15 μm，隔5取1，贴于明胶预处理的载玻片上。具体染色步骤如下：①二甲苯透明2次各10 min。②无水乙醇2次各5 min。③梯度乙醇使切片至水：体积分数为95%乙醇3 min×2次，体积分数为80%乙醇3 min×2次，蒸馏水3 min。④苏木精染色 15 min，清水冲洗5 min。⑤1%盐酸乙醇分化数秒，清水冲洗3 min。⑥体积分数为70%乙醇2 min，体积分数为80%乙醇2 min。⑦伊红复染15 s，自来水冲洗2 min。⑧体积分数为95%乙醇2 min×2次，体积分数为100%乙醇 2 min×2次。⑨二甲苯2 min×2次。⑩中性树胶封固，通风处晾干。光学显微镜下观察慢性胰腺炎胰腺组织病理变化。染色结果判定：细胞核被苏木精染成蓝色，胞质被伊红染成粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。

免疫组化染色观察胰腺组织TGF-β1表达：对每只大鼠胰腺标本随机切取数张切片，采用SP法免疫组织化学染色检测TGF-β1表达。一抗(兔抗鼠TGF-β1多克隆抗体，Santa Cruz)过夜，工作浓度为1∶100，滴加山羊抗大鼠IgG二抗(Abbkine)、HRP工作液，DAB显色。光学显微镜下观察胰腺组织染色结果，免疫阳性细胞表现为胞浆呈棕黄色或棕褐色着色。光学显微镜400×镜下每张切片选取10个不同视野，运用病理图像分析仪Leica QWin图像分析软件，根据同一标准染色的灰度，计算出TGF-β1的平均灰度值。

Western blot法测定胰腺组织内P-Smad2、P-Smad3、α-SMA蛋白表达水平：取每只大鼠胰腺组织约100 mg，液氮中研磨，蛋白裂解液中匀浆，4 ℃、12 000 r/min离心(离心半径6 cm)10 min后收集上清液，BCA法测定蛋白含量后行SDS-PAGE电泳，半干法转至PVDF膜(Millipore，USA)，5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，加入一抗(1∶1 000) (兔抗鼠P-Smad2、P-Smad3、α-SMA多克隆抗体)，内参小鼠抗β-肌动蛋白抗体(1∶1 000)，4 ℃过夜，37 ℃下山羊抗大鼠IgG二抗(1∶2 000)孵育1 h，显色成像，Image-ProPlus软件进行图片条带灰度值分析。

主要观察指标：①胰腺组织的病理学改变。②胰腺组织转化生长因子β1表达。③Western blot法测定胰腺组织内P-Smad2、P-Smad3、α-SMA蛋白表达水平。

统计学分析：实验数据应用SPSS 16.0进行统计学分析，数据用x(_)±s表示，采用one-way ANOVA检验。以P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

慢性胰腺炎发病机制至今尚未完全阐明，临床上亦缺乏有效防治慢性胰腺炎胰腺纤维化的药物^[28]。最近研究发现，胰腺组织中存在一种胰腺星状细胞，其细胞形态、结构及功能与慢性胰腺组织纤维化密切相关。胰腺星状细胞占胰腺细胞总数的3.99%，位于腺细胞间，正常胰腺内星状细胞为静止状态，不具备促纤维化作用。胰腺损伤时各种刺激因子如氧化应激、细胞因子或基因表达调控等使其激活，细胞增生、高表达α-SMA和细胞外基质的主要组成成分如Ⅲ型、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白，加速慢性胰腺炎的纤维化，此过程近来已在动物模型及慢性胰腺炎患者的胰腺组织中得到证实^[29]。秋水仙碱具有抗纤维化的作用，能够抑制肝硬化、硬化性肾小球肾炎等纤维化病程。目前秋水仙碱是否能够抑制胰腺炎纤维化进展还未见报道。

本研究发现，TGF-β1能够刺激胰腺星状细胞的活化，促使其增殖，而秋水仙碱则起到相反地作用，促进细胞的凋亡，进一步揭示秋水仙碱阻滞TGF-β1/Smads 信号活化，说明秋水仙碱抑制胰腺星状细胞的活化可能是通过调节TGF-β1/Smads信号通路实现的。以上这些发现为更好的认识秋水仙碱的功能提供了基础。

秋水仙碱是抑制细胞有丝分裂的一个典型代表，可抑制DNA的合成，近年来，随着对其药理研究的深入，临床应用日趋广泛^[30]。其机制是封闭形成微管蛋白二聚体的部位，能抑制微管蛋白二聚合，干扰微管正常功能，阻止细胞有丝分裂时纺锤体形成，从而抑制细胞分裂，同时它能干扰神经细胞、纤维细胞、白细胞和精子中微管的生长形成高亲合力复合物，并抑制蛋白的聚合作用，限制了多形核淋巴细胞的趋化、吞噬活动^[31]。由于其具有亲脂性，便于进入细胞壁非极性膜内，降低膜的流动性，从而减少细胞微循环的黏度，并抑制细胞膜的变应性，最终通过抑制免疫球蛋白分泌。还可干扰肿瘤细胞的蛋白质代谢，抑制RNA多聚酶活力以及细胞膜类脂质的合成和氨基酸在细胞膜上的转运，从而诱导多种实体肿瘤细胞凋亡^[32]。孙嘉临等^[33]研究秋水仙碱能够通过使已经肝纤维化大鼠血清的γ-干扰素以及肿瘤坏死因子α浓度降低来达到抑制其肝脏炎症反应的作用，最后可以起到明显改善肝纤维化的效果。本研究中得出了相似的结果。秋水仙碱可能通过影响星状细胞的活化延迟胰腺炎纤维化的进展。最重要的是，实验首次报道了秋水仙碱在慢性胰腺炎中的可能间接作用。

TGF-β1是一种多功能细胞因子，通过在细胞表面与其受体结合形成复合物并进行信号传递，从而调节上皮细胞的生长和分化，刺激细胞基质的合成，抑制其降解，在组织修复和纤维化形成中发挥重要作用，是目前较为明确的促纤维化生成因子^[34]。人体内多种纤维化疾病中均有此因子参与，如特发性肺纤维化、肝硬化、肾小球肾炎等。转化生长因子β超家族成员与Ⅱ和Ⅰ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合而发挥其作用，激活转化生长因子β受体的信号从细胞膜到细胞核需要通过细胞内的多种蛋白进行转导，其中研究最多的是Smad蛋白家族，活化的R-Smad与Co-Smad形成异聚复合体，并在核内聚集，核内Smad复合体可以直接或通过其他DNA结合蛋白间接与DNA结合，从而调节靶基因的转录，如α-SMA的表达等^[35-36]。参与调节转化生长因子β的Smads包括Smad2，3和4，活化的转化生长因子β受体诱导Smad2和Smad3通过细胞膜表面的丝氨酸/苏氨酸激酶受体活化发生磷酸化，与Smad4结合成寡聚体进入细胞核，在细胞核直接应答转化生长因子β的转录功能^[37]。本研究发现，秋水仙碱可以阻滞Smad2，3和4，这和以往的报道相似。

在本研究中，苏木精-伊红染色显示：慢性胰腺炎组胰腺组织内腺体组织减少，而纤维结缔组织、炎细胞明显增多并取代胰腺腺体组织；而秋水仙碱干预组胰腺组织内腺体基本正常，但腺体间有纤维结缔组织增生及炎细胞浸润显著少于慢性胰腺炎组。这说明秋水仙碱对慢性胰腺炎大鼠胰腺组织内的纤维化具有较好的抑制作用。免疫组化结果显示：秋水仙碱干预组TGF-β1阳性表达级别和阳性细胞指数显著低于慢性胰腺炎组，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，充分说明秋水仙碱能够抑制慢性胰腺炎大鼠胰腺组织内TGF-β1的表达。实验采用Western blot技术，对胰腺星形细胞内P-Smad2、P-Smad3、α-SMA蛋白表达变化进行检测，结果表明，与慢性胰腺炎组相比，秋水仙碱干预组P-Smad2、P-Smad3、α-SMA的表达水平明显被抑制(P < 0.05)。因此，作者考虑秋水仙碱通过TGF-β1/Smads信号通路来阻滞星状细胞活化，但这需要进一步的研究来证实。

课题组前期研究结果显示秋水仙碱可以发挥抗胰腺星状细胞增殖和促凋亡效应^[38]：利用秋水仙碱干预TGF-β1诱导的胰腺星状细胞，MTT法检测细胞增殖能力，免疫荧光法检测胰腺星状细胞活化状态，Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡情况，RT-PCR和Western blot检测TGF-β1受体、Smads表达变化。结果显示：与对照组相比，TGF-β1可诱导胰腺星状细胞增殖(P < 0.05)，降低凋亡率(P < 0.05)；而秋水仙碱作用24 h后胰腺星状细增殖明显减低(P < 0.05)，凋亡明显增加(P < 0.05)；抑制细胞的增长呈剂量依赖性。RT-PCR和Western blot检测显示秋水仙碱成功阻断TGF-β1/Smads通路的活化，这可能是通过抑制TGF-β1/Smads信号通路的活化及其下游靶基因的表达而实现的。本实验中，通过动物实验再次证实秋水仙碱可以抑制慢性胰腺炎大鼠TGF-β1/Smads信号通路及胰腺组织的纤维化，因此作者认为秋水仙碱可作为治疗慢性胰腺炎纤维化的一种新的候选方案。

慢性胰腺炎模型大鼠转化生长因子β1/Smads通路被秋水仙碱的抑制

Inhibitory effect of colchicine on transforming growth factor β1/Smads pathway in rat models of chronic pancreatitis

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