构建人基质金属蛋白酶1基因重组腺病毒载体及体外降解Ⅲ型胶原的检测

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.49.022

摘要/Abstract

摘要：

背景：基质金属蛋白酶1能够降解以Ⅰ型胶原为主的细胞外基质，有望逆转纤维化组织。

目的：利用Gateway技术构建含人基质金属蛋白酶1基因的重组腺病毒载体，并观察其在体外降解Ⅲ型胶原蛋白的能力。

方法：从携带人基质金属蛋白酶1基因片段的pcDNA3.1质粒中PCR扩增出人基质金属蛋白酶1基因片段，双酶切连接入门载体pENTERTM 1A形成入门克隆，利用LR反应与目的载体pJTI^TM R4 Dest CMV-N-EmGFP pA Vector同源重组构建表达克隆pAd- hMMP-1-eGFP。经PacⅠ酶切线性化转入HEK293A细胞包装获得重组腺病毒Ad-hMMP-1-eGFP，RT-PCR及Western-Blot法分别检测目的基因与蛋白表达。细胞分为3组：①空白对照组：HEK293A细胞。②AD-EGFP组：Ad-eGFP感染HEK293空白对照组。③AD-HMMP1-EGFP组：Ad-hMMP-1-eGFP感染HEK293空白对照组。分别加入相同含量Ⅲ型胶原蛋白，在24，48，72 h用ELISA试剂盒检测Ⅲ型胶原蛋白水平。

结果与结论：经酶切及测序鉴定证实入门载体和目的载体中均含有人基质金属蛋白酶1目的基因。重组腺病毒Ad- hMMP-1-eGFP感染293A细胞后4 d观察到绿色荧光表达，10 d荧光强度达最高，12d收集病毒液；测定病毒滴度为4.84×10¹⁰ PFU/mL，Western-Blot法检测目的蛋白高效表达。随时间延长，空白对照组和AD-EGFP组胶原蛋白含量无明显变化，AD-HMMP1-EGFP组24，48，72 h胶原蛋白降解率分别为24%，56%，81%，与空白对照组、AD-EGFP组相比AD-HMMP1-EGFP组降解胶原效果显著(P < 0.01)。利用Gateway技术成功构建含人基质金属蛋白酶1基因的重组腺病毒载体，与传统构建方法相比具有高效性和特异性，分泌基质金属蛋白酶1检测其降解Ⅲ型胶原蛋白效果显著。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织工程, 人基质金属蛋白酶1基因, Gateway技术, 重组腺病毒载体, Ⅲ型胶原

Abstract:

BACKGROUND: Matrix metalloproteinase-1 can degrade extracellular matrix, which is mainly collagen type I, and has the potential to reverse fibrosis tissue.

OBJECTIVE: To construct the recombinant adenovirus vector containing human matrix metalloproteinase-1 (hMMP-1) gene with GatewayTM Clone Technology, and observe the capacity of degrading collagen type III in vitro.

METHODS: The gene hMMP-1 was amplified by using PCR from the pcDNA3.1 plasmid and was cut down by the double endonuclease. The linear gene fragment was connected to the entry vector pENTER^TM 1A. Then the entry clone and the destination vectors pJTI™ R4 Dest CMV-N-EmGFP pA Vector recombined using the LR reaction to form the expression clone pAd-hMMP-1-eGFP. The linear pAd-hMMP-1-eGFP cut down by endonuclease Pac I was transfected into HEK293A cells to packaging the Ad-hMMP-1-eGFP. The transfected situation was observed under a fluorescence microscope, the target protein expression was detected by western-blot assay and RT-PCR. Cells can be divided into three groups: blank control group: HEK293A cells, AD-EGFP group: HEK293A cells were infected by Ad-eGFP, AD-HMMP1-EGF group: HEK293A cells were infected by Ad-hMMP1-eGFP and collagen type III. The content of collagen type III was detected by ELISA kits after 24, 48 and 72 hours.

RESULTS AND CONCLUSION: It was confirmed that the entry vector and the destination vector both contained hMMP-1 target gene by restriction analysis and sequencing. The green fluorescent protein was observed in the 293A cells transfected by the Ad-hMMP-1-eGFP at 4 days. The fluorescence intensity was the highest at 10 days. The virus was collected at 12 days, the viral titer was determined as 4.84 × 10¹⁰ PFU/mL, the target protein was efficient expression via western-blot assay. Blank control group and AD-EGFP group had no obvious change of collagen content with the extension of time. The rate of collagen degradation in AD-HMMP1-EGFP group was 24%, 56% and 81% respectively at 24, 48, 72 hours. AD-HMMP1-EGFP group degraded collagen significantly compared with the other two groups (P < 0.01). The recombinant adenovirus vector containing hMMP-1 was successfully constructed by using the Gateway technology, this method was more efficient and specific than with the traditional methods. The hMMP1 degraded collagen type III significantly in vitro.

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Key words: matrix metalloproteinase-1, virus, collagen type III

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 1

2.1 目的基因的获取及测序结果 从携带人基质金属蛋白酶1的pcDNA3.1质粒中PCR扩增出约1 428 bp大小基因条带(图1)，经测序鉴定所获序列与GenBank报道序列完全一致。

2.2 入门克隆的构建及鉴定结果 经限制性内切酶 EcoⅠ和XhoⅠ双酶切基因片段人基质金属蛋白酶1和约3 891 bp的pENTER^TM 1A质粒后，成功连接构建入门克隆质粒pENTER^TM 1A-hMMP-1，其中第4泳道为阳性结果，双酶切后产物电泳条带大小分别为1 417 bp和3 891 bp，测序结果显示与理论完全相符(图2)。R

2.3 表达克隆的构建及鉴定结果 利用LR反应体外重组入门克隆pENTER^TM 1A-hMMP-1和目的载体pJTI^TM R4 Dest CMV-N-EmGFP pA Vector后，转化入感受态大肠杆菌Stbl3，挑选阳性菌落进行PCR鉴定，引物为pAd- hMMP-1-f：GAA CCC ACT GCT TAC TGG CTT；pAd- hMMP-1-r：TCG AGA CCG AGG AGA GGG T；产物大小2 951 bp；与第3泳道凝胶电泳条带结果相符，送交测序鉴定结果完全正确(图3)。

2.4 重组腺病毒包装及鉴定结果 经PacⅠ酶切线性化腺病毒质粒pAd- hMMP-1-eGFP并转入HEK293A细胞后，4 d左右在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白表达，10 d左右荧光强度达到最高(图4)。

将收集到的目的蛋白进行Western blot鉴定，结果证实人基质金属蛋白酶1蛋白在重组腺病毒中高效表达(图5)。

2.5 腺病毒滴度测定(TCID50)结果 将腺病毒按梯度浓度感染96孔板中HEK293细胞后，5 d左右细胞开始出现病变状态CPE(Cytopathic effect)，逐渐皱缩变小，形态不规则，并且细胞间缝隙增大，由贴壁状态变为悬浮，10 d后计数出现CPE的孔数(表1)，用Reed-Muench两氏法计算病毒滴度。

lgTCID₅₀=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数，即TCID₅₀=10^-^9.84/0.1 mL，所得病毒滴度=4.84×10¹⁰ PFU/mL。

2.6 ELISA试剂盒检测人基质金属蛋白酶1体外降解Ⅲ型胶原蛋白能力 细胞培养24，48，72 h后，收集含胶原蛋白细胞培养基上清，离心后用Ⅲ型胶原蛋白ELISA检测试剂盒分别进行检测，结果显示空白对照组、AD-EGFP组中胶原蛋白含量无明显变化，而AD-HMMP1-EGFP组中胶原蛋白降解率显著高于对照组(P < 0.01)，并且随时间延长胶原蛋白降解率在逐渐增加(表2)。

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引言

基因治疗是指将外源遗传物质(DNA或RNA)导入人体细胞以达到治疗疾病的目的。早在20世纪90年代，美国科学家Anderson等就开始进行了首例基因治疗的临床试验。基因载体的选择是基因治疗中的关键环节，其中反转录病毒载体因繁殖滴度低，细胞谱窄，靶向性差和外源基因容量小且会导致插入突变而引起细胞癌变等缺点，在临床应用中受到很大限制^[1-2]。相反，腺病毒载体是目前研究和开发应用的热门领域，大量研究表明其优点如下^[3-4]：①病毒滴度高，易于体外培养和纯化。②外源基因容量大，可以插入37 kb左右大片段。③可有效转染不同类型的人体组织细胞，包括非分裂期细胞。④安全性较高，重组腺病毒不整合到宿主细胞基因组中，只在基因组外瞬时表达，不引起插入突变。⑤重组腺病毒容易进行体外有效转染，并使其在细胞内有效表达成活性蛋白。

基质金属蛋白酶家族是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，在细胞外基质的生理性和病理性重塑(例如肿瘤侵袭、创伤愈合、胚胎发生、血管生成等)中发挥重要作用^[5-6]。其中基质金属蛋白酶1属于间质胶原酶类，主要消化Ⅰ、Ⅲ型胶原和蛋白多糖。基质金属蛋白酶1 在体内可由肝星状细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等分泌，但是分泌水平极低，一般很难检测，在创伤、炎症等因素刺激下分泌水平略有升高^[7]。通过传递外源基质金属蛋白酶基因来扭转纤维化肝脏中基质金属蛋白酶活性太低和基质金属蛋白酶组织抑制物太多之间的不平衡，从而治疗肝纤维化是可行的。有人使用腺病毒载体将编码人类基质金属蛋白酶1的DNA传递到硫代乙酰胺(TAA)诱导的肝纤维化大鼠模型中，观察到胶原纤维降解增加，大鼠肝纤维化程度减轻。其可能机制是由于基质金属蛋白酶1的过表达导致纤维胶原的降解，影响细胞外基质和肝细胞之间的相互作用，直接刺激肝细胞增殖^[8]。

Gateway技术是目前通用的克隆和亚克隆DNA序列的的一种高效系统，其利用λ噬菌体DNA在自然条件下可与其宿主大肠杆菌DNA发生位点特异性重组和可逆切割分离，从而快速实现目的基因从入门载体(Entry Vector)到目的载体(Destination Vector)的相互转移，Gateway技术重组位点包括attB、attP、attL和attR位点，先后通过BP反应与LR反应发生位点重组，快速、高特异性地将异源DNA片断克隆到不同的载体中。与传统酶切构建载体比较，具有需时短、操作简单、效率高易等特点^[9-10]。实验首次通过Gateway技术构建含人基质金属蛋白酶1基因重组腺病毒，为下一步研究基质金属蛋白酶1联合干细胞治疗肝纤维化奠定实验基础。

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材料方法

设计：单一样本观察、分组对照、细胞学实验。

时间及地点：实验于2013年2至9月在解放军成都军区总医院中心实验室完成。

材料：

实验方法：

获取目的基因人基质金属蛋白酶1：利用PCR反应扩增目的基因，底物为携带人基质金属蛋白酶1基因片段的pcDNA3.1质粒，设计引物序列中加入EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶

切位点；下划斜体为限制性内切酶位点，其前为保护碱基，扩增片段长度为1 428 bp。PCR反应参数为：98 ℃， 3 min；98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s；共30个循环；72 ℃，5 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳回收后送交测序。引物序列如下：EcoR I-MMP1-F：5’-CGC GAA TTC ATG CAC AGC TTT CCT CCA CTG-3’；MMP1- XhoⅠ-R：5’-CGG CTC GAG TCA ATT TTT CCT GCA GTT GAA CC AG-3’。

构建入门克隆载体：用限制性内切酶EcoR Ⅰ和 XhoⅠ双酶切上述基因片段和入门载体pENTER^TM 1A，经琼脂糖凝胶电泳回收后在T₄连接酶作用下16 ℃过夜，转化连接产物到感受态大肠杆菌stbl3，双酶切鉴定筛选阳性克隆，抽提阳性克隆质粒送交测序。

构建表达克隆：上述入门克隆载体经测序后取1 μL (17.49 ng)，目的载体pJTI™ R4 Dest CMV-N-EmGFP pA Vector 2 μL(242.13 ng)，LR clonase 1 μL，加入TE buffer至5 μL体系，在25 ℃下LR反应过夜，加入蛋白酶K终止反应，转化LR反应产物到感受态大肠杆菌Stbl3，菌落PCR鉴定阳性克隆，送交阳性克隆测序，命名为pAd- hMMP-1-eGFP。　

重组腺病毒包装及鉴定：接种HEK293A细胞到六孔板内，含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基， 37 ℃，体积分数5% CO₂培养至80%-90%融合度备用，转染前换成1 mL新鲜的含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。利用PacⅠ酶切线性化腺病毒质粒pAd- hMMP-1-eGFP，并进行回收。在lipofectamine 2000脂质体介导下转化入HEK293A细胞；7 d后细胞开始出现病变时收集粗毒，13 d左右80%细胞出现病变时收集细胞和上清，37 ℃/-80 ℃ 反复冻融3次以裂解细胞释放病毒，4 ℃，2000×g离心10 min收集含有Ad-hMMP-1-eGFP病毒颗粒的上清。定义该初次包装好的病毒代数为P0，重新感染HEK293A细胞继续扩增病毒，获得高滴度P1代重组病毒。用P1代病毒感染HEK293A细胞后，通过反复冻融细胞裂解法收集总蛋白，经BSA法测定蛋白浓度后作Western blot鉴定。

腺病毒滴度测定(TCID₅₀)：接种100 μL对数生长期HEK293A细胞至96孔板(10⁴/well)，体积分数10%胎牛血清高糖培养基培养过夜。用有限稀释法稀释病毒，取7个稀释度(10^{-12^-⁶)感染96孔板中HEK293A细胞，每孔0.1 mL，每个浓度10个复孔，最后一排加入0.1 mL DMEM培养基作为空白对照，37 ℃，体积分数5% CO₂恒温饱和湿度培养箱内培养10 d。10 d后观察细胞，计数出现细胞病变状态CPE孔数，用Reed-Muench两氏法计算病毒滴度。}-10

ELISA试剂盒检测人基质金属蛋白酶1体外降解Ⅲ型胶原蛋白能力：取生长状态良好HEK293A细胞接种到六孔板内，每孔1×10⁵个细胞，培养24 h待细胞基本融合后，将Ad-eGFP(AD-EGFP组)与Ad-hMMP1-eGFP (AD- HMMP1-EGFP组)按相同感染复数(MOI)100感染HEK293A细胞，并设空白对照组HEK293A细胞(空白对照组)。4 h后弃去培养基，3组细胞中分别加入含人Ⅲ型胶原蛋白1.0 μg的体积分数10%胎牛血清高糖培养基继续培养。在培养24，48，72 h时，分别收集各组细胞培养基上清液，1 000×g离心10 min去除颗粒和聚合物。用人Ⅲ型胶原ELISA 检测试剂盒进行检测，并按说明绘制标准曲线。

主要观察指标：人基质金属蛋白酶1基因、入门克隆及表达克隆载体的鉴定，重组腺病毒人基质金属蛋白酶1体外降解Ⅲ型胶原蛋白能力观察。

统计学分析：计量资料以x(_)±s表示，应用SPSS 13.0统计软件进行t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

肝纤维化,是肝脏在各种致病因子(病毒、酒精、免疫损伤等)持续刺激下^[11]，导致肝内结缔组织异常增生，细胞外基质异常过度沉积所致，是慢性肝病的病理基础和发展为肝硬化的必经之路。原位肝移植是迄今治疗肝硬化最有效的方法，但因存在供肝匮乏、创伤大、费用昂贵、且需终身使用免疫抑制剂等，其临床的广泛应用受到限制^[12-13]，目前对肝纤维化的逆转仍无特效药物。在纤维化肝组织中，基质金属蛋白酶及其组织抑制物之间水平失衡，基质金属蛋白酶水平极度降低，而基质金属蛋白酶组织抑制物水平显著升高，细胞外基质过度沉积，再生肝细胞不能沿正常肝小叶结构排列，是肝纤维化形成的主要原因^[14]。因此，增加细胞外基质降解是逆转肝纤维化甚至肝硬化的一个重要机制。

基质金属蛋白酶是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因其发挥生物学活性需要Ca²⁺、Zn²⁺等金属离子辅助而得名，主要生物学功能是降解细胞外基质成分，是迄今为止发现的惟一能分解纤维类胶原的酶，几乎能降解除多糖以外的所有细胞外基质成分，在肝内主要由肝星状细胞和Kupffer细胞表达分泌。目前已发现28种基质金属蛋白酶，分别编号为mmp1-28。根据其作用底物和结构特征可分为6大类。主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖，可由成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞、中性粒细胞等分泌，是一种最早从脊椎动物中克隆出cDNA基因并纯化为蛋白的胶原酶。

基质金属蛋白酶家族都具有相似的结构特点，而基质金属蛋白酶1同样具有以下结构：疏水信号肽序列、前肽区、催化活性区和羧基末端区。疏水信号肽区引导细胞质合成的多肽转移到内质网,在其成熟后部分被降解；前肽区主要作用是保持酶原稳定，通过阻断酶的Zn²⁺活性中心与底物的结合,使酶原免于激活;而当该区域被外来酶切断后则可使酶原激活；催化活性区由5对高度扭曲的β-折叠、3个α-螺旋、和一个8字环组成，封闭了5个金属离子位点，包括3个Ca²⁺和2个Zn²⁺位点。其中一个Zn²⁺具催化活性,通过3个His残基束缚在序列 HELGHXXGXX中, 是酶活性所必需的辅助因子；另一个Zn²⁺为结构性位点；羧基末端区含有200多个残基，包含4个决定底物特异性的重复Cys残基序列^[15]。基质金属蛋白酶1又称人成纤维细胞胶原酶，是人类最先完成蛋白质纯化和cDNA克隆的脊椎动物胶原酶，可降解所有的间质胶原酶原型。基质金属蛋白酶1 编码基因位于人染色体11q22.2-22.3，含有10个外显子和一个开放读码区，以单肽形式合成后作为酶原分泌至细胞外，有 57 ku的非糖基化和61 ku的少量糖基化两种形式，在正常成人组织中，基质金属蛋白酶1的水平通常较低，主要降解以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的细胞外基质成分^[16]。Murawaki等^[17]研究发现肝纤维患者血清中的基质金属蛋白酶1的活性与Ⅰ、Ⅲ型胶原呈显著负相关, 表明基质金属蛋白酶1活性在肝纤维化过程中是逐渐降低的。刘天会等^[18]将基质金属蛋白酶1基因质粒转染人肝星状细胞，通过其高表达基质金属蛋白酶1，观察到可显著抑制Ⅲ型胶原蛋白的表达, 其机制主要通过发挥其酶活性降解Ⅲ型胶原蛋白, 而不影响Ⅲ型胶原基因水平的表达。

基因传递方法可分为病毒和非病毒载体法两大类。病毒载体是来自于病毒的RNA或DNA基因组，可作为定向或非定向载体。其中来自于RNA病毒的反转录病毒载体，可分为癌基因反转录病毒，慢病毒，泡沫病毒；来源于DNA的病毒载体中，应用较广的是腺病毒(AD)和腺相关病毒(AAV)。任何类型的病毒载体都有各自的优缺点，反转录病毒载体能够长时间稳定转染，但转导效率较低，并且有导致基因突变的危险^[2^，^19]。腺病毒载体的优点是在体外和体内都能非常有效的转染靶细胞，同时其免疫原性和毒性较低，在临床有较大的应用空间^[20-23]。AAV载体，一种来自于人非致病性的细小病毒，目前已被作为治疗多种遗传性疾病的载体。腺病毒载体作为基质金属蛋白酶基因的载体来治疗肝纤维化的疗效已被证实^[24]。然而，腺病毒载体要进一步应用于临床仍有许多问题亟待解决，如免疫原性、毒性以及转染细胞可能发生的诱变等。非病毒载体可避免病毒载体应用的一些问题，包括：①裸DNA的物理传递方法，如电穿孔法、基因枪(gene gun)、超声波等。②化学载体如阳离子聚合物和脂质体^[25]。有报道将基质金属蛋白酶1的编码质粒DNA通过阳离子化明胶凝胶作为载体，治疗链霉素诱导的肾纤维化^[26]。为了方便质粒DNA持续释放，将可生物降解的凝胶制作为阳离子化的明胶微球，通过凝胶的逐渐降解缓慢释放出质粒DNA。这种通过传递基质金属蛋白酶质粒DNA的方法来治疗晚期肝纤维化也许会成为现实。

本实验采用腺病毒为载体，通过Gateway技术将外源基因基质金属蛋白酶1导入，与传统构建系统相比，省去了冗长的酶切步骤，操作简单且病毒滴度较高，酶切PCR及基因测序鉴定各步骤中目的基因序列完全正确，重组腺病毒中可检测到目的基因及蛋白高效表达，并且在体外检测分泌基质金属蛋白酶1蛋白活性较高，降解Ⅲ型胶原蛋白能力强。因此，本实验通过Gateway技术成功构建含人基质金属蛋白酶1基因重组腺病毒，为后续基质金属蛋白酶1基因体内传递治疗肝纤维奠定了实验基础。