组织工程化软骨修复界面整合的体外模型

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.27.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：随着组织工程学的发展，自体软骨细胞移植技术经常被用来修复软骨缺损，整合不良是导致修复失败的原因之一。许多体外模型被用来进行这方面的研究。
目的：建立一种组织工程化软骨修复界面整合的体外实验模型并评价其效果。
方法：制备猪体外软骨整合模型，获得21个软骨环，18只琼脂糖凝胶覆盖的软骨环设为琼脂糖凝胶组，剩余3个做无琼脂糖对照组，分别植入分离的软骨细胞，观察近期软骨环边界细胞漏出情况，分别在1，2，4周做切片、染色并行组织学观察，测量新生软骨平均面积并进行比较。
结果与结论：无琼脂糖对照组由于软骨细胞早期从软骨环底部漏出，未能在软骨环中形成软骨细胞聚集，所以未做后期处理，而琼脂糖凝胶组则未发生。琼脂糖凝胶组1，2，4周做切片并行固定后组织切片分别用苏木精-伊红染色、阿利新蓝、番红O、Ⅱ型胶原免疫组化染色，移植的软骨细胞在软骨环内不断增殖，并且产生细胞外基质。在第1，2周的孵育中，新生软骨的面积明显增大，到第4周时，面积也有进一步增加，但是第2-4周的面积增加，差异无显著性意义(P > 0.05)。模型成功模拟了自体软骨细胞移植修复关节软骨缺损的体外整合过程，未来可应用于软骨整合及软骨组织工程的机制研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 软骨修复, 自体软骨植入, 体外模型, 整合, 细胞移植

Abstract:

BACKGROUND: With the development of tissue engineering, autologous chondrocyte implantation is often used to repair cartilage defects. And poor integration is one of the common reasons that lead to failure repairing. Many models in vitro are used for related studies.
OBJECTIVE: To develop an interface integrated model of tissue engineered cartilage repair in vitro and to evaluate the effect.
METHODS: Cartilage integration model in vitro was established in pigs. Totally 21 cartilaginous rings were obtained and divided into agarose gel group (n=18) and control group (n=3). In agarose gel group, cartilage rings were covered with agarose gel. Chondrocytes were separated and implanted into the ring. The leakage of cells around the cartilage rings was observed. The sections were stained for histological observation at 1, 2, 4 weeks. The average area of neochondrocytes was measured and compared.
RESULTS AND CONCLUSION: The results from the control group were not processed, because there was no chondrocyte aggregate formation in the center of the explant ring due to earlier chondrocyte leakage outside the explant. While no chondrocytes were found outside the explant ring in the agarose gel group. Tissue sections of the agarose gel group were stained by hematoxylin and eosin, alcian blue, Safranin-O and collagen type II immunohistochemistry at 1, 2, 4 weeks. Neochondrocytes proliferated within cartilage ring, and produced extracellular matrix. After 2 weeks of incubation, these inserted chondrocytes were significantly increased. There was no statistically significant increment between 2 weeks and 4 weeks (P > 0.05), although the area was further increased by 4 weeks. This model provides a convenient simulation of the cartilage integration process in vitro and has a potential application in studies of cartilage integration and cartilage tissue engineering.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: tissue engineering, cartilage, chondrocytes, cell transplantation, cartilage, articular

中图分类号:

R318

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Zhou Jian-xin, Gao Feng, Gui Jian-chao, Yin Zhao-wei, Yang Xiao-fei, Xu Yang, Lu Yi-ming, Li Yang, Jiang Yi-qiu. An integrated model for tissue engineered cartilage repair in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(27): 4324-4329.

图/表（结果） 3

2.1 早期光镜下观察无琼脂糖对照组中，将软骨环直接置于培养板底部，软骨细胞加入软骨环中间空，在隔夜培养后可见沿软骨环外围大量软骨细胞溢出(图3A)。此外，软骨环可以在培养液或培养皿底部经常移动。相反的，当软骨环被固定在琼脂糖凝胶上时，在软骨环外围未见到软骨细胞溢出(图3B)，软骨环中心的软骨细胞有很高的浓度(图3C)。本模型有效防止植入软骨细胞的溢出。

2.2 第1，2，4周时软骨组织学观察在培养1周时，软骨细胞的集聚是非常少的，软骨细胞间有较大的空隙(图4A1、B1、C1、D1)。培养2周后，集聚的软骨细胞开始增殖，从而产生更多的细胞外基质(图4A2、B2、C2、D2)。相比于1周时，集聚细胞之间的空隙和细胞与软骨环之间的空隙都充满了增殖的软骨细胞和细胞外基质。

培养至第4周时，由于软骨细胞分泌更多的细胞外基质，空白区域已很少见，软骨细胞与软骨环之间的空隙进一步减少(图4A3、B3、C3、D3)。软骨细胞的集聚显得越来越同质和均匀(图4B3、C3)。

在培养4周后，可以在软骨环表面见到软骨细胞的死亡。新生软骨中的软骨细胞是活的，但是其所分泌的细胞外基质仍无法和软骨环中的相比。新生软骨并不能充分的和软骨环相整合，尽管新生软骨和环之间间或可以出现部分整合，却总能在新生软骨和环之间见到空白区域(图4A3、B3、C3、D3)。免疫组化显示新生软骨中Ⅱ型胶原的沉积渐增多(图4D1、D2、D3)。可见琼脂糖凝胶组中移植软骨细胞有效增殖，并持续分泌Ⅱ型胶原，维持了软骨细胞的特性。无琼脂糖对照组由于软骨环没有固定在琼脂糖凝胶上，导致在早期软骨细胞溢出软骨环，未能在软骨环中心形成软骨细胞的聚集，所以未作进一步的处理。

2.3 同时间点新生软骨与软骨环内孔之间的平均面积的比较为了定量移植软骨细胞形成的新生软骨的大小，将苏木精-伊红染色的组织切片用组织形态学测定法分析。新生软骨与软骨环内孔之间的平均面积比随着培养时间逐渐增大(表1)。

在第1周的孵育中，加入的软骨细胞逐渐聚集形成一个向心性的集聚，通过本研究已定的软件测量空白区域的面积，发现第1周新生软骨的面积最小。孵育至第2周时，新生软骨面积增大了约25.85%，第2周新生软骨的面积较第1周有显著的增加(P < 0.05)，虽然第4周时，新生软骨面积也有进一步增大，但第2-4周的新生软骨面积增大差异已没有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

实验中设计的模型巧妙地设计软骨缺损的模型，并将移植软骨植入，运用琼脂糖的低熔点特性，将底部封闭，使软骨细胞无法外溢。并且在体外实验的模型中，可以更精确的控制影响因素，对单因素或可控的多因素进行调节，以进一步发现软骨修复的相关机制。实验中使用的低熔点琼脂糖凝胶作为一种天然多糖材料，具有细胞无毒性、降解缓慢、材料成本低等特点^[8]，可以形成在37 ℃左右稳定的水凝胶结构，随着琼脂糖浓度的增加，所制备的水凝胶的弹性模量便会相应增大几个数量级。在本模型中，利用了琼脂糖熔化和凝胶化温度的差异成功的将软骨环锚定在培养皿的底部，从而封闭了软骨环凹凸不平的底面，有效的阻止了软骨细胞从软骨环底部溢出。本实验中配置的1%琼脂糖只作为封闭软骨环底部材料，未与软骨细胞进行混合做细胞支架，对软骨细胞的增殖、整合无生物学影响。

即使是在有利软骨生长的环境下，软骨细胞仍然无法在7次传代后保持自身的功能^[9-11]。在用软骨细胞作单层培养时软骨细胞会向成纤维样细胞去分化，这些成纤维样细胞能分泌Ⅰ型胶原，却丧失了Ⅱ型胶原及蛋白聚糖核心蛋白基因的表达^[12-13]。这些成纤维样细胞(去分化的软骨细胞)是软骨修复失败的一个重要因素^[14-16]。为了解决软骨细胞的这种反分化问题，人们开始着手使用生长因子、软骨细胞的三维培养^[17-20]、高密度细胞接种，甚至一些学者更多地关注另一种种子细胞-关节软骨前体细胞^[21-24]。

实验设计的模型中接种细胞无漏出，通过琼脂糖凝胶组第1，2，4周时的组织学观察发现，随着时间推移，移植软骨有效地进行增殖，并表现出同质性。与宿主软骨环部分连接，并且分泌的Ⅱ型胶原含量明显增多，证明移植软骨可有效增殖、整合，并保留软骨细胞分泌Ⅱ型胶原的能力，亦可证明该模型保持移植软骨细胞的高密度接种，防止软骨细胞成活难以维持而凋亡。生长因子调控软骨细胞的增殖、分化、迁移等生物学行为，一直是软骨组织工程修复的研究热点。血小板衍生生长因子、转化生长因子β、胰岛素样生长因子已经被证明可以促进软骨细胞增殖并分泌功能性的细胞外基质^[25]，并且，两种及两种以上因子联合能更好的使得软骨细胞分泌几倍于单个生长因子产生的细胞外基质^[26]。在该模型中未使用任何生长因子，因此可利用本模型进一步实验，有效的检测各种细胞因子对软骨细胞修复的影响。

实验中琼脂糖凝胶组第1、2周时，移植软骨与宿主软骨间的间隙明显减小，这表明第1周和第2周可能是组织形成的关键时期。尽管至第4周时，间隙仍在不断减小，但已无显著性意义。某些学者发现其整合过程始于孤立的软骨细胞和整合界面的接触，逐步迁移到周围软骨组织中，并与软骨细胞和整合界面微环境相关^[27]，本研究中这种软骨细胞与软骨环间隙的始终存在，也说明软骨整合的机制需要进一步去阐明。本模型所能展示的软骨整合的特殊过程中仍然存在许多未知因素，这些因素仍待解决。尽管如此，能成功模拟关节软骨整合过程仍然是临床手术成功治疗软骨损伤的第一步。

同其他体外模型一样，本模型也同样存在局限性，如尚不能模拟软骨与软骨下骨之间的整合，培养条件对软骨整合的结果具有重大的影响，其他来源的软骨在本模型中需要做进一步测试以优化培养条件等。总而言之，实验提供了一种良好的模型来研究组织工程软骨与宿主软骨间的整合。本体外模型在研究解决软骨的微结构和成软骨细胞在软骨修复中的作用中非常的实用，可以得到广泛应用。

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材料方法

设计：细胞学体外观察。

时间及地点：实验于2012年1月至2013年12月在南京医科大学附属南京医院骨科实验室完成。

材料：

实验动物：健康2月龄家猪，雄性，由南京医科大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK(苏)2008-0007。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

实验方法：

软骨整合模型的建立：将2月龄家猪消毒麻醉，股动脉放血处死，无菌条件下取下猪的双侧下肢，放入3%碘伏中消毒30 min，再用体积分数75%乙醇脱碘3次，将消毒后的肢体放入无菌台中，用手术刀打开膝关节腔，切取关节软骨备用。用打孔器先在取下的整块关节软骨取直径6 mm的软骨块，再用直径3 mm的打孔器在取下的软骨块中心打孔，一共取出软骨环21枚。

软骨细胞培养：将剩余的软骨块用加入含有0.25%链霉蛋白酶的DMEM培养液浸泡1 h，然后用手术刀片将软骨切碎，将切碎的软骨用0.4%的Ⅱ型胶原酶浸泡消化过夜，第2天将消化液用200 μm孔径的细胞过滤器过滤，充分洗涤细胞后，用红细胞计数板进行细胞计数，将软骨细胞浓缩至约1×10¹¹ L^-1备用。

分组及干预：取18枚软骨环放入培养液(DMEM+体积分数10%胎牛血清+200 mmol/L谷氨酰胺+50 mg/L(抗坏血酸、青霉素、链霉素)于37 ℃，体积分数5%CO₂培养备用。取3个6孔的培养板，将低熔点的琼脂糖凝胶1%溶入的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，再放入高压蒸汽中消毒，等琼脂糖冷却到37 ℃时，将其加入培养皿中，覆盖培养皿底部厚度大概1 mm，同时迅速将之前准备好的软骨环放置到培养皿中心位置，然后将培养皿放入4 ℃冰箱中冷却5 min待琼脂糖凝固，取出培养皿后，用吸管吸取软骨环中间孔中多余的缓冲液和琼脂糖，在每个中间孔加入备用的浓缩的细胞悬浮液(1×10¹¹ L^-1)10 μL，沿着培养皿侧壁缓缓加入培养液至软骨环上表面平行(不超过软骨上表面，防止细胞从上方溢出)，放入孵箱中孵育2 h，此后再将培养液加之覆盖整个软骨环，两三天更换1次培养。共制作18个培养模型(图1)，为琼脂糖凝胶组。

将剩余3个软骨环加入无琼脂糖的培养皿中，在相同条件下将3枚软骨环的中间孔中以相同方式加入软骨细胞培养，设为无琼脂糖对照组。

两组早期光镜下观察：光镜下观察早期(24 h后)琼脂糖凝胶组和无琼脂糖对照组软骨环周围软骨细胞漏出情况，并予倒置相差显微镜摄片。

琼脂糖凝胶组的组织学观察：分别于1，2和4周各取出6个模型，放入O.C.T混合物中低温包埋，将组织块在冰冻切片机中切成5 μm厚度的切片。冰冻的组织切片在染色前需用AAF固定液(体积分数40%乙醇85 mL，体积分数40%甲醛10 mL、冰醋酸5 mL)浸泡两三分钟固定组织，固定后组织切片分别用苏木精-伊红染色、阿利新蓝、番红O和Ⅱ型胶原免疫组化染色，染色后用显微镜观察并SPOT图像采集系统拍摄照片。

琼脂糖凝胶组的新生软骨与软骨环内孔平均面积比的测量：为了定量组织整合情况，在1，2，4周从总样本中随机抽取样本做组织切片，为了标准化软骨整合的测量方法(图2)，在每个切面新生软骨和软骨环之间的最小距离被作为测量的起始点，用图像处理软件将软骨环内径每隔260 μm确定一个点，然后用ImageJ 1.44p图像处理软件计算新生软骨与软骨环内孔的面积比。一共分析了18个模型：1，2和4周各6个模型，每个模型制作1个组织切片，总共 18张组织切片被用来分析测量。

主要观察指标：两组早期光镜下观察，琼脂糖凝胶组在第1，2，4周时的组织学观察及新生软骨与软骨环内孔之间平均面积比的比较。

统计学分析：应用SPSS12.0软件进行统计学数据分析。数据以x(_)±s形式表示，所有数据经方差齐性检验，在各组之间用方差分析比较组间差异性，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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