成人脂肪间充质干细胞的定向成骨诱导

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.19.006

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (19): 2987-2992.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.19.006

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成人脂肪间充质干细胞的定向成骨诱导

郭艳萍^1，2，陶常波²，张爱君²，李雪阳²，沈才齐²，李政道³，金培生²

1徐州医学院研究生院，江苏省徐州市 221000
2徐州医学院附属医院整形外科，江苏省徐州市 221000
3政道干细胞实验室，江苏省徐州市 221000

修回日期:2014-03-05 出版日期:2014-05-07 发布日期:2014-05-07
通讯作者: 金培生，博士，教授，主任医师，徐州医学院附属医院整形外科，江苏省徐州市 221000
作者简介:郭艳萍，1987年生，湖北省恩施市人，土家族， 2011年徐州医学院毕业，硕士，主要从事整形外科脂肪干细胞组织工程方面的研究。
基金资助:
江苏省科教兴卫重点人才资助项目(RC2011115)

Osteogenic induction of human adipose-derived stem cells

Guo Yan-ping^{1, 2}, Tao Chang-bo², Zhang Ai-jun², Li Xue-yang², Shen Cai-qi², Li Zheng-dao³, Jin Pei-sheng²

1Graduate School of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China
2Department of Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China
3Zhengdao Stem Cell Laboratory, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China

Revised:2014-03-05 Online:2014-05-07 Published:2014-05-07
Contact: Jin Pei-sheng, M.D., Professor, Chief physician, Department of Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China
About author:Guo Yan-ping, Master, Graduate School of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China; Department of Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China
Supported by:
Key Provincial Talents Program of Jiangsu Province, No. RC2011115

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂肪分离可获得大量的间充质干细胞并成功向骨、软骨、脂肪、心肌等多个方向诱导分化。
目的：建立成人脂肪间充质干细胞体外分离培养、成骨分化方法，并探讨脂肪间充质干细胞作为骨组织工程的种子细胞的前景。
方法：通过胶原酶消化法从成人脂肪中分离间充质干细胞，进行体外培养，流式细胞仪检测细胞表面标记物，CCK8检测细胞活性，成骨诱导液诱导干细胞向骨细胞分化，BCIP/NBT比色法染色检测碱性磷酸酶，茜素红染色检测钙结节形成，RT-PCR检测碱性磷酸酶，骨桥蛋白表达变化。
结果与结论：利用脂肪抽吸液成功培养出脂肪间充质干细胞，且能稳定传代，增殖能力旺盛；流式细胞仪检测证实有特定的间充质干细胞表面标记物表达；成骨诱导脂肪间充质干细胞后呈典型的成骨细胞形态；碱性磷酸酶染色阳性，茜素红染色后可见钙结节形成，成骨诱导培养0，3，7，14，21，28 d，RT-PCR定量检测结果证实碱性磷酸酶、骨桥蛋白阳性表达。说明用酶消化法可以从人脂肪中分离得到脂肪间充质干细胞；脂肪间充质干细胞可向骨细胞诱导分化，阳性表达骨桥蛋白，碱性磷酸酶，是一种优良的骨组织工程的种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 培养, 诱导, 脂肪间充质干细胞, 成骨分化, 组织工程骨, 颅骨缺损, 碱性磷酸酶, 骨桥蛋白

Abstract:

BACKGROUND: A great amount of mesenchymal stem cells can be successfully derived from fat tissue and induced to differentiate into osteoblasts, chondrocytes, adipocytes and myocardial cells.
OBJECTIVE: To establish the method of isolating, culturing and osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells in vitro, and to explore the potential of adipose-derived stem cells as seed cells for bone tissue engineering.
METHODS: Collagenase enzymatic digestion was used to isolate adipose-derived stem cells from human fat tissue which were then cultured in vitro. Flow cytometry was used to detect cell surface markers. Cell counting kit-8 assay was performed to examine cell viability. Adipose-derived stem cells were induced by osteogenic induced reagent to differentiate into bone cells. In addition, we also performed BCIP/NBT method to detect alkaline phosphatase activity. Alizarin red staining was used to detect the formation of calcium node. RT-PCR was performed to examine alkaline phosphatase and osteopontin expression.
RESULTS AND CONCLUSION: We successfully obtained adipose-derived stem cells from fat aspirated liquid. Adipose-derived stem cells obtained could passage stably and proliferate highly. Flow cytometry data showed the expression of stem cell surface markers. Adipose-derived stem cells showed typical osteoblast morphology after osteogenic differentiation. Alkaline phosphatase staining was positive and alizarin red staining displayed the formation of calcium node. Furthermore, we found that alkaline phosphatase and osteopontin mRNA was expressed after differentiation 0, 3, 7, 14, 21, 28 days. These findings indicate that adipose-derived stem cells can be obtained from fat tissue through enzymatic digestion, differentiate towards bone cells, and express alkaline phosphatase and osteopontin, which can become potential seed cells for bone tissue engineering.

全文链接：

Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, subcutaneous fat, osteoblasts, osteopontin

中图分类号:

R394.2

郭艳萍，陶常波，张爱君，李雪阳，沈才齐，李政道，金培生 . 成人脂肪间充质干细胞的定向成骨诱导[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(19): 2987-2992.

Guo Yan-ping, Tao Chang-bo, Zhang Ai-jun, Li Xue-yang, Shen Cai-qi, Li Zheng-dao, Jin Pei-sheng . Osteogenic induction of human adipose-derived stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(19): 2987-2992.

图/表（结果） 5

2.1 人脂肪间充质干细胞生长特性 原代脂肪间充质干细胞小圆形，色深，接种三四小时开始贴壁，24 h贴壁80%，48 h贴壁90%以上。培养8-10 d后达到90%融合，进行细胞传代。传代后细胞增长速度加快，平均四五天达到融合。贴壁初期成短棒状(图1A)，贴壁3 d以后细胞成为长梭形，稍有细胞质突起(图1B)，细胞的外观呈成纤维细胞样外观，束状或旋涡状，细胞质丰富，细胞轮廓清晰，细胞核位于其中。细胞传代到P3代形成均匀的细胞形态，苏木精-伊红染色(图1C)。

2.2 细胞表面标记物 流式细胞技术检测发现脂肪间充质干细胞表面CD105、CD49d、CD44阳性表达，CD31、CD106、CD45阴性表达，传代10代未见明显差异，典型图像见图2。

2.3 人脂肪间充质干细胞细胞增殖能力 发现脂肪间充质干细胞呈典型的“S”形增殖曲线，“潜伏-对数生长-平台”期明显，培养一两天为潜伏期，培养三四天为对数生长期。5 d后细胞密度较大，进入平台期，可进行传代。经过纯化传代后，增殖能力有所增强，第3，6，9代细胞生长曲线无显著差异，各时间点A值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

2.4 脂肪间充质干细胞成骨诱导分化 脂肪间充质干细胞成骨诱导7 d，细胞向骨细胞分化(图4A)。碱性磷酸酶染色可见，脂肪间充质干细胞的胞核中可见浅蓝色着色(图4B)，成骨诱导28 d后茜素红染色肉眼及镜下均可见散在红色阳性结节(图4C)，阴性对照组未见阳性染色。非诱导细胞不出现定向分化。

2.5 脂肪间充质干细胞诱导表达骨桥蛋白、碱性磷酸酶 脂肪间充质干细胞成骨诱导诱导7，14 d后，RT-PCR检测发现骨桥蛋白、碱性磷酸酶 mRNA表达均显著上升。其中骨桥蛋白表达量在28 d时较高，而碱性磷酸酶在诱导7-14 d时表达较高(图5)。

参考文献

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引言

材料方法

设计：细胞培养，形态学观察。

时间及地点：于2012年9月至2013年6月在江苏省政道干细胞实验室完成。

材料：

脂肪来源：脂肪由徐州医学院附属医院整形外科吸脂手术患者遗弃，用于实验均知情同意，实验符合医学伦理学标准。

方法：

脂肪间充质干细胞的分离和萃取：参考Zuk等^[10]及课题组前期的研究方法^[19]，将脂肪抽吸后液体800 r/min× 3 min离心，留上层漂浮的脂肪组织，PBS漂洗，800 r/min× 5 min离心2次，留上层脂肪；加入2倍体积0.2%胶原酶，37 ℃摇床消化45 min；将糊状消化液用100目不锈钢滤网过滤，1 500 r/min×5 min离心，沉淀物以1 mL DMEM重悬，加5 mL红细胞裂解液，室温静置10 min；1 500 r/min×5 min离心，PBS漂洗，离心，细胞培养基重悬，5×10⁸ L^-1细胞浓度接种；37 ℃、体积分数5%CO₂孵育，静置3 d后酌情换液。细胞长至80%融合时0.25%胰酶消化传代。原代细胞培养达到80%-90%融合的时候，细胞计数，1∶2比例消化传代。细胞形态学检测：倒置相差显微镜观察细胞形态，苏木精-伊红染色观察细胞形态。

流式细胞仪检测：P1，P2，P3，P6，P10代细胞流式细胞仪检测细胞标记物，正常消化，收集细胞到离心管中，细胞计数，300×g，5 min离心，去上清，加入DPBS调整浓度，然后按10¹⁰ L^-¹的浓度转移到5 mL细胞管中，分别加入20 µL的CD49d-PE，CD105-PE，CD44-PE，CD45-FITC，CD31-FITC，CD106-FITC抗体，常温遮光孵育15 min，加入DPBS稀释，离心去上清，再分别加入500 µLDPBS进行重悬，上机检测。

CCK8检测细胞动力学能力：取P1，P3，P6，P9代细胞，调整细胞浓度为10⁷ L^-1，接种细胞到96孔板中，每孔 1 000个细胞，放入培养箱培养，1，2，3，4，5，6 d分别加入CCK8孵育4 h后，酶标仪检测A值，绘制生长曲线。
人脂肪间充质干细胞成骨诱导：取P3代细胞，以成骨诱导培养基进行成骨诱导，成骨诱导剂组成：常规培养基中加入10 mmol/L β-磷酸甘油，100 µmol/L地塞米松， 0.05 mmol/L维生素C。成骨诱导7 d后进行碱性磷酸酶染色，28 d后进行茜素红钙结节染色。

RT-PCR检测：取成骨诱导 0，3，7，14，21，28 d细胞，加入裂解液提取RNA，反转录cDNA链，根据实验要求查到目的基因骨桥蛋白、碱性磷酸酶的mRNA序列，由上海生工公司根据要求合成PCR引物，RT-PCR检测骨桥蛋白、碱性磷酸酶mRNA表达，具体条件见表1。ImgaeJ软件分析膜上印迹。并以GAPDH为内对照计算相对灰度值。

主要观察指标：检测人脂肪间充质干细胞成骨诱导过程中两种目的基因骨桥蛋白和碱性磷酸酶的表达变化及趋势。
统计学分析：第五作者采用SPSS 13.0版本的统计软件进行处理，t 检验分析，统计学软件来源于徐州医学院统计学教研室。

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讨论

骨组织工程是组织工程领域发展最为迅速的学科，理想的组织工程骨种子细胞需取材方便、对机体损伤小、体外培养易于成骨分化并具有稳定的传代增殖能力^[20-21]。最常见的种子细胞是骨髓间充质干细胞，但传统骨髓间充质干细胞存在各种不足，严重限制了骨组织工程技术的研究和应用^[22]。人脂肪来源的脂肪间充质干细胞是近年发现的一种类似骨髓间充质干细胞的多能干细胞^[23-24]，其源于脂肪组织，容易大量获得，来源充足，患者容易接受，自体移植无排异反应又避免了胚胎干细胞所涉及的法律伦理问题，成为组织工程领域研究热点。

如何稳定、高效地从脂肪组织中获取脂肪间充质干细胞是其在科研、临床中广泛应用的基础。实验通过Ⅰ型胶原酶消化法获得脂肪间充质干细胞，经过3代纯化，细胞表面CD44、CD49d、CD105阳性率在95%以上，造血细胞系标记物CD45，血管内皮细胞标记物CD31、CD106则为阴性，证实其为脂肪间充质干细胞。所获得的细胞体外生长良好、增殖旺盛，第3，6，9代细胞的增殖能力比较无显著差异，且能稳定传代15次以上，仍可保持高的增殖活性。与课题组前些研究基本一致^[7]。该技术操作相对简单，培养成功率高，是一种稳定、高效的脂肪间充质干细胞获取方法。

同时实验还证实脂肪间充质干细胞具有一定的体外成骨分化能力，利用β-磷酸甘油、地塞米松、维生素C等诱导培养脂肪间充质干细胞，7 d后碱性磷酸酶染色可见多数细胞浅蓝色着色，28 d后茜素红染色肉眼及镜下均见散在红色阳性结节，非诱导细胞不出现阳性染色，证实脂肪间充质干细胞可在体外成骨分化，结果与Zuk、黄宏等一致^[10^，^25]。进一步证实，脂肪间充质干细胞成骨诱导后中骨桥蛋白、碱性磷酸酶表达显著提高。

碱性磷酸酶是成骨细胞分化的早期重要标志酶，可破坏钙化抑制剂，从而启动钙化过程，是成骨分化开始的标志。该酶活性越高，说明前成骨细胞向成熟成骨细胞分化越明显^[26]。

骨桥蛋白是一种分泌型钙结合磷酸化糖蛋白，它能与骨组织中的羟磷灰石紧密结合，在骨钙的沉积、矿化、细胞-基质作用中发挥关键作用^[27]。

实验通过PT-PCR检测成骨诱导后脂肪间充质干细胞的碱性磷酸酶、骨桥蛋白的活性，发现碱性磷酸酶在诱导后第7-14天时其活性最高，但之后其活性显著下降。而随着诱导时间的延长，骨桥蛋白的含量越来越高，在诱导的第21-28天，骨桥蛋白表达达到最高峰，同时茜素红染也证实了在诱导第28天时钙化结节的形成，与柳向东等^[28]对间充质干细胞成骨诱导分化的研究结果基本一致，充分显示了脂肪间充质干细胞是一种合理的间充质干细胞替代种子细胞。

脂肪间充质干细胞取材方便、来源充足，同时可治疗肥胖、美容塑身，并且脂肪间充质干细胞含量丰富，体外培养难度较低，增殖能力强^[29-31]，较骨髓间充质干细胞可能有更好的应用前景。虽然目前脂肪间充质干细胞的研究取得一定进展，但依然存在以下问题：①脂肪间充质干细胞虽然可以在诱导下向骨分化，但其具体机制尚不清楚。②来自于不同个体、不同部位的脂肪间充质干细胞的分化能力有明显差别^[32-34]，其具体原因尚不清楚，但却为进一步探寻脂肪间充质干细胞在体外诱导分化的条件和最佳供体、供区提供了新的课题。③种子细胞移入体内需要有合适的支架材料，而关于生物材料的研究较少，这是课题组下一阶段的研究内容。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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延伸阅读

1 已发表文章：中国组织工程研究，2013（23）：4232-4239.

主要观察指标：倒置显微镜下观察脂肪干细胞的形态变化及增殖能力，碱性磷酸酶、茜素红染色方法进行鉴定成骨诱导结果

结论：脂肪干细胞的分离培养可以为组织工程提供大量、优质的种子细胞

2.已发表文章：口腔颌面外科杂志，2013,23（1）：8-13.

主要观察指标：细胞表面抗原标记物，成骨诱导后碱性磷酸酶活性检测，RT-PCR检测相关基因表达

结论：ADSCs有较好的成脂分化能力，BMSC有较好的成骨分化的能力，都可以作为组织工程的种子细胞。

3.已发表文章：Stem Cell Rev and Rep (2011) 7:64–76

主要观察指标：细胞表面抗原标记物，RT-PCR检测相关基因表达

结论：ADSCs具有较好的成骨分化和成软骨分化的能力，作为组织工程的种子细胞

4.已发表文章：BMC Mol Biol. 2008 Feb 26;9:26.

主要观察指标：电泳和串联质谱分析脂肪细胞成骨细胞的分化，定量分析脂肪干细胞的蛋白质分泌组。

结论：PAI-1在脂肪干细胞成骨/成脂分化平衡中起重要作用。

待发表文章：中国组织工程研究。

主要观察指标：倒置相差显微镜观察脂肪干细胞的形态及生长状况，流式细胞仪检测细胞表面标记物，CCK8检测细胞活性，成骨诱导后 BCIP/NBT比色法染色检测碱性磷酸酶（AKP），茜素红染色检测钙结节形成，RT-PCR检测碱性磷酸酶，骨桥蛋白表达变化。

结论：脂肪干细胞可向骨细胞诱导分化，阳性表达骨桥蛋白,碱性磷酸酶，是一种优良的骨组织工程的种子细胞。

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Osteogenic induction of human adipose-derived stem cells

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