促红细胞生成素对急性肾损伤中干细胞因子及其受体表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.53.017

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (53): 9203-9208.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.53.017

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促红细胞生成素对急性肾损伤中干细胞因子及其受体表达的影响

王庆霞，李洪杰，刘雪梅，徐岩

青岛大学医学院附属医院肾内科，山东省青岛市 266071

修回日期:2013-09-05 出版日期:2013-12-31 发布日期:2013-12-31
通讯作者: 刘雪梅，博士，主任医师，青岛大学医学院附属医院，山东省青岛市 266071 Wangqingxia99@ sina.com
作者简介:王庆霞★，女，1986年生，汉族，青岛大学医学院在读硕士，主要从事肾内科方面的研究。
基金资助:
青岛市科技计划基础研究项目(12-1-4-2-(12)-jch)，项目类别：产学研合作引导计划(应用基础研究) *

Erythropoietin effects on expression of stem cell factor and its receptor in acute renal injury

Wang Qing-xia, Li Hong-jie, Liu Xue-mei, Xu Yan

Department of Nephrology, the Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong Province, China

Revised:2013-09-05 Online:2013-12-31 Published:2013-12-31
Contact: Liu Xue-mei, M.D., Chief physician, Department of Nephrology, the Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong Province, China Wangqingxia99@sina.com
About author:Wang Qing-xia★, Studying for master’s degree, Department of Nephrology, the Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong Province, China
Supported by:
the Basic Research Program of Qingdao Municipal Scientific Plan, No. 12-1-4-2-(12)-jch*

摘要/Abstract

摘要：

背景：细胞因子在减轻肾脏缺血再灌注损伤中的作用日益受到重视，干细胞因子具有造血系统以外的器官保护作用。

目的：探讨大鼠急性肾损伤模型中干细胞因子及其受体c-Kit表达的变化和促红细胞生成素预处理对其表达的影响。

方法：成年雄性Wistar大鼠34只，采用夹闭双侧肾蒂建立缺血再灌注模型，缺血45 min后再灌注24 h，随机分为假手术组(n=10)、缺血再灌注组(n=12)和促红细胞生成素组(n=12)，促红细胞生成素组于造模前2 h一次性尾静脉注射重组人促红细胞生成素5 000 U/kg。免疫组化及图像分析技术检测各组肾组织中干细胞因子及c-Kit的表达变化，测定血清肌酐和尿素氮水平，苏木精-伊红染色观察肾组织病理学改变并计算肾小管损伤积分。

结果与结论：干细胞因子及c-Kit在肾组织中的表达仅限于肾小管区域。与假手术组比较，干细胞因子和c-Kit在缺血再灌注组和促红细胞生成素组的表达均明显增高(P < 0.05)，促红细胞生成素组干细胞因子表达高于缺血再灌注组(P < 0.01)，但两组c-Kit表达差异无显著性意义(P > 0.05)；促红细胞生成素组血清肌酐与尿素氮水平明显低于缺血再灌注组(P < 0.05)，但高于假手术组(P < 0.05)。与缺血再灌注组比较，促红细胞生成素组肾组织病变减轻。说明缺血再灌注导致急性肾损伤发生时干细胞因子及c-Kit表达升高，而促红细胞生成素对急性肾损伤的保护作用可能与上调干细胞因子及c-Kit表达有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 器官移植, 器官移植基础实验, 干细胞, 干细胞因子, 急性肾损伤, 促红细胞生成素, 细胞因子, c-Kit

Abstract:

BACKGROUND: The effects of cytokines on lessening ischemia/reperfusion injury to the kidney have been paid attention increasingly. Stem cell factor has protective effects on organs except hematopoietic system.

OBJECTIVE: To study the expression of stem cell factor and its receptor c-Kit in acute kidney injury model of rat, and the effect of erythropoietin on the expression of stem cell factor and c-Kit.

METHODS: A total of 34 adult male Wistar rats were selected to induce ischemia/reperfusion models by occluding bilateral renal pedicle (ischemia for 45 minutes and reperfusion for 24 hours). The animals were randomly divided into sham-operation group (n=10), ischemia/reperfusion group (n=12) and erythropoietin group (n=12). In the erythropoietin group, 5 000 U/kg recombinant human erythropoietin was injected once via the tail vein at 2 hours before modeling. The expression of stem cell factor and c-Kit was detected by immunohistochemistry and image analysis technique in each group. The serum concentrations of creatinine and blood urea nitrogen were measured. Meanwhile, renal pathologic changes were observed by hematoxylin-eosin staining, and renal tubule injury integral was calculated.

RESULTS AND CONCLUSION: Stem cell factor and c-Kit were detected only in the renal tubule section. The expression of stem cell factor and c-Kit in the ischemia/reperfusion group and erythropoietin group was higher than sham-operation group (P < 0.05). The expression of stem cell factor was higher in the erythropoietin group than that in the ischemia/reperfusion group (P < 0.01). However, no significant difference in c-Kit was detected between the two groups (P > 0.05). Serum creatinine and urea nitrogen levels were significantly lower in the erythropoietin group than that in the ischemia/reperfusion group (P < 0.05), but higher than that in the sham-operation group (P < 0.05). Compared with the ischemia/reperfusion group, pathological changes in nephridial tissue were more lessened in the erythropoietin group. These results suggested that stem cell factor and c-Kit expression increased when ischemia/reperfusion led to acute renal injury. The protective effect of erythropoietin on acute renal injury possibly associated with the upregulation of stem cell factor and c-Kit expression.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: stem cells, stem cell factor, kidney, reperfusion injury, erythropoietin

中图分类号:

R318

王庆霞，李洪杰，刘雪梅，徐岩. 促红细胞生成素对急性肾损伤中干细胞因子及其受体表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(53): 9203-9208.

Wang Qing-xia, Li Hong-jie, Liu Xue-mei, Xu Yan. Erythropoietin effects on expression of stem cell factor and its receptor in acute renal injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(53): 9203-9208.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

设计：动物实验，对照观察。

时间及地点：于2012年10月在青岛大学医学院动物研究室、青岛大学医院院痛风实验室完成。

材料：

实验动物：健康雄性Wistar大鼠34只，8周龄，体质量(220±20) g，购于青岛市药检所动物实验中心，实验动物许可证号：SLXK鲁20080002。适应性喂养1周后，随机分为假手术组(n=10)、缺血再灌注组(n=12)、促红细胞生成素组(n=12)。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

促红细胞生成素对急性肾损伤中干细胞因子及其受体表达实验的主要试剂：

实验方法：

缺血再灌注模型的建立：各组大鼠术前禁食8 h，不禁水，10%水合氯醛(约3 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，正中线开腹，游离双侧肾蒂。缺血再灌注组用无创动脉夹夹闭双侧肾蒂，缺血45 min后松开动脉夹，还原肠管，缝合关腹，术中充分湿化，术中及术后注意保温；假手术组游离出双侧肾蒂后，不夹闭，45 min后关腹；促红细胞生成素预处理组于造模前2 h尾静脉1次性注射重组人促红细胞生成素(5 000 U/kg)，其余同缺血再灌注组。

标本收集：各组大鼠于造模后24 h后麻醉，眼球内眦取血，约3 mL(不足时心脏取血)，后摘取双侧肾脏，并纵剖肾脏放于体积分数4%中性甲醛溶液中固定、石蜡包埋，用于肾组织病理及免疫组化染色。

肾功能的测定：血标本离心后取上清，用HITACHI7600-210自动生化分析仪检测血肌酐、尿素氮水平。

免疫组织化学检测肾组织干细胞因子及c-Kit的表达：采用免疫组织化学SP二步法，严格按照免疫组化操作步骤及试剂说明书进行，用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照，其他步骤不变。

每例标本随机选取10个不重叠视野，计数每个视野内阳性细胞数(阳性细胞数分级0-≤1%=0、1%-≤10%=1、10%-≤50%=2、50%-≤80%=3、80%-100%=4)，借助HPIAS-1000彩色图像分析仪(武汉千屏)，测量区域内阳性细胞的显色强度[显色强度分级0(阴性)、1(弱阳性)、2(阳性)、3(强阳性)]，上述两项的乘积(阳性细胞数分级×显色强度)为各区域免疫组化评分^[7]，以进行半定量分析。

肾组织病理学改变：石蜡组织制作3 μm切片，常规苏木精-伊红染色观查肾组织病理学改变。

主要观察指标：观察各组之间血清肌酐、尿素氮水平、肾组织干细胞因子及其受体c-Kit的表达变化，和肾组织病理学改变。

统计学分析：采用SPSS 17.0统计学软件包，实验数据均表示为x(_)±s形式，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较用LSD-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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讨论

近年来，随着对细胞因子网络认识的迅速提高，有关器官缺血再灌注时细胞因子的作用日益受到重视^[8]。肾脏是对缺血再灌注极敏感的器官之一，在临床上常见于手术、严重创伤、心肺复苏等情况，而肾脏缺血再灌注容易导致急性肾损伤的发生，处理不及时还可能会演变为慢性肾脏功能不全^[9]，因此，积极探索防治急性肾损伤的新方法十分必要。

促红细胞生成素是一种造血细胞因子，在临床上广泛用于肾性贫血及肿瘤相关性贫血已达20余年^[10]。近年研究发现，促红细胞生成素不仅是一种造血细胞因子，其对多种组织的缺血再灌注损伤有重要的保护作用^[11]。促红细胞生成素对急性肾损伤的保护机制复杂，主要包括抗细胞凋亡、抗氧自由基及炎症反应、促进肾小管细胞的再生等，并涉及多种细胞因子共同作用，如血红素氧化酶1、血管内皮生长因子、热休克蛋白等^[12-14]。促红细胞生成素受体主要表达于肾小管及髓质集合管上皮细胞、肾小球系膜细胞，与促红细胞生成素结合后对缺血再灌注损伤发挥保护作用，尤其是缺血前给予大剂量促红细胞生成素处理可明显减轻肾脏损伤^[15-16]。

实验通过夹闭双侧肾蒂建立缺血再灌注模型模拟缺血性急性肾损伤，实验结果显示代表肾功能的血清肌酐及尿素氮水平明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，肾组织病理发生明显改变(符合2005年急性肾损伤的诊断标准)，说明建模成功。缺血前一次性给予大剂量促红细胞生成素处理，肾功能受损程度明显减轻，同时肾组织病理受损程度也明显减轻，该实验结果与其他类似研究结果相符。

干细胞因子是一种多功能细胞生长因子，与c-Kit结合后激活下游信号转导分子，对多种细胞的增殖、迁移、分化等起重要的调节作用^[17-18]。干细胞因子分为可溶性和膜结合型，均具有生物学活性。多项研究表明，干细胞因子/c-Kit系统在多种缺血器官中发挥保护作用，主要机制包括抗细胞凋亡、诱导干细胞迁移、分化，促进细胞再生等^[19-21]。此外，Geurt等^[5,22]发现c-Kit表达于肾组织小管区域，干细胞因子可通过自分泌或旁分泌机制保护肾小管上皮细胞，并且干细胞因子于缺血再灌注1天后表达量达到高峰。

实验结果显示干细胞因子表达量于缺血再灌注1 d后明显升高，与Geurt等结果相符，而c-Kit表达量升高却不如干细胞因子升高明显，可能是由于大量肾小管上皮细胞受损、脱落所致，具体机制尚须进一步研究阐明。给予大剂量促红细胞生成素预处理后，肾小管区域干细胞因子表达量明显上调，且肾功能受损与肾组织病变均减轻，提示促红细胞生成素可能促进干细胞因子表达，从而发挥保护作用。但是，干细胞因子的表达上调是促红细胞生成素的直接作用还是通过其他途径的介导，还需要更深入的研究^[23-26]。

促红细胞生成素对急性肾损伤表现出的明显的保护作用，使之有望成为一种预防及治疗急性肾损伤的新措施，但是目前其确切的肾脏保护机制有待进一步研究。要把促红细胞生成素真正运用于急性肾损伤的临床治疗尚需进行大型的、多中心临床研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
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Erythropoietin effects on expression of stem cell factor and its receptor in acute renal injury

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