脐血单个核细胞移植治疗失代偿期肝硬化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.023

摘要/Abstract

摘要：

背景：原位肝移植是目前治疗终末期肝病的最有效手段，但是供肝来源匮乏、免疫排斥、无法有效控制反复感染等问题限制了其应用。干细胞移植技术的应用为该病种的治疗提供了新的思路和研究方法，许多研究证实可以通过各种不同的方法在体外成功诱导脐血来源的间充质干细胞向肝细胞转化。
目的：探讨人脐血单个核细胞移植治疗失代偿期肝硬化的临床疗效及可行性。
方法：异体人脐血单个核细胞移植治疗23例肝硬化失代偿期患者，检测移植后2，4，8，24周的血清丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、胆碱酯酶、总胆红素和凝血酶原时间，并观察患者临床症状体征改善情况以及不良反应。
结果与结论：人脐血单个核细胞移植后2周，肝功能各项指标较治疗前无明显改善(P > 0.05)；移植后4周，谷丙转氨酶有显著改善(P < 0.05)、其余指标无明显改善；移植后12周肝功能各项指标均有改善(P < 0.05)，且肝脏硬度有所改善(P < 0.05)；移植后24周各项指标有显著性改善(P < 0.01)。移植后4周时患者临床症状有明显改善，20例乏力好转(87%)、21例食欲改善(91%)、19例腹水减轻(83%)；所有患者移植期间及治疗后随访24周无严重不良反应。结果显示异体人脐血单个核细胞移植治疗肝硬化失代偿期患者临床疗效肯定，安全性好，可作为中晚期肝硬化患者的临床治疗手段。

关键词: 干细胞, 干细胞临床实践, 脐血单个核细胞, 肝硬化, 失代偿期, 临床疗效, 谷丙转氨酶, 不良反应

Abstract:

BACKGROUND: Orthotopic liver transplantation is the most effective therapy for the treatment of end-stage liver diseases, but the lack of donor source, immune rejection, and repeated infections limit its application. Stem cell transplantation technology provides a new idea for the treatment of end-stage liver diseases. A variety of methods have been confirmed to successfully induce umbilical cord blood mesenchymal stem cells converted into liver cells in vitro.
OBJECTIVE: To explore the clinical efficacy and feasibility of human umbilical cord blood mononuclear cells transplantation in the treatment of decompensated cirrhosis.
METHODS: Twenty-three patients with decompensated cirrhosis received allogeneic human umbilical cord blood mononuclear cell transplantation. Serum alanine aminotransferase, albumin, cholinesterase, total bilirubin and prothrombin time were detected at post-transplantation weeks 2, 4, 8 and 24. Improvement in clinical signs and symptoms as well as adverse reactions was observed.
RESULTS AND CONCLUSION: Liver function had no changes at 2 weeks after human umbilical cord blood mononuclear cell transplantation (P > 0.05). At 4 weeks after cell transplantation, serum alanine aminotransferase was improved significantly (P < 0.05), but the other indexes still had no changes. Until 12 weeks after cell transplantation, there were significant improvements in all the liver function indicators (P < 0.05) and the liver stiffness (P < 0.05). By the end of 24 weeks, all the test results were improved significantly (P < 0.01). Clinical symptoms were alleviated, including fatigue improvement in 20 cases (87%), improved appetite in 21 cases (91%), and relieved ascites in 19 cases (83%). No severe adverse reactions were found during the transplantation and 24-week follow-up. These findings suggest that human umbilical cord blood mononuclear cells transplantation is effective and safe for the treatment of decompensated cirrhosis, which can be considered as a clinical therapy for patients with advanced cirrhosis.

Key words: liver cirrhosis, fetal blood, cord blood stem cell transplantation, treatment outcome

中图分类号:

R394.2

徐玉琴，石文明，李金顺，徐建国，李宏文，胡祥. 脐血单个核细胞移植治疗失代偿期肝硬化[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.023.

Xu Yu-qin, Shi Wen-ming, Li Jin-shun, Xu Jian-guo, Li Hong-wen, Hu Xiang. Umbilical cord blood mononuclear cell transplantation for treatment of decompensated cirrhosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.023.

图/表（结果） 2

参考文献

[1] 胡祥.干细胞与肝脏病治疗研究进展[J].中国继续医学教育,2011, 3(6):27-34.
[2] 王吉耀.内科学(供8年制及7年制临床医学等专业用)[M].北京:人民卫生出版社,2005:520.
[3] 张耿林,彭亮,高志良.干细胞移植在乙肝肝衰竭中的研究及应用[J].内科急危重症杂志,2011,17(6):333-336.
[4] 吴祖泽,贺福初,裴雪涛.造血调控[M].上海:上海医科大学出版社, 2000:245.
[5] 张巧玲,覃莉珍,解继胜,等.脐带间充质干细胞研究进展及应用前景[J]. 右江民族医学院学报,2005,27(1):101-103.
[6] Hong SH, Gang EJ, Jeong JA,et al. In vitro differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells. Biochem Biophys Res Commun. 2005;330(4):1153-1161.
[7] Kang XQ, Zang WJ, Bao LJ,et al. Fibroblast growth factor-4 and hepatocyte growth factor induce differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into hepatocytes.World J Gastroenterol. 2005;11(47):7461-7465.
[8] Oh SH, Miyazaki M, Kouchi H,et al. Hepatocyte growth factor induces differentiation of adult rat bone marrow cells into a hepatocyte lineage in vitro.Biochem Biophys Res Commun. 2000;279(2):500-504.
[9] Lyra AC, Soares MB, da Silva LF,et al. Feasibility and safety of autologous bone marrow mononuclear cell transplantation in patients with advanced chronic liver disease. World J Gastroenterol. 2007;13(7):1067-1073.
[10] Kakinuma S, Tanaka Y, Chinzei R,et al. Human umbilical cord blood as a source of transplantable hepatic progenitor cells. Stem Cells. 2003;21(2):217-227.
[11] Levicar N, Pai M, Habib NA,et al. Long-term clinical results of autologous infusion of mobilized adult bone marrow derived CD34+ cells in patients with chronic liver disease. Cell Prolif. 2008;41 Suppl 1:115-125.
[12] Zhang YN, Lie PC, Wei X. Differentiation of mesenchymal stromal cells derived from umbilical cord Wharton's jelly into hepatocyte-like cells. Cytotherapy. 2009;11(5):548-558.
[13] Tsai PC, Fu TW, Chen YM,et al. The therapeutic potential of human umbilical mesenchymal stem cells from Wharton's jelly in the treatment of rat liver fibrosis.Liver Transpl. 2009; 15(5):484-495.
[14] Lee MW, Jang IK, Yoo KH,et al. Stem and progenitor cells in human umbilical cord blood. Int J Hematol. 2010;92(1):45-51.
[15] Harris DT. Non-haematological uses of cord blood stem cells. Br J Haematol. 2009;147(2):177-184.
[16] Zhao Q, Ren H, Zhu D,et al. Stem/progenitor cells in liver injury repair and regeneration. Biol Cell. 2009;101(10): 557-571.
[17] Jung KH, Shin HP, Lee S,et al. Effect of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in a cirrhotic rat model. Liver Int. 2009;29(6):898-909.
[18] 孙嫣,段芳龄,陈香宇,等.人骨髓间充质干细胞体外分化为肝细胞样细胞[J].胃肠病学和肝病学杂志,2004,13(3):244-248.
[19] Schwartz RE, Reyes M, Koodie L,et al. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells. J Clin Invest. 2002;109(10):1291-1302.
[20] Theise ND, Badve S, Saxena R,et al. Derivation of hepatocytes from bone marrow cells in mice after radiation-induced myeloablation. Hepatology. 2000;31(1): 235-240.
[21] Petersen BE, Bowen WC, Patrene KD,et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. Science. 1999;284 (5417):1168-1170.
[22] 韩翠萍,刘吉勇,高蕾,等.人脐血间充质干细胞向类肝细胞分化:人肝细胞共培养诱导法的可行性[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(1):48-52.
[23] 詹三华,张鲁峰,姚卫民,等.人脐血间充质干细胞移植治疗大鼠肝硬化模型[J].中国组织工程研究,2013,17(19):3461-3466.
[24] 杜玲,罗国君,袁雅红,等.脐血干细胞静脉输注治疗失代偿期肝硬化1 例并文献复习[J].现代生物医学进展,2009,9(18):3511- 3513.
[25] 张丽欣,邢利和,张丽丽,等.脐血干细胞移植治疗失代偿期肝硬化的临床效果研究[J].中国全科医学,2010,13(24):2680-2682.

引言

肝硬化(hepatic cirrhosis)是一种由不同病因长期作用于肝脏引起的慢性、进行性、弥漫性肝病的终末阶段。是在肝细胞广泛坏死基础上产生肝脏纤维组织弥漫性增生，晚期出现肝功能衰竭、门静脉高压、肝性脑病和多种并发症。导致肝硬化最主要的致病原因是乙肝病毒、丙肝病毒感染、酗酒和非酒精性脂肪肝。全球大约17亿人患有各种不同类型的慢性肝病，其中25%-30%会发生严重纤维化并最终进展成肝硬化，全球每年死于肝硬化的患者达数十万人^[1]。在中国，肝硬化年发病率17/10万，主要分布于20-50岁男性。城市男性50-60岁肝硬化患者的病死率高达112/10万^[2]。肝硬化是慢性肝病的终末期，而原位肝移植治疗(orthotopic liver transplantation，OLT)是目前治疗终末期肝病的最有效方法，原位肝移植治疗1年生存率约80%，但其缺点包括供肝来源匮乏、免疫排斥、无法有效控制反复感染等问题限制了其应用^[3]。干细胞具有自我更新和多向诱导分化的潜能及在病变组织中起到促进器官修复和再生作用，因此近年来干细胞成为生物医学研究的热门领域。因肝来源的限制及传统治疗方法对于肝硬化治疗的局限性，干细胞移植技术的应用为该病种的治疗提供了新的思路和研究方法。干细胞在体外适宜的培养条件下可以增殖，进而分化为多种功能细胞及组织器官。近年来，动物实验中干细胞移植治疗肝功能损伤已有较多报道，干细胞移植治疗在医学领域取得令人瞩目的成就。其中脐血干细胞来源于脐血单个核细胞群，脐血的单个核细胞群中富含多种干细胞，如造血干细胞、间充质干细胞等等。间充质干细胞作为一种多能干细胞，具有横向分化能力，在一定条件下可分化为肝细胞等。脐血干细胞移植具有以下几个方面的优点：①脐血来源广泛，采集方便，不会给供者造成任何损伤。②脐血中的干细胞较成人骨髓中的干细胞更原始，具有更强的增殖分化能力。③脐血的免疫原性较弱，排斥反应发生率低。④脐血中没有肿瘤细胞^[4]。⑤脐血中间充质干细胞易于分离^[5]。许多研究均证实，可以通过各种不同的方法在体外成功诱导脐血来源的间充质干细胞向肝细胞转化^[6-7]。因此实验应用人脐血单个核细胞治疗失代偿期肝硬化，探讨该方法治疗失代偿期肝硬化的临床疗效。

材料方法

1 对象和方法 Subjects and methods

设计：临床回顾性分析。

时间及地点：于2008年12月至2010年11月在解放军第211医院收集资料。

对象：

纳入标准：①肝硬化Child-Pugh评分B或C级。②大量腹水控制在中等以下。③无严重全身感染。④移植时乙肝病毒低于每毫升10⁵拷贝以下。

排除标准：①肝细胞癌。②有较重低血压或休克等全身循环功能衰竭者。③有严重全身感染者。④疾病晚期，出现难以逆转的呼吸衰竭、严重脑水肿伴有脑疝等频危症状者。⑤高度过敏体质者。

选择2008年12月至2010年11月期间于解放军第211医院行人脐血单个核细胞治疗的肝硬化失代偿期患者23例，Child-Pugh分级：B级14例，C级9例，均符合2005年慢性乙型肝炎防治指南中乙型肝炎肝硬化临床诊断标准。其中男16例，女7例，年龄22-67岁，平均46.48岁。

23例患者中乙肝肝硬化14例，酒精性肝硬化5例，丙肝肝硬化3例，原发性胆汁性肝硬化1例。23例患者术前均存在肝硬化常见症状和体征，包括纳差、乏力、腹胀，同时经腹部B超或腹部CT检查明确诊断肝硬化并合并腹水，术前实验室检查包括血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、血浆白蛋白(ALB)、凝血酶原时间(Pt)、胆碱酯酶(che)，部分患者还检测了血氨、甲胎蛋白及肾功。患者入院后均行对症治疗，包括保肝、利尿等，乙肝肝硬化同时给予核苷(酸)类似物抗病毒治疗。

方法：

脐血单个核细胞制备：患者治疗所用脐血单个核细胞由深圳北科细胞工程研究所制备，制备过程如下：通过供体筛查的产妇，同意脐血捐赠后，由本人或其家属签署《脐带血自愿捐赠同意书》。采用密闭式脐静脉穿刺法采集100-150 mL脐血于一次性血袋中，随后采用二次离心法或离心管直接转移法分离血浆至血浆袋中，-20 ℃冻存。用生理盐水稀释脐血有形成分至均匀，将稀释血液加至分离液上，750×g梯度离心22 min；吸出单个核细胞层的细胞悬液，于收集到的细胞悬液中加入生理盐水洗涤，750×g离心10 min，弃上清；如有红细胞，则分两次加入适量蒸馏水，调整渗透压裂解红细胞，200×g离心10 min收集下层细胞；最后一次洗涤细胞重悬后，取细胞悬液进行计数，离心取上清液做无菌实验，离心后弃上清，用生理盐水重悬细胞，计数，每份单个核细胞数量不小于10⁷-10⁸且细胞活性≥90%，见图1。根据计数结果，调整细胞浓度至(2-6)×10⁹ L^-¹。接种细胞，培养。

移植治疗方式：治疗途径采用肝动脉介入及外周静脉输注，每位患者进行2-4次脐血单个核细胞移植治疗，每次治疗间隔10 d。所有患者均经过解放军第二一一医院道德伦理委员会审核批准进行干细胞移植，所有治疗在患者知情同意情况下进行，签署《知情同意书》。

肝硬化失代偿期患者23例脐血单个核细胞移植治疗方式：

主要观察指标：观察指标包括3部分：一是患者临床症状、体征：二是复查实验室指标；三是影像学检查结果。移植后住院期间及出院后的观察期所选择的病例均未使用保肝药物及输注人血白蛋白等。移植后2，4，8，12，24周分别复查谷丙转氨酶、谷草转氨酶、白蛋白、胆碱酯酶、总胆红素、凝血酶原时间等指标。移植后24周复查肝脏B超或CT。根据临床症状、体征和实验室检查结果，初步将患者疗效分为：显效：临床主要症状、体征(如腹胀、乏力、纳差、浮肿)消失，影像学检查提示胸、腹水消失；有效：临床主要症状、体征消失或明显改善，实验室检查指标2项以上好转；无效：临床症状和体征没有改善或加重，实验室检查指标无好转甚至恶化。

Child-Pugh评分标准：

统计学分析：采用SPSS 13.0统计学软件进行分析处理，数据以x(_)±s表示，采用配对t 检验比较组内治疗前后差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

中国是肝病大国，有资料统计慢性乙型病毒性肝炎患者3 000多万，其中约20%发展为肝硬化，5%发展为肝癌，仅这类失代偿期肝脏疾病患者至少约630万人，死亡率为每年20%-50%。近年来，中国肝移植技术得到了迅速发展，已逐渐成为治疗失代偿期肝脏疾病的重要手段，但存在3大“瓶颈”正阻碍着这项技术更广泛的开展和应用：①肝脏供应缺乏是长期的困扰，以2004年为例，1年中仅有约3 000例患者有“幸”接受肝移植治疗，即潜在适合肝移植的患者中，仅有0.04%的患者接受肝移植治疗，即使活体肝移植率已达30%的美国，每年还有数千人在等待器官移植中死亡，而等待器官移植的患者却以每年11%的速度递增。②免疫排斥反应是难以根本解决的问题：供体肝和受体存在免疫排斥反应，肝移植后需长期应用免疫抑制剂，导致患者免疫力低下，易患各种疾病。③从医疗经济学角度分析，器官移植费用昂贵，对社会、个人乃至国家均是一种沉重的经济负担。

干细胞具有自我更新和多向诱导分化的潜能及在病变组织中起到促进器官修复和再生作用，因此近年来干细胞成为生物医学研究的热门领域。因肝来源的限制及传统的治疗方法对于肝硬化患者治疗的局限性，干细胞移植技术的应用为该病种的治疗提供了新的思路和研究方法。日本学者She-Hoon Oh抽取Wistar大鼠的骨髓在体外培养，加入肝细胞生长因子进行诱导，检测AFP、CK8、CK18等肝细胞特异性标志，发现诱导后骨髓细胞可以分化为肝细胞样细胞，实验证明了间充质细胞可以跨胚层分化为肝样细胞^[8]；Andre Castro Lyra等研究表明骨髓干细胞移植于肝病患者是安全、可行的。同时干细胞移植后血清胆红素与INR水平降低，白蛋白水平升高^[9]；Kakinuma等^[10]的实验证明，脐血干细胞可以在体外诱导成为肝样细胞，移植于肝损伤动物模型能够促进肝损伤修复。Levicar等^[11]将CD34⁺移植于5例肝病患者在12-18个月的随访中，有4例患者白蛋白逐渐升高，且6个月时达正常水平且稳定，3例患者白蛋白水平逐渐升高至12个月时达正常水平且稳定，均未发现肿瘤的形成；Zhang等^[12]报道将人脐带来源间充质干细胞诱导分化为肝细胞，使脐带干细胞治疗肝脏疾病成为可能。Tsai等^[13]研究发现将人脐带来源间充质干细胞移植于CCl₄构建的肝病动物模型中，肝纤维化面积减少，同时人脐带来源间充质干细胞分泌的因子对于肝的损伤修复起到重要作用。

脐血单个核细胞来源于新生儿脐血，其来源广泛、提纯效果好且不受伦理道德等限制，由于其免疫原性低，移植排斥发生率低，国内外学者研究较多^[14]。近年来，国内外对干细胞分化为肝细胞的研究取得了一系列的进步^[13-17]。孙嫣等^[18]在体外将人骨髓间充质干细胞体外分化为肝细胞样细胞。Schwartz等^[19]从人、大鼠和小鼠的新生骨髓中分离出多潜能性成体原始细胞，并且这些成体原始细胞在体外可以分化为肝细胞样细胞。2000年Theise等^[20]从照射诱导后脊髓抑制小鼠的骨髓细胞获得肝细胞。Petersen等^[21]发现骨髓可以作为肝卵圆细胞的资源，并将其移植到大鼠体内后采用2-乙酰氨基氟诱导肝卵圆细胞分化。韩翠萍等^[22]探讨人脐血间充质干细胞与人肝细胞在体外共培养条件下，诱导人脐血间充质干细胞分化为类肝细胞的可行性。无菌条件下采集新生儿脐带血，采用密度梯度离心法与贴壁法分离纯化脐血间充质干细胞，待细胞融合至80%时胰蛋白酶消化传代。应用具有微孔滤膜的插入式细胞培养皿和培养板构建人脐血间充质干细胞-肝细胞共培养模型。结果可见贴壁细胞呈长梭形，强表达CD44和CD29，不表达造血细胞表型CD34和CD45。共培养5 d时长梭形细胞数量减少，随共培养时间的延长，不规则圆形或多角形的细胞逐渐增多，与肝细胞形态相似；共培养5 d时甲胎蛋白mRNA呈阳性表达，其余均为阴性；14 d时细胞角蛋白19 mRNA、白蛋白mRNA开始表达，随着时间延长有增强趋势，甲胎蛋白mRNA表达则较前减弱。提示与LO2人肝细胞共培养后，人脐血间充质干细胞可诱导分化为类肝细胞。上述研究表明，脐血间充质干细胞可在特定环境下诱导为肝样细胞，移植入体内能行使正常肝细胞的功能。詹三华等^[23]应用四氯化碳诱导制作大鼠肝硬化模型，将20只肝硬化SD大鼠随机分为2组，对照组经尾静脉注射0.5 mL生理盐水，治疗组经尾静脉注射氯甲基苯甲酰胺标记的脐血间充质干细胞混悬液，干细胞量为1×10⁶个。2周后治疗组大鼠血清白蛋白质量浓度显著高于对照组(P < 0.05)，胆红素浓度显著低于对照组(P < 0.05)，转氨酶活性显著低于对照组(P < 0.05)。治疗组大鼠肝脏内有大量氯甲基苯甲酰胺标记的红色脐血间充质干细胞，提示脐血间充质干细胞可通过肝硬化模型大鼠尾静脉有效改善肝组织的生理功能。

国内杜玲等^[24]报道利用脐血干细胞治疗失代偿期肝硬化，患者治疗后谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷氨酰转肽酶、总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、凝血酶原时间逐渐下降，其中谷丙转氨酶、凝血酶原时间在治疗后1个月降至正常水平，间接胆红素在治疗后45 d降至正常水平；治疗后3个月复查结果显示进一步好转，6个月的复查结果显示各项指标已稳定在正常水平，而白蛋白在移植后45 d内先呈下降趋势，治疗后3个月再显著上升，治疗后6个月达到正常水平。张丽欣等^[25]对20例肝硬化失代偿期患者，采取介入(经肝固有动脉或门静脉)和静脉输注途径移植脐血干细胞，移植前与移植后3个月丙氨酸氨基转移酶、总胆红素、凝血酶原时间和清蛋白水平比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)，患者腹腔积液减少率为75%(15/20)，乏力好转率为80% (16/20)，肝病面容、肝掌及蜘蛛痣减轻率为70%(14/20)。未见明显不良反应和并发症发生，说明脐血干细胞移植治疗失代偿期肝硬化是一种较安全的治疗方法，可起到暂时性的肝脏支持作用。

本研究利用脐血单个核细胞移植治疗失代偿期肝硬化患者，回访收集肝功能生化检测指标进行数据统计，统计结果分析显示移植后2周内肝功能指标无明显改善(P > 0.05)、移植后4周时，谷丙转氨酶降低并具有显著性意义(P < 0.05)，移植后12周时其余生化指标(白蛋白、胆碱酯酶、总胆红素、凝血酶原时间)改善明显 (P < 0.05)，移植后24周时谷丙转氨酶、白蛋白改善有极显著意义(P < 0.01)。说明随着4次脐血单个核细胞的累积后从移植4周开始脐血单个核细胞在肝脏中替代修复了原受损肝脏细胞，并且大多数患者的腹水、乏力和食欲不振临床症状也明显好转。脐血单个核细胞移植过程中无不良反应发生，仅有极少患者在移植治疗后出现低热症状，无需治疗后症状均在一两天内消失。说明脐血单个核细胞在治疗失代偿期肝硬化上是安全有效的。但由于随访时间短，其中远期疗效仍需继续观察。

随着研究人员对干细胞治疗肝脏疾病的研究，越来越多学者发现干细胞在治疗肝功能衰竭，恢复肝功能，修复受损肝细胞上起到重要作用。虽然干细胞移植是一种行之有效的办法，可以明显改善临床症状，提高生存质量，但仍然不能完全治愈肝硬化患者。现阶段还有许多临床问题需要研究，例如细胞的移植途径，最佳移植时间以及疗程次数，这些均是需要进一步研究和解决的。

由于所选病例有限，观察到的结果有很大的局限性，在今后需要进一步扩大样本量，进一步规范研究手段，得出更加完美的实验结果。综上所述，文章对脐血单个核细胞治疗失代偿期肝硬化的疗效进行了细致的分析和总结，研究数据初步显示了脐血单个核细胞治疗失代偿期肝硬化方面的有效性、安全性和所具有潜在的深远发展前景。