降钙素基因相关肽诱导藻酸钙凝胶复合脂肪干细胞的成骨细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.42.003

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (42): 7356-7362.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.42.003

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降钙素基因相关肽诱导藻酸钙凝胶复合脂肪干细胞的成骨细胞分化

黄长智¹，杨效宁²，刘大诚³，孙一公²，戴醒明²

1福建医科大学附属宁德市医院骨一科，福建省宁德市 352100
2徐州医学院附属徐州市第一人民医院骨一科，江苏省徐州市 221002
3徐州医学院研究生学院，江苏省徐州市 221000

收稿日期:2013-04-15 修回日期:2013-04-30 出版日期:2013-10-15 发布日期:2013-10-31
通讯作者: 杨效宁，博士，硕士生导师，主任医师，教授，徐州医学院附属徐州市第一人民医院骨一科，江苏省徐州市 221002 yang2doc@163.com
作者简介:黄长智★，男，1987年生，福建省福安市人，汉族，2013年徐州医学院毕业，硕士，医师，主要从事关节外科与骨组织工程学研究。 huangchangzhixz@sina.com

Calcitonin gene-related peptide induces the osteogenic differentiation of adipose derived stem cells combined with calcium alginate gel

Huang Chang-zhi¹, Yang Xiao-ning², Liu Da-cheng³, Sun Yi-gong², Dai Xing-ming²

1First Department of Orthopedics, Ningde Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Ningde 352100, Fujian Province, China
2First Department of Orthopedics, the First People’s Hospital of Xuzhou, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China
3Graduate School, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China

Received:2013-04-15 Revised:2013-04-30 Online:2013-10-15 Published:2013-10-31
Contact: Yang Xiao-ning, M.D., Master’s supervisor, Professor, Chief physician, Department of Orthopedics, the First People’s Hospital of Xuzhou, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China yang2doc@163.com
About author:Huang Chang-zhi★, Master, Physician, Department of Orthopedics, Ningde Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Ningde 352100, Fujian Province, China huangchangzhixz@sina.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：降钙素基因相关肽已被证实具有诱导成骨细胞分化作用，但其是否可使三维培养下的脂肪干细胞向成骨细胞分化构建组织工程骨的相关报道少见。
目的：探讨外源性降钙素基因相关肽诱导兔脂肪干细胞复合藻酸钙凝胶三维培养成骨分化的可行性。
方法：取新西兰兔双侧腹股沟区皮下脂肪垫，Ⅰ型胶原酶消化离心贴壁法分离培养脂肪干细胞，取第3代与海藻酸钠混合制备凝胶，于24孔板分组培养：对照组加入含10^-2 mol/L β-甘油磷酸钠、10^-7 mol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、体积分数10%胎牛血清的DMEM/F-12骨诱导培养基，实验组在此基础上再加入1.5 µg/L降钙素基因相关肽进行诱导培养。于诱导不同时间点MTT法检测细胞增殖，RT-PCR法检测诱导细胞Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA的表达，并检测碱性磷酸酶及钙离子浓度。
结果与结论：兔脂肪干细胞的增殖曲线呈“S”型，实验组诱导1，3，5，7，14，21 d的A值高于对照组(P < 0.05)；诱导2周后两组细胞碱性磷酸酶、茜素红染色均阳性，但实验组钙结节较对照组明显增多。实验组诱导7，14 d的Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA表达均强于对照组。实验组诱导1，2，3，4周的碱性磷酸酶活性及钙离子浓度均高于对照组(P< 0.05)。结果表明降钙素基因相关肽能诱导复合藻酸钙凝胶的脂肪干细胞向成骨细胞分化。

关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 复合支架材料, 降钙素基因相关肽, 脂肪干细胞, 成骨分化, 藻酸钙凝胶, 三维培养

Abstract:

BACKGROUND: Calcitonin gene-related peptide has been confirmed to induce osteogenic differentiation, but whether it can induce the osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells under three-dimensional culture to construct tissue-engineered bone is rarely reported.
OBJECTIVE: To investigate the feasibility of exogenous calcitonin gene-related peptide to induce osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells combined with calcium alginate gel in three-dimensional condition.
METHODS: Adipose-derived stem cells were gained by collagenase I digestion of the subcutaneous adipose tissue of both inguinal regions of New Zealand rabbits. Passage 3 cells were mixed with sodium alginate to prepare calcium alginate gel, and then the cells were assigned into two groups and cultured in 24-well plates. Adipose-derived stem cells in the control group were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s nutrient mixture F-12 supplemented with 10^-2 mol/L β-glycerophosphate sodium, 10^-7 mol/L dexamethasone, 50 mg/L ascorbic acid, 10% fetal bovine serum. While, adipose-derived stem cells in the experimental group were incubated with the same medium as above, but 1.5 µg/L calcitonin gene-related peptide was added. The cells proliferation and the mRNA expressions of collagen I and osteocalcin were detected by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide and reverse transcription-PCR respectively, and alkaline phosphatase and calcium concentration were detected at different induction time.
RESULTS AND CONCLUSION: The cell proliferation curves were S shaped. The absorbance values of the experimental group were higher than those of the control group at1, 3, 5, 7, 14, 21 days after osteogenic induction (P < 0.05). Alkaline phosphatase and alizarin red staining of adipose-derived stem cells was all positive, but golden round nodes became more and bigger in the experimental group compared with the control group after 2 weeks. At 7 and 14 days, collagen I and osteocalcin mRNA expressions were higher in the experimental group than in the control group. Alkaline phosphatase activity and calcium concentration of the experimental group were higher than those of the control group at 1, 2, 3, 4 weeks after osteogenic induction (P < 0.05). Results showed that the calcitonin gene-related peptide can induce the osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells combined with calcium alginate gel.

Key words: biocompatible materials, calcitonin gene-related peptide, gels, stem cells

中图分类号:

R318

黄长智，杨效宁，刘大诚，孙一公，戴醒明 . 降钙素基因相关肽诱导藻酸钙凝胶复合脂肪干细胞的成骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(42): 7356-7362.

Huang Chang-zhi, Yang Xiao-ning, Liu Da-cheng, Sun Yi-gong, Dai Xing-ming . Calcitonin gene-related peptide induces the osteogenic differentiation of adipose derived stem cells combined with calcium alginate gel[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(42): 7356-7362.

图/表（结果） 6

2.1 脂肪干细胞形态学观察 见图1。

初分离的细胞形态呈小圆形，培养24-48 h开始贴壁，未贴壁细胞为圆形或球形红细胞，首次换液去除未贴壁细胞可见大部分贴壁细胞呈梭形、多角形，见图1A。随培养时间的延长，细胞数量增多，形态为典型的长梭形，呈集落式、团簇状生长；5-7 d时细胞融合达80%-90%，呈“漩涡状”排列，见图1B。传代后细胞生长速度加快，三四天可传代，并能长期稳定培养，见图1C。

2.2 脂肪干细胞的成骨分化鉴定 诱导2周后两组细胞碱性磷酸酶、茜素红染色均为阳性，见图2，但实验组钙化结节明显较对照组增多且体积大。

2.3 脂肪干细胞的鉴定 免疫荧光染色法检测脂肪干细胞表面分子结果显示，细胞表面抗原CD44呈阳性，见图3A，表明这种细胞为间充质干细胞；而表面抗原CD45呈阴性，见图3B，证明细胞并非来源于血液循环中的干细胞。

2.4 MTT法检测成骨诱导后三维培养脂肪干细胞的增殖活性 两组细胞随着培养时间延长A值均升高，但实验组与对照组相比除第1天外，在各时间点的A值比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，同时实验组在不同诱导时相的变化趋势有统计学意义(P < 0.05)，表明降钙素基因相关肽对脂肪干细胞的成骨分化有促进作用，结果见图4。

2.5 RT-PCR检测成骨诱导后三维培养脂肪干细胞Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA的表达 成骨诱导7，14 d实验组Ⅰ型胶原 mRNA和骨钙素 mRNA的表达均强于对照组，见图5。

2.6 成骨诱导后三维培养脂肪干细胞碱性磷酸酶活性的测定 各个时间点实验组的碱性磷酸酶活性均高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。两组碱性磷酸酶活性的变化趋势也不同，实验组的变化幅度更大，两组第2周后碱性磷酸酶活性达峰值，此后逐步下降，见表1。

2.7 成骨诱导后三维培养脂肪干细胞钙离子浓度的测定 各个时间点实验组钙离子浓度均高于对照组(P < 0.05)。两组钙离子浓度的变化趋势也不同，1，2周两组变化趋势相似，3，4周实验组变化幅度明显高于对照组，见表2。

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引言

降钙素基因相关肽作为最丰富的一种神经肽，目前国内外对其研究主要集中在神经系统和心血管系统上^[1-3]，对骨缺损修复方面的研究很少，新近研究发现降钙素基因相关肽在骨修复及骨重建中发挥重要作用。Hukkanen等^[4]研究发现在大鼠骨折处周围、骨外膜中降钙素基因相关肽阳性神经纤维发生起始退化而后迅速增殖；此后随着骨痂形成及骨改建的进展其分布和密度也发生变化。

Aoki等^[5]研究也证实在大鼠骨折愈合过程中，纤维肉芽组织、骨膜及新生骨组织中均出现大量降钙素基因相关肽阳性神经纤维，并随着骨痂形成及骨改建其增生程度发生有序的增减。这些增生的感觉神经纤维能在局部释放出远高于血清水平的降钙素基因相关肽，参与正常骨愈合过程。Li等^[6]也在胫骨骨折大鼠模型中发现骨折发生后可刺激损伤局部产生大量新生降钙素基因相关肽阳性神经纤维，这也许是骨折愈合和重塑的先决条件。Hayashi等^[7]发现脊髓损伤合并骨折大鼠血清降钙素基因相关肽早期表达明显增高，伤后7 d达正常3倍以上，伤后3，7 d与单纯骨折组比较差异有显著性意义 (P < 0.01)。

Onuoha^[8]利用ELISA法测定骨折患者24 h内血浆中降钙素基因相关肽水平的变化，发现患者血浆中降钙素基因相关肽水平较对照组明显升高。孙晓新等^[9]通过动物实验观察到，骨折合并中枢神经损伤组在骨折愈合不同阶段，各种参与骨愈合的细胞其降钙素基因相关肽表达量明显高于单纯骨折组，且骨折端骨痂形成及改建均早于单纯骨折组。Ekelund等^[10]通过对降钙素基因相关肽阳性神经纤维在异位骨化处的分布研究，发现该神经纤维的分布密度与局部骨形成量呈正相关。

人长骨骨干骨折不愈合处的降钙素基因相关肽阳性神经纤维稀疏或缺失；去除腓骨骨折大鼠骨膜的感觉神经终端降钙素基因相关肽阳性神经纤维，可导致骨折不愈合^[11]。如切断大鼠坐骨神经，则胫骨骨折骨痂较正常大，但密度低且力学性能差，骨痂处无降钙素基因相关肽阳性神经纤维长入^[12]。而在大鼠脊髓损伤模型观察到，胫骨骨折处早期形成大量的纤维骨痂和软骨骨痂，这一时期骨痂内降钙素基因相关肽呈强阳性表达；但骨折2周后骨痂内的降钙素基因相关肽明显减少，伴随纤维骨痂和软骨骨痂向骨性骨痂转化明显减慢^[13]。

这些研究均表明降钙素基因相关肽及降钙素基因相关肽阳性神经纤维在骨形成、骨修复及骨重建中发挥着重要作用。体外实验也发现了成骨细胞表面降钙素基因相关肽受体的存在^[14]，但是降钙素基因相关肽是否具有促使脂肪干细胞向成骨细胞定向分化的作用相关报道罕见。实验利用藻酸钙凝胶三维培养方法来观察降钙素基因相关肽对兔脂肪干细胞向成骨细胞增殖、分化的影响。

材料方法

设计：观察性实验。

时间及地点：于2012年7月至2013年1月在徐州医学院附属医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：3月龄清洁级健康新西兰大白兔2只，雌雄不拘，体质量2.5-3.5 kg，由徐州医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(苏)2005-0005。

实验过程中对动物的处置符合2006年中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中的规定^[15]。

降钙素基因相关肽诱导藻酸钙凝胶复合脂肪干细胞向成骨细胞分化实验的主要试剂及仪器：

实验方法：

兔脂肪干细胞的分离培养^[16-17]：取3月龄新西兰白兔，以2 mL/kg的10%水合氯醛经耳缘静脉注射麻醉后，备皮、消毒，取下腹部正中切口至深筋膜，向两侧的腹股沟区分离，暴露双侧腹股沟脂肪垫，并完整取出。置于直径10 cm培养皿中，无菌条件下清除外包膜、明显的结缔组织和肉眼可见的小血管。尽可能去除包膜及结缔组织后用PBS清洗3-5次去除红细胞。眼科剪将组织剪成1.0-2.0 mm³组织块，加入3-5倍体积0.1%Ⅰ型胶原酶，37 ℃水浴摇床上消化60 min后，加入等体积含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基终止消化，200目尼龙网格滤网过滤，离心半径为9 cm，1 200 r/min离心5 min，弃上清，加入含体积分数10% 胎牛血清的DMEM/F-12培养基重悬浮细胞，将细胞收集调整细胞浓度为 1×10⁹ L^-1接种至含基础培养基的25 cm²培养瓶中。置于37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度恒温培养箱进行单层细胞培养。

培养24 h后显微镜下轻轻晃动培养瓶，见大部分细胞贴壁后，首次换液去除未贴壁细胞。以后每3 d换液1次，于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，待细胞生长融合达80%-90%后进行纯化并首次传代。

兔脂肪干细胞的鉴定^[18-19]：

干细胞表面标记物检测：取第3代细胞以1×10⁹ L^-1 浓度接种于预置盖玻片的6孔板，每孔加入1.5 mL含体积分数10% 胎牛血清的DMEM/F-12培养基，37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度恒温培养箱培养至细胞达80%-90%融合。用预温的PBS洗3次，每次5 min；40 g/L多聚甲醛固定30 min；PBS洗3次，每次5 min；0.2%Triton X-100透化2-5 min；PBS洗3次，每次5 min；体积分数5%山羊封闭血清并室温孵育30 min，弃封闭液；加入鼠抗兔CD44、CD45抗体反应液，4 ℃孵育过夜；弃一抗，PBS洗3次，每次5 min；加入FITC荧光素标记的二抗37 ℃避光孵育30 min；PBS洗3次，每次 5 min；95%甘油封固，荧光显微镜下观察染色情况。

干细胞成骨诱导：取第3代细胞以1×10⁹ L^-1浓度接种于预置盖玻片的6孔板，分为两组，对照组加入含 10^-2mol/Lβ-甘油磷酸钠、10^-7mol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F-12骨诱导培养基，实验组在此基础上再加入1.5 µg/L降钙素基因相关肽进行诱导培养。①碱性磷酸酶染色：诱导2周后分别取出两组6孔板中盖玻片，按照碱性磷酸酶染色试剂盒说明书进行操作。②茜素红染色：诱导2周后分别取出两组6孔板中盖玻片，用40 g/L多聚甲醛固定 30 min，PBS漂洗后加入2%茜素红染色液1 mL，室温孵育20 min，倒置相差显微镜下观察并拍照。

复合载体的制备及实验分组：取第3代单层培养细胞1×10⁸ L^-1+2 mL 12 g/L海藻酸钠吹打均匀，将混合液用吸管(50 µL/粒)，约2 500细胞/粒，滴于24孔板中，每孔含1 mL 10² mmol/L CaCl₂，每孔滴200 µL，12个复孔，37 ℃、10 min室温下成凝胶，用PBS洗3次，分为两组，对照组加入含10^-2 mol/L β-甘油磷酸钠、10^-7mol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F-12骨诱导培养基，实验组在此基础上再加入1.5 µg/L降钙素基因相关肽进行诱导培养。

MTT法检测成骨诱导后脂肪干细胞的增殖活性：分别于培养1，3，5，7，14，21 d后取出两组细胞，每组6孔，先用55 mmol/L柠檬酸钠溶解复合载体，离心收集细胞至96孔板，每孔加入200 µL DMEM/F-12(含体积分数10%胎牛血清和双抗)培养液及20 µL 5 g/L MTT溶液，37 ℃孵育4 h。吸弃上清液，每孔加入150 µL DMSO，振荡10 min。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度(A值)，以6孔A值的均值为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。

RT-PCR检测细胞Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA的表达：于成骨诱导7，14 d终止培养，先用55 mmol/L柠檬酸钠溶解复合载体，离心收集细胞，以Trizol试剂裂解细胞，抽提细胞总RNA，鉴定RNA纯度，用RT试剂盒RNA反转录为cDNA。然后以cDNA的第一链作为模板进行PCR扩增。骨钙素上游引物：5’-CAT GAG AGC CCT CAC A-3’，下游引物：5’-AGA GCG ACA CCC TAG AC-3’；Ⅰ型胶原上游引物：5’-GGC AAA CAT GGA AAC CG-3’，下游引物：5’-TCA AGG AAG GGC AAA CG-3’。PCR条件： 94 ℃预变性5 min，随后94 ℃变性30 s， 52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共进行30个循环，再72 ℃延伸10 min。PCR产物经电泳、DNA吸光度扫描检测，与β-actin内参条带的比值为mRNA表达水平参数。

细胞碱性磷酸酶活性检测：分别于诱导1，2，3，4周时取出两组细胞，每组4孔，先用55 mmol/L柠檬酸钠溶解复合载体，离心收集细胞至96孔板，加入0.2 mL 1%的TritonX-100于4 ℃过夜，然后按照碱性磷酸酶测试盒说明书进行操作。碱性磷酸酶浓度以kat/L表示。

钙离子浓度检测：分别于诱导1，2，3，4周时取出各组细胞，每组4孔，先用55 mmol/L柠檬酸钠溶解复合载体，离心收集细胞至96孔板，加入0.2 mL 1%的TritonX-100于4 ℃过夜，然后按照钙离子检测试剂盒说明书进行操作。钙离子浓度以mmol/L表示。

主要观察指标：①应用免疫荧光染色法检测脂肪干细胞表面CD44、CD45的表达。②脂肪干细胞形态观察及增殖曲线。③应碱性磷酸酶、茜素红染色检测脂肪干细胞成骨诱导分化。④观察诱导后细胞骨钙素及Ⅰ型胶原酶mRNA的表达。⑤成骨细胞碱性磷酸酶活性及钙离子浓度。

统计学分析：由第一作者应用SPSS 16.0 统计软件包进行分析。数据以x(_)±s表示，组间比较采用配对样本t 检验和单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

各种因素如感染、创伤、肿瘤等所造成的骨缺损修复治疗一直是骨科界的难题之一。随着组织工程技术的兴起和迅猛发展为骨缺损修复重建带来了新的治疗途径。组织工程骨、转基因工程骨等修复骨缺损研究也取得了一定进展^[20-23]。脂肪干细胞是近年来发现的一种成体干细胞，因具有来源丰富、取材方便、对机体损伤小、增殖快、多向分化潜能及安全性高等优点，故迅速成为组织工程学、再生医学等领域的研究热点^[24]。组织工程技术主要包括种子细胞、生物活性因子和载体材料。脂肪干细胞作为新型的种子细胞目前已成为骨、软骨组织工程研究的焦点。而作为载体支架的藻酸钙凝胶具有三位立体结构、良好的生物相容性、可降解性、亲水性，还具有良好的细胞吸附性和可塑性，有利于营养物质的扩散和细胞之间的联系^[25]，已被美国FDA批准广泛应用于药物剂型研制、食品工业、伤口敷料及骨及软骨组织工程。

降钙素基因相关肽作为最丰富的一种神经肽，是1983年Rosenfeld等^[26]应用DNA重组和分子生物学技术研究发现的一种生物活性多肽。1984年Morris等^[27]第1次在人甲状腺髓样癌组织中提取出降钙素基因相关肽，从而证实了此肽存在于人体中。目前已知人、大鼠、小鼠、兔等脊髓动物体内均含有降钙素基因相关肽^[28]。降钙素基因相关肽是一类多功能的激素多肽，分为降钙素基因相关肽1、降钙素基因相关肽2两种亚型，是目前已知作用最强的血管扩张物质^[28]，因其广泛的生物学效应逐渐受到重视。降钙素基因相关肽在骨形成过程中发挥重要作用，可以促进骨形成、抑制骨吸收^[29-30]。多年来的研究证明，与骨组织代谢直接相关的骨髓基质细胞、成骨细胞、骨髓巨噬细胞、破骨细胞4种细胞表面均存在降钙素基因相关肽受体^[29]。Jimenez-Andrade等^[31]采用RT-PCR方法发现成骨细胞表面有降钙素基因相关肽受体的mRNA表达，进而证实了成骨细胞降钙素基因相关肽受体的存在。研究发现，降钙素基因相关肽对成骨细胞的Ca²⁺、cAMP、PCK、IGF等细胞生长因子的调控，是发挥其对成骨细胞调控的重要作用途径^[32]。

实验利用降钙素基因相关肽促进藻酸钙凝胶三维培养条件下的脂肪干细胞向成骨细胞分化，在诱导2周后两组细胞的碱性磷酸酶、钙化结节染色均阳性，通过对诱导1，2，3，4周的碱性磷酸酶浓度和钙离子浓度变化进行分析发现，碱性磷酸酶1，2周递增，此后逐步下降；而钙离子1-4周成递增趋势；且降钙素基因相关肽诱导组均显著高于对照组。与对照组相比，实验组钙化结节数量多、体积大。实验组诱导7，14 d成骨细胞标志性蛋白Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA表达的RT-PCR检测结果均强于对照组，由此证明实现了脂肪干细胞向成骨细胞的诱导分化，同时也说明降钙素基因相关肽具有促进脂肪干细胞向成骨细胞分化的作用。

总之，实验虽在体外成功利用重组人降钙素基因相关肽诱导三维培养条件下的兔脂肪干细胞向成骨细胞分化，但诱导后的成骨细胞在体内是否具有同样的生物学性能，是否能够最终修复骨缺损，还有待进一步开展其在修复骨缺损方面的动物实验研究。

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降钙素基因相关肽作为最丰富的一种神经肽，是1983年Rosenfeld等应用DNA重组和分子生物学技术研究发现的一种生物活性多肽。1984年Morris等第1次在人甲状腺髓样癌组织中提取出降钙素基因相关肽，从而证实了此肽存在于人体中。目前已知人、大鼠、小鼠、兔等脊髓动物体内均含有降钙素基因相关肽。降钙素基因相关肽是一类多功能的激素多肽，分为降钙素基因相关肽1、降钙素基因相关肽2两种亚型，是目前已知作用最强的血管扩张物质^]，因其广泛的生物学效应逐渐受到重视。降钙素基因相关肽在骨形成过程中发挥重要作用，可以促进骨形成、抑制骨吸收。多年来的研究证明，与骨组织代谢直接相关的骨髓基质细胞、成骨细胞、骨髓巨噬细胞、破骨细胞4种细胞表面均存在降钙素基因相关肽受体。Jimenez-Andrade等采用RT-PCR方法发现成骨细胞表面有降钙素基因相关肽受体的mRNA表达，进而证实了成骨细胞降钙素基因相关肽受体的存在。研究发现，降钙素基因相关肽对成骨细胞的Ca²⁺、cAMP、PCK、IGF等细胞生长因子的调控，是发挥其对成骨细胞调控的重要作用途径。

实验利用降钙素基因相关肽促进藻酸钙凝胶三维培养条件下的脂肪干细胞向成骨细胞分化，在诱导2周后两组细胞的碱性磷酸酶、钙化结节染色均阳性，通过对诱导1，2，3，4周的碱性磷酸酶浓度和钙离子浓度变化进行分析发现，碱性磷酸酶1，2周递增，此后逐步下降；而钙离子1-4周成递增趋势；且降钙素基因相关肽诱导组均显著高于对照组。与对照组相比，实验组钙化结节数量多、体积大。实验组诱导7，14d成骨细胞标志性蛋白I型胶原和骨钙素mRNA表达的RT-PCR检测结果均强于对照组，由此证明实现了脂肪干细胞向成骨细胞的诱导分化，同时也说明降钙素基因相关肽具有促进脂肪干细胞向成骨细胞分化的作用。

降钙素基因相关肽诱导藻酸钙凝胶复合脂肪干细胞的成骨细胞分化

Calcitonin gene-related peptide induces the osteogenic differentiation of adipose derived stem cells combined with calcium alginate gel

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