miR-376b-3p可促进Runx2诱导C2C12细胞进行成骨细胞早期分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.28.002

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (28): 5108-5112.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.28.002

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miR-376b-3p可促进Runx2诱导C2C12细胞进行成骨细胞早期分化

耿倩倩¹，余守和¹，张越^{1, 2}，王红梅¹，孙奋勇^{1, 2}

1暨南大学生物工程研究所，广东省广州市 510632；
2同济大学附属第十人民医院，上海市 200072

出版日期:2013-07-09 发布日期:2013-07-09
通讯作者: 孙奋勇，博士，博士生导师，同济大学附属第十人民医院，上海市 200072 sunfenyong@263.net
作者简介:耿倩倩，女，1985年生，山东省邹平县人，汉族，硕士，主要从事遗传学方面的研究。 mimiqianqian@126.com
基金资助:
国家自然科学基金项目(81071524)资助。

miR-376b-3p promotes Runx2-induced early osteogenic differentiation of C2C12 cells

Geng Qian-qian¹, Yu Shou-he¹, Zhang Yue^{1, 2}, Wang Hong-mei¹, Sun Fen-yong^{1, 2}

1Institute of Bioengineering, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China;
2Tenth People’s Hospital of Tongji University, Shanghai 200072, China

Online:2013-07-09 Published:2013-07-09
Contact: Sun Fen-yong, Doctor, Doctoral supervisor, Institute of Bioengineering, Jinan University, Guangzhou, 510632, Guangdong Province, China; Tenth People’s Hospital of Tongji University, Shanghai 200072, China sunfenyong@263.net
About author:Geng Qian-qian, Master, Institute of Bioengineering, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China mimiqianqian@126.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81071524*

摘要/Abstract

摘要：

背景：转录因子Runx2是调节成骨分化及骨发育的关键因子，过表达Runx2可诱导间质细胞C2C12分化为成骨细胞，但相关诱导分化分子机制并不清楚。

目的：分析miR-376家族成员在Runx2诱导C2C12细胞进行成骨分化过程中的作用。

方法：利用可诱导表达Runx2的细胞系C2C12/Runx2^Dox，在不同的时间点通过荧光定量PCR方法检测miR-376家族成员表达情况。C2C12/Runx2 ^Dox细胞转染miR-376b-3p mimic后利用荧光定量PCR检测成骨细胞标记基因碱性磷酸酶及骨钙素表达情况，并利用碱性磷酸酶染色法分析碱性磷酸酶活性。利用在线工具miRanda, miRWalk与TargetScan共同预测miR-376b-3p潜在靶基因。利用DAVID Bioinformatics Resources数据库对得到的靶基因进行功能聚类分析。

结果与结论：在Runx2诱导C2C12进行成骨分化过程中miR-376b-3p表达显著增加，其他成员表达无明显变化。转染miR-376b-3p mimic可上调碱性磷酸酶表达，但对骨钙素表达无影响；转染miR-376b-3p mimic也可增加碱性磷酸酶活性。靶基因功能聚类分析结果表明miR-376b-3p可参与机体骨骼发育过程，表明其在成骨分化过程中的作用。研究结果表明，Runx2通过上调miR-376b-3p的方式对与成骨分化相关基因的表达进行调节，以促进C2C12进行成骨细胞的早期分化。

关键词: 组织构建, 骨组织构建, Runx2, C2C12细胞, miR-376b-3p, 成骨分化, 强力霉素, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The transcription factor Runx2 is the key factor that regulates osteogenic differention and bone development. It has been reported that the C2C12 mesenchymal cells can be induced to differentiate into osteoblasts by Runx2 overexpression, but the molecular mechanism of induction is still largely unclear.

OBJECTIVE: To investigate the role of the members of the miR-376 family during Runx2-induced osteogenic differentiation in C2C12 cells.

METHODS: The expression of the members of the miR-376 family was detected by real-time quantitative PCR at different time points using C2C12/Runx2^Dox sub-line with conditional Runx2 expression. In miR-376b-3p-transfected C2C12/Runx2^Dox cells, the expression of osteoblast markers, such as alkaline phosphatase and osteocalcin, was detected by real-time quantitative PCR, and the alkaline phosphatase activity was also examined by alkaline phosphatase staining. The putative miR-376b-3p targets were commonly predicted by online tools (miRanda, miRWalk and TargetScan). The functional classification of these putative targets was performed by DAVID Bioinformatics Resources database.

RESULTS AND CONCLUSION: The expression of miR-376b-3p was significantly increased during Runx2-induced osteogenic differentiation of C2C12 cells, but the expression of other members was not changed. Transfection of miR-376b-3p mimic upregulated alkaline phosphatase expression, but had no effect on osteocalcin expression. The alkaline phosphatase activity was also increased by transfection of miR-376b-3p. The functional classification of miR-376b-3p putative targets showed that miR-376b-3p is involved in the skeleton development, indicating the role of miR-376b-3p in osteoblast differentiation. Taken together, these results suggest that Runx2promotes early osteogenic differentiation in C2C12 cells by regulating the expression of genes related to osteogenic differentiation through upregulation of miR-376b-3p.

Key words: tissue construction, bone tissue construction, Runx2, C2C12 cells, miR-376b-3p, osteogenic differentiation, doxycycline, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

耿倩倩，余守和，张越，王红梅，孙奋勇. miR-376b-3p可促进Runx2诱导C2C12细胞进行成骨细胞早期分化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(28): 5108-5112.

Geng Qian-qian, Yu Shou-he, Zhang Yue, Wang Hong-mei, Sun Fen-yong. miR-376b-3p promotes Runx2-induced early osteogenic differentiation of C2C12 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(28): 5108-5112.

图/表（结果） 3

2.1 Runx2可激活miR-376b家族成员miR-376b-3p的表达 见图1。

为分析miR-376家族成员在Runx2诱导C2C12细胞进行成骨分化过程中的作用，首先利用实时定量PCR的方法对相关成员的表达水平进行分析。检测结果表明在C2C12/Runx2 ^Dox细胞用强力霉素(10 mg/L)诱导0，3，6，9，12，24，48，72 h后，miR-376b-3p的相对表达量依次为1，1.144±0.213，3.549±0.321，3.991± 0.124，3.222±0.415，2.457±0.34，2.277±0.141，1.329± 0.102，由此可见在诱导C2C12细胞进行成骨分化过程中，Runx2可激活miR-376b-3p表达，见图1。对其他成员，即miR-376a(-3p与-5p)、miR-376b-5p、miR-376c (-3p与-5p),则无明显调节作用(未提供数据)。 2.2 MiR-376b-3p可促进成骨细胞早期分化 见图2。

在诱导分化过程中，Runx2可显著上调miR-376b-3p的表达水平，暗示该miRNA对此分化过程可能具有正向调节作用。将miR-NC和miR-376b-3p mimic分别转染C2C12/Runx2 ^Dox细胞后用强力霉素(10 mg/L)诱导培养3 d，并通过荧光定量PCR方法分析成骨细胞早期分化标记基因碱性磷酸酶与晚期分化标记基因骨钙素表达情况，结果发现与转染miR-NC样品相比，转染miR-376b-3p可明显上调碱性磷酸酶表达，但对骨钙素表达无明显影响，见图2A。同时也发现，与转染miR-NC样品相比，转染miR-376b-3p可明显增强碱性磷酸酶活性，见图2B。以上结果说明miR-376b-3p可促进Runx2诱导C2C12细胞进行成骨细胞早期分化，但对成骨细胞晚期分化没有调节作用。 2.3 miR-376b-3p可调节与骨骼发育有关基因的表达 为解析miR-376b-3p调节成骨细胞早期分化的可能分子机制，需要对其潜在靶基因进行分析。通过利用miRanda，miRWalk，TargetScan三个在线软件共同预测miR-376b-3p靶基因，一共得到可信度较高的靶基因604个，随后用DAVID Bioinformatics Resources数据库对这些靶基因进行功能分类，分析结果表明miR-376b -3p的潜在靶基因主要与转录调控，磷酸盐代谢，细胞分化，骨骼系统发育等过程有关，见图3。结合miR-376b-3p具有的促成骨细胞早期分化的作用，参与骨骼系统发育(skeleton system development)过程的潜在靶基因可能是该miRNA调节的靶基因。有关这一类群的基因有：Bmi1，Ibsp，Zbtb7a，Twsg1，Impad1， Tbx3，Ndst1，Edn1，Gas1，Six4, Wwtr1，Mmp2， Alox15，Pbx1，Papss2。后续的研究需要通过一系列实验方法来证明miR-376b-3p与这些潜在靶基因的关系。

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引言

材料方法

设计：细胞分子水平实验。

时间及地点：于2011年3月至2012年1月在暨南大学生物工程研究所实验室完成。

材料：

细胞系：C2C12/Runx2 ^Dox细胞是利用Tet-on advanced基因表达系统在小鼠成肌细胞C2C12中建立的由强力霉素调节Runx2表达的单因子诱导成骨分化模型，为作者所在实验室自己构建。

方法：

细胞培养：C2C12/Runx2 ^Dox细胞培养在含体积分数10%胎牛血清，800 mg/L G418，500 mg/L潮霉素的DMEM培养液中，并置于37℃，体积分数5%的CO₂培养箱中，隔日换液1次，细胞经传代和收获, 取对数生长期细胞进行实验。

总RNA提取：取对数生长期的C2C12/Runx2 ^Dox细胞以1×10⁵/cm²细胞的接种于六孔培养板上，并加入G418(800 mg/L)和潮霉素(500 mg/L)。待24 h细胞完全贴壁以后，加入强力霉素(10 mg/L)对细胞按照0，3，6，9，12，24，48，72 h 8个不同时间段分别进行诱导。诱导结束后弃培养基，用PBS洗3次后，每孔加入500 µL的Trizol裂解细胞，混匀，冰上孵育5 min后收集于 1.5 mL Eppendorf管中。每孔加入100 µL氯仿, 剧烈震荡混匀30 s，室温静止10 min，4 ℃下，12 000 r/min，室温离心15 min。取上清液至新的Eppendorf管，加等体积异丙醇，-20 ℃静置15 min。4 ℃下，12 000 r/min，离心15 min，弃上清，75% DEPC水配制的乙醇0.5mL洗涤沉淀1次，12 000 r/min，离心10 min。弃上清，空气干燥10 min，加0.1% DEPC水50 µL溶解RNA沉淀，置于-20 ℃冰箱保存备用。

反转录：取1 µg的总RNA并加入DEPC水到总体积为12 µL，65 ℃保温5 min，使RNA变性。随后立即冰上制冷，以防变性。在该PCR管中分别加入0.5 µL的相应miRNA RT primer(或随机引物)，U6下游primer (或oligo dT引物)，RNase inhibitor，反转录酶M-MLV，2.0 µL的10 µmol/L dNTP，4 µL的5×buffer，将上述20 µL反应溶液30 ℃保温10 min，42 ℃保温60 min，72 ℃保温 10 min，最终逆转为所需的cDNA溶液。在检测基因表达水平时进行反转录所用引物是随机引物与oligo dT。在检测miNRA表达水平时进行反转录所用引物是相应miRNA的特异性反转录引物与U6下游引物。

实时定量PCR：采用SYBR Green PCR Master Mix 试剂,在基因公司的扩增仪上进行反应，PCR反应体系为：cDNA 1 µL，基因或miRNA上下游10 µmol/L引物各0.8 µL，SYBR Green PCR Master Mix10 µL，加H₂O补至20 µL。同时按照相同方式准备检测内参表达水平的反应液。每个样品设3个复孔。反应条件为：预变性，95 ℃ 10 s；变性，95 ℃ 5 s；退火延伸，60 ℃ 30 s；延伸，72 ℃ 15 s，40个循环。操作步骤按照说明书进行。整个过程都收集荧光,每分钟读1次信号。反应结束后，使用系统软件分析PCR过程各检测样本的Ct (Threshold cycle) 值，Ct值随模板浓度增大而减少。由熔解曲线判断PCR反应的特异性，用基于2^-△△CT方法进行相对定量分析。进行miRNA表达水平检测时所用内参是U6 small nuclear RNA，进行基因表达水平检测的时候所用内参是18s rRNA。所用PCR引物都由上海生工合成。

miR-376b-3p mimic转染实验：将miR-376b-3p mimic冻干粉用DEPC水溶解为10 μmol/L的母液保存备用。取对数生长期的C2C12/Runx2^Dox细胞以1×10⁴/cm²(24孔板)或1×10⁵/cm²(6孔板)密度接种于培养板中。待细胞汇合至50%时弃培养基，并用PBS洗3次，吸干，取200 µL的OPTI-MEM培养基并加入相应体积的Lipofectamine2000脂质体(24孔板加1 µL；6孔板加 4 µL)混匀后静置5 min，再取200 µL的OPTI-MEM培养基并加入相应体积的miR-376b-3p mimic(转染终浓度为50 nmol/L)后混匀，然后将两管混合液加在一起混匀后室温静置20 min。最后将混合液加入培养板中于37 ℃，体积分数5%的CO₂培养箱中培养5 h。5 h后更换为含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，并加入G418(800 mg/L)、潮霉素(500 mg/L)和强力霉素 (10 mg/L)进行培养。MiR-NC的转染方式与miR-376b-3p mimic相同。

碱性磷酸酶染色：将培养好的细胞用PBS洗3次以去除培养基，而后用体积分数95%的乙醇固定细胞 10 min，晾干，然后加入碱性磷酸酶反应底液在37 ℃条件下孵育4 h，1%的硝酸钴处理2 min，冲洗1.0- 2.0 min。1%的硫化铵处理1.0-2.0 min，水洗5 min后晾干拍照。

靶基因预测与功能分类：利用在线预测miRNA靶基因的数据库miRanda, miRWalk与TargetScan共同预测miR-376b-3p潜在靶基因，然后用DAVID Bioinformatics Resources数据库将预测得到的靶基因进行功能分类。

主要观察指标：miR-376b-3p表达水平，成骨分化标记基因碱性磷酸酶与骨钙素表达水平，碱性磷酸酶活性。

统计学分析：用SPSS 13.0软件进行统计分析处理，并作组间独立t检验，实验数据以x(_)±s表示，以 P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

Runx2是调节成骨分化与骨发育的关键转录因子，有研究表明在小鼠原代骨骼肌细胞及3T3-L1前脂肪细胞单独过表达Runx2可促进其分化为成骨细胞^[8]。Runx2缺陷型的纯合体小鼠缺乏骨骼矿化的能力，产后立即死亡；杂合体则可以存活，但骨骼系统存在发育缺陷^[9]。Runx2过表达的转基因小鼠出现骨质疏松的症状^[10]。在人体中出现Runx2杂合突变会引发常染色体遗传性疾病CCD^[11-12]，由此可见Runx2在成骨细胞分化及骨发育过程中具有重要作用。作为转录因子的Runx2是通过调节其下游的编码蛋白基因及miRNA基因来是实现其生物学功能的，全面解析这些调控对象可系统阐述其调控成骨分化及骨发育的分子机制。在成骨细胞分化中，存在与该过程密切相关的miRNA，即“osteomiRs”^[13-14]，这些microRNA可以通过多种途径对分化过程进行调控，如在成骨细胞分化后期，即骨基质沉积矿化阶段miR-29a与miR-29c可抑制标记基因osteonectin的表达，进而对骨重塑过程进行调节^[15]。对转录因子表达的调控，在BMP2诱导小鼠成肌细胞C2C12成骨细胞分化时则是通过下调miR-133与miR-135的表达，维持转录因子Runx2和Smad5正常表达达到促细胞分化的目的^[16]。miR-26则可通过调控转录因子Smad1的表达来调节人脂肪组织来源的干细胞向成骨细胞的分化^[17]。对激酶活性的调节，如miR-138对人基质干细胞向成骨细胞的分化调节依赖于对FAK的抑制作用^[18]。实验中发现Runx2诱导C2C12进行成骨分化时可明显上调miR-376b-3p的表达，且发现该miRNA具有协同促进Runx2诱导C2C12进行成骨细胞早期分化的作用，即促进早期分化标记基因碱性磷酸酶的表达，此结果揭示该miRNA在介导Runx2诱导早期成骨分化的功能方面具有重要意义，因此可将其看作是一种“osteomiR”。后续研究需要在不同时间点采用miRNA芯片的方法对参与此过程的miRNA种类进行系统分析，以求全面解析miRNA网络调控Runx2诱导C2C12进行成骨分化的分子机制。实验发现miR-376b-3p具有促进Runx2诱导C2C12进行成骨细胞早期分化的作用，此功能是通过调控靶基因表达的方式实现的。作者将在线预测得到的靶基因在DAVID Bioinformatics Resources数据库进行功能分类，结果发现有15个miR-376b-3p潜在靶基因可参与骨骼系统发育过程。结合miR-376b-3p功能特征，及有关15个潜在靶基因的研究进展，作者推测在Runx2诱导成骨分化过程中，miR-376b-3p可能是通过靶向调控Tbx3表达的方式来实现其生物学功能的，这是因为Tbx3对成骨分化具有显著的负调控作用^[19]。由于miRNA的理论靶基因不止一个，因此在此分化过程中可能还存在其他可被miR-376b-3p靶向调控的基因，而且这些基因所参与的生物学过程可能不是骨骼系统发育过程，而是参与如细胞增殖过程，从而对Runx2诱导C2C12进行成骨分化的过程进行调节。

miR-376b-3p可促进Runx2诱导C2C12细胞进行成骨细胞早期分化

miR-376b-3p promotes Runx2-induced early osteogenic differentiation of C2C12 cells

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