蚕丝/聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架降解液与骨髓间充质干细胞的增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.25.016

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (25): 4676-4683.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.25.016

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蚕丝/聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架降解液与骨髓间充质干细胞的增殖

张文元，杨亚冬，李颖，张科技，房国坚，唐靓，李跃中，王晗，陆明旸

浙江省医学科学院，浙江省杭州市 310013

收稿日期:2012-10-26 修回日期:2012-12-03 出版日期:2013-06-18 发布日期:2013-06-18
作者简介:张文元★，男，1961年生，浙江省温岭市人，汉族，2000年浙江省医学科学院毕业，硕士，研究员，主要从事干细胞与组织工程研究。 zhangwy61@163.com
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81071467)，浙江省医学重点学科群项目(XKQ-010-001)生物医药重点学科群，浙江省自然科学基金(LY13H060004)；浙江省医药卫生科技计划项目(2010KYB001)。

Silk/poly(lactic-co-glycolic acid) scaffold degradation fluid and proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells

Zhang Wen-yuan, Yang Ya-dong, Li Ying, Zhang Ke-ji, Fang Guo-jian, Tang Liang, Li Yue-zhong, Wang Han, Lu Ming-yang

Zhejiang Academy of Medical Science, Hangzhou 310013, Zhejiang Province, China

Received:2012-10-26 Revised:2012-12-03 Online:2013-06-18 Published:2013-06-18
About author:Zhang Wen-yuan★, Master, Researcher, Zhejiang Academy of Medical Science, Hangzhou 310013, Zhejiang Province, China zhangwy61@163.com
Supported by:
General Program of the National Natural Science Foundation of China, No. 81071467; Natural Science Foundation of Zhejiang Province, No. LY13H060004; Biomedicine Key Discipline of Medical Key Discipline Group of Zhejiang Province, No. XKQ-010-001; Medical and Hygienic Technology Plan of Zhejiang Province, No. 2010KYB001

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期研究表明，蚕丝/聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架浸提液具有良好的细胞相容性，基本无细胞毒性。
目的：观察蚕丝/聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维细丝混合编织支架体外长期降解过程中降解液对兔骨髓间充质干细胞增殖活性的影响。
方法：将蚕丝/聚乳酸-羟基乙酸共聚物细丝混合编织支架材料置于完全培养基中体外降解14周，每周换液1次，测定各周支架降解液的pH值。将兔骨髓间充质干细胞分组培养，实验组加入各周支架降解液和新鲜完全培养基各100 µL，阴性对照组加入完全培养基200 µL，培养4 d。MTT法检测细胞增殖、生长情况。
结果与结论：①支架降解液pH值的变化：前3周下降缓慢，从7.00降到6.89；第4周起下降较快，6-11周较低，在5.16-5.67之间；12-14周呈上升趋势，回升到6.95。②骨髓间充质干细胞形态：实验组及阴性对照组细胞增殖生长及形态状况基本相似。降解7-10周支架降解液对细胞的生长有抑制作用，细胞数量相对较少、较疏，而其余各周支架降解液对细胞生长无明显抑制作用。③骨髓间充质干细胞的增殖：1-6周及11-14周的支架降解液对细胞增殖无显著影响，细胞相对增殖率均在92.1%以上，毒性分级为0或1级；7-10周的支架降解液虽对细胞增殖有抑制作用，但细胞相对增殖率为82.5%-87.9%，毒性分级为1级，为合格。表明蚕丝丝素/聚乳酸-羟基乙酸共聚物混合编织支架降解液具有良好的细胞相容性。

关键词: 生物材料, 材料生物相容性, 蚕丝, 聚乳酸-羟基乙酸共聚物, 降解液, 骨髓间充质干细胞, 增殖, pH值, MTT法, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies showed that silk/poly(lactic/co-glycolic acid) copolymer scaffold has good cytocompatibility and no cytotoxicity.
OBJECTIVE: To observe the effects of degradation fluid of silk/poly(lactic-co-glycolic acid) braided scaffold on the proliferation and growth of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells in vitro.
METHODS: The silk/poly(lactic-co-glycolic acid) braided scaffold was degraded in complete culture medium for 14 weeks in vitro, and medium was replenished every week. The pH value of degradation fluid of the scaffold was determined every week. Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were cultured with degradation fluid and complete medium each 100 µL (experimental group), while negative control group was added with complete medium 200 µL, culturing for 4 days. The proliferation and growth of mesenchymal stem cells was detected with 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) pH value changes of degradation fluid of silk/poly(lactic-co-glycolic acid) scaffold: pH value declined slowly with the first 3 weeks, from 7.00 to 6.89. However, the value went down quickly at 4 weeks, maintained a low level at 6-11 weeks, between 5.16 and 5.67. Then pH values increased at 12-14 weeks, rising to 6.95. (2) Morphology of mesenchymal stem cells: The proliferation and growth of mesenchymal stem cells in experimental group and negative control group were basically similar. Degradation fluid inhibited the cell growth at degradation 7-10 weeks, exhibiting relatively less counts and sparse arrangement of the cells, while degradation fluid in other weeks had no obviously inhibition on the cell growth. (3) Proliferation of mesenchymal stem cells: Degradation fluid of the scaffolds at 1-6 weeks and 11-14 weeks had no significant impact on cell proliferation, and the relative growth rates of the cells were all over 92.1%, with toxicity grade 0 or 1 level; degradation fluid at 7-10 weeks had an inhibition effect on cell proliferation, but relative growth rates were 82.5%-87.9%, with toxicity grade 1 level, as qualified. Experimental findings indicate that, the degradation fluid of silk/poly(lactic-co-glycolic acid) braided scaffold has a good cytocompatibility.

Key words: biomaterials, material biocompatibility, silkworm silk, poly(lactic-co-glycolic acid), degradation fluid, bone marrow mesenchymal stem cells, proliferation, pH value, MTT assay, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

张文元，杨亚冬，李颖，张科技，房国坚，唐靓，李跃中，王晗，陆明旸. 蚕丝/聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架降解液与骨髓间充质干细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(25): 4676-4683.

Zhang Wen-yuan, Yang Ya-dong, Li Ying, Zhang Ke-ji, Fang Guo-jian, Tang Liang, Li Yue-zhong, Wang Han, Lu Ming-yang. Silk/poly(lactic-co-glycolic acid) scaffold degradation fluid and proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(25): 4676-4683.

图/表（结果） 6

2.1 兔骨髓间充质干细胞的培养及传代 兔骨髓经密度梯度离心后，获得界面单个核细胞层，培养。换液弃去未贴壁细胞，所留的贴壁细胞即骨髓间充质干细胞，呈短梭形。培养1周时细胞形成大量的小集落，细胞变长，此后集落细胞迅速增多，逐渐汇合成片，形态为均一的长梭形，呈旋涡状排列。传代培养的骨髓间充质干细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养更均一，细胞生长旺盛、增殖迅速，见图1。

经流式细胞仪检测，细胞表面标记CD14基本为阴性，而CD44呈阳性，表达在80%以上。

2.2 蚕丝/PLGA支架的观察 蚕丝/PLGA混合编织支架外观呈乳白色，质地均匀，韧性强，为螺旋上升的绳索状，支架直径为2.3 mm，见图2。

扫描电镜观察结果显示编织支架中较粗的为PLGA细丝，较细的为蚕丝丝素纤维细丝，表面均较为光滑并相互交叉，见图3。

2.3 支架降解液的pH值变化情况 支架材料在完全培养基的降解过程中，降解液前3周pH值下降缓慢，从7.00降到6.89；第4周起下降较快，6-11周pH值较低，在5.16-5.67；12-14周的降解液pH值呈上升趋势，回升到6.95，见图4。

结果提示，前3周支架材料中的PLGA尚未进入实质性降解阶段，pH值变化不大。第4周开始支架材料中的PLGA进入实质性降解阶段，pH值逐渐下降至第8周的5.16，第9周的5.21，第10周的5.34，之后随着支架中PLGA量的逐渐减少，pH值逐渐回升。第13.0-14.0周，支架中PLGA量已很少，剩下的基本上是蚕丝丝素，降解液pH值回升到近中性水平。

2.4 在支架降解液中骨髓间充质干细胞的形态观察 在总体上，通过全程1-4 d观察，实验组及阴性对照组细胞增殖生长及形态状况基本相似。

细胞与蚕丝/PLGA材料降解液共同培养1-4 d时的结果：实验组及阴性对照组细胞相似，开始时，呈梭形，折光性强，细胞突伸展。随着时间的延长，实验组及阴性对照组细胞生长状态与先前相似，均为形态均一的长梭形，并呈旋涡状生长，细胞生长旺盛，随着时间延长，细胞数量进一步增多，排列密集、规则，并逐渐连接成片；支架材料降解7-10周的降解液对细胞生长可见有抑制作用，可见实验组细胞数量相对较少、较疏，见图5，6；而其余各周的降解液对细胞的增殖生长无明显抑制作用。

2.5 在支架降解液中骨髓间充质干细胞的生长曲线及其相对增殖率情况 见图7，8。

前6周的降解液对骨髓间充质干细胞的增殖生长没有显著影响，细胞相对增殖率为92.1%以上，毒性分级为0或1级，基本上无细胞毒性。从统计学角度分析，7-10周的降解液对骨髓间充质干细胞的增殖生长可见有抑制作用(P < 0.05)；但从细胞相对增殖率角度分析，其细胞相对增殖率为82.5%-87.9%，毒性分级为1级，为合格，即为在可接受范围内。11-14周的降解液对骨髓间充质干细胞增殖生长无显著影响，细胞相对增殖率为94.2%以上，毒性分级为0或1级，基本上无细胞毒性。结果表明支架材料降解液的pH值变化影响细胞的增殖生长，结果也提示蚕丝/PLGA混合编织支架释放的酸性物质对细胞的增殖有一定的影响，但其细胞相对增殖率均在82.5%以上，毒性分级为0或1级，为合格，即为在可接受的范围内。提示蚕丝/PLGA混合编织支架可望作为组织工程韧带/肌腱的候选支架材料。

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引言

材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：于2011年10月至2012年4月在浙江省医学科学院生物工程研究所免疫学研究室完成。

材料：桑蚕蚕丝(Bombyx mori silkworm silk)由浙江海宁蚕农赠送。PLGA细丝(LA∶GA =10∶90)，上海天清生物材料有限公司生产，单丝直径约20 μm，每根复丝含12根单丝，呈乳白色，均匀柔韧。

实验动物：3月龄新西兰白兔，体质量2.0-2.5 kg，雌雄不拘，由浙江省实验动物中心提供及饲养，实验动物质量合格证号：SCXK(浙)2009－0039号。

支架降解液与骨髓间充质干细胞增殖实验的主要试剂与仪器：

Main experimental reagents and instruments:

实验方法：

兔骨髓间充质干细胞的提取：参照文献[3]提取、纯化、培养及冻存。取3月龄新西兰白兔，无菌条件下从髂后上棘穿刺抽取骨髓，通过密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化骨髓间充质干细胞。分离的骨髓间充质干细胞进行抗兔CD14-FITC、抗兔CD44-PE的流式细胞仪检测：用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化约4 min，弃消化液，加LG-DMEM培养液收集细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含体积分数1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液2 mL，将细胞用注射器针头吹散成单个细胞，再离心，转数同上，弃上清，加入含体积分数1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液1 mL，用注射器将细胞吹散成单个细胞后计数，将细胞浓度调节到约2×10⁹ L^-1。吸取100 μL骨髓间充质干细胞悬液分别放入流式专用管，各代细胞均取2管，每代细胞一管加抗兔CD14-FITC 10 μL，另一管加抗兔CD44-PE 10 μL标记，混匀后常温避光放置20 min。用含体积分数1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液1 mL洗1遍，重悬至500 μL上机检测。

蚕丝/PLGA编织支架的制备：将蚕丝浸入0.3% Na₂CO₃溶液中(按1 g蚕丝加0.3% Na₂CO₃溶液1 000 mL比例)煮沸30 min，更换Na₂CO₃溶液，再煮沸30 min，去除丝胶。并用95 ℃去离子水充分冲洗，室温晾干，得到蚕丝丝素纤维。按下列顺序编织：将蚕丝丝素纤维与PLGA细丝按蚕丝丝素：PLGA为2∶3的质量比均匀混合并平行排列(含蚕丝丝素纤维单丝160根，PLGA单丝96根，记为×1)，顺时针扭合(2捻)成1小索(×2)→逆时针扭合(2捻)成1大索(×4)→顺时针扭合(2捻)成1股(×8)→逆时针扭合(2捻)成2股(×16)，再将1股(×8)与上述的2股(×16)扭合成3股螺旋支架(×24)，即为蚕丝-PLGA混合编织绳状支架，共含蚕丝丝素纤维与PLGA两者单丝6 144根。分别经0.1 mol/L稀盐酸、蒸馏水、0.1 mol/L NaOH、蒸馏水超声洗涤，以清除纺丝和编织过程中黏附在纤维表面和空隙内的杂质和污物。取一小段支架样品，干燥喷金后在扫描电镜下观察其微观形貌。

支架材料降解液的制备：将上述绳状支架剪成4 cm长，两端用蚕丝丝素纤维扎紧，干燥至恒质量后，约为0.11 g/根，包装后送浙江省辐照中心⁶⁰Co (12 kGy)辐照消毒灭菌备用。在超净台下分别放入灭菌试管中，每支试管加入12 mL完全培养基(pH值用8%NaHCO₃调整为7.0)，放入37 ℃培养箱进行降解实验，设计3个平行样，每周换液1次。将换液取出的降解液测定pH值并用于兔骨髓间充质干细胞生长增殖检测实验。

MTT法检测兔骨髓间充质干细胞生长曲线及细胞形态学观察：复苏兔骨髓间充质干细胞后，培养，取第4代对数生长期细胞，消化后用完全培养基(含体积分数10%胎牛血清)制成细胞浓度为2×10⁷ L^-1的细胞悬液，接种于96孔板上，每孔加100 µL。复种5孔，置于含体积分数为5%CO₂、37 ℃的培养箱内培养24 h。待细胞贴壁后弃去原培养基。实验组每孔分别加入100 µL未经稀释的支架降解液和100 µL完全培养基，阴性对照组每孔分别加入100 µL完全培养基和100 µL孵箱放置1周的完全培养基。倒置相差显微镜每天观察细胞形态变化及生长情况。将培养板放于培养箱培养4 d，取出，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 µL，37 ℃下继续培养4 h后终止培养，小心吸去上清液，每孔加入150 µL 二甲基亚砜，振荡 10 min，使结晶充分溶解，用酶标仪在490 nm测定吸光度(A)值，并计算细胞相对增殖率，细胞相对增殖率越大，则材料降解液的细胞毒性越小。

参考细胞毒性实验标准对支架材料降解液的细胞毒性程度进行分级，以阴性对照组的A均值作为100%的细胞增殖率，细胞相对增殖率≥100%为0级，75%≤细胞相对增殖率≤99%为1级，50%≤细胞相对增殖率≤74%为2级，25%≤细胞相对增殖率≤49%为3级，1%≤细胞相对增殖率≤24%为4级，细胞相对增殖率=0为5级。毒性分级0或1级为合格，2级需结合细胞形态分析综合评价，3-5级为不合格。

主要观察指标：①支架降解液的pH值变化。②兔骨髓间充质干细胞的生长增殖情况。③在不同降解时间的降解液作用下，兔骨髓间充质干细胞的生长曲线及相对增殖率。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件包进行分析。实验数据以x(_)±s表示，采用t 检验进行统计学差异比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

天然蚕丝丝素纤维具有良好的力学性质^[4]、细胞亲和性、生物相容性，以及缓慢的降解性^[5-6]，降解的同时不引起韧带/肌腱力学性质的显著下降^[7]；其生物力学性能与正常的人前交叉韧带相当^[8]；其降解速率缓慢，能在体内外长期保持优良的机械性能^[9]，而且其价格相对低廉，材料丰富充足，有望成为组织工程韧带/肌腱修复重建的理想支架材料^[10-13]。

蚕丝降解速度缓慢，在体外实验中会在1年内失去大部分的抗拉强度；在体内2年后植入位点不产生异位识别^[14]，表明其已全部降解。天然蚕丝丝素一方面因其缓慢的降解速度可以为细胞提供长久的支持，在新韧带/肌腱形成前能在体内长期保持其优良的机械性能^[15-16]。另一方面因蚕丝丝素降解速度缓慢，不能及时腾出空间导致阻碍组织的继续再生，不能被新生组织及时取代。

PLGA具有良好的生物相容性与拉伸强度^[17-20]，并且综合了聚羟基乙酸的高降解速度及聚乳酸的高强度，其降解速率可以通过改变聚乳酸与聚羟基乙酸的比例而得到调节控制，为组织工程韧带/肌腱较理想的支架材料^[21-23]。通过PLGA纤维与丝素纤维的混合编织，在新生韧带/肌腱形成之前，由于丝素纤维状蛋白优异的机械性能，使得支架保持足够的机械强度；通过与PLGA的复合，调节支架的降解率，既为修复后的韧带/肌腱提供足够的生物力学强度，又能通过逐步降解为细胞增殖及胶原合成提供空间，配合新生韧带/肌腱形成。PLGA不但可作为硬组织缺损的修复，而且在软组织缺损修复方面也发挥了重要作用^[24]。PLGA具有表面活性与机械性能良好等优点，能促进种子细胞的黏附、增殖和分化，在理想的期限内，可控的降解速率同步于组织形成速率，因而有利于组织的再生与修复^[25]。PLGA在体内降解时代谢产物无毒，且可通过排泄系统排出体外或能进一步参与新陈代谢循环。研究表明，PLGA纤维编织支架可用于重建组织工程韧带与肌腱^[26-27]，并取得较好的效果。PLGA支架具有良好的细胞相容性，与高密度种子细胞共培养，可促进肌腱样组织的形成^[28-29]。因此PLGA为组织工程韧带/肌腱较理想的支架材料。在PLGA纤维与丝素纤维的混合编织中，PLGA先于蚕丝降解，及时腾出空间，以达到PLGA对支架整体降解速度的调节作用。通过PLGA纤维与丝素纤维的混合编织，在新生韧带/肌腱形成之前，由于丝素纤维状蛋白优异的机械性能，使得支架保持足够的机械强度；这样，既为修复后的韧带/肌腱提供足够的生物力学强度，又能通过逐步降解为细胞增殖及胶原合成提供空间，配合新生韧带/肌腱形成。尽量使材料的降解速度与新生韧带/肌腱组织的形成速度相匹配。由于PLGA存在降解产生的乳酸和羟基乙酸等酸性物质，会导致局部pH值急剧下降^[30]，引发周围组织的无菌性炎症反应，所以在构建工程化组织时应给予考虑。

由于在体外工程化组织构建过程中需要经常更换培养液，而在体内构建过程中，体液变化也是一个动态变化的过程。所以实验支架材料在降解过程中采用1周换液1次的方法。实验中降解液的pH值变化较大，但对骨髓间充质干细胞的增殖影响不是很大，主要可能是因为实验是降解液加上等量的完全培养基进行培养，完全培养基中和并缓冲了降解液pH值的缘故，使得实验组也较好地生长。所以在类似细胞培养实验中培养基应配得稍碱一些，且应勤换液。

种子细胞与支架材料的相互作用是组织工程研究的主要领域，骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，是最有研究价值和临床价值的种子细胞之一。种子细胞与支架材料的相互作用是组织工程研究的主要领域。考虑到体外构建工程化组织需要培养基培养，且需要常换液，因此，实验采用支架材料在培养基中降解，以及采取1周换液1次的方法。实验观察蚕丝/PLGA混合编织支架材料在体外降解过程中的pH值变化，并直接将组织工程常用的骨髓间充质干细胞作为检测细胞，通过MTT法检测支架材料在降解过程中的降解液对骨髓间充质干细胞增殖生长的影响。结果表明，降解液前3周pH值下降缓慢；第4周起下降较快，6-11周pH值较低；12-14周的降解液pH值呈上升趋势，回升到正常。与此相对应，支架材料降解7-10周的降解液对骨髓间充质干细胞的生长有抑制作用，可见实验组细胞数量相对较少、较疏，但其细胞相对增殖率为82.5%-87.9%，毒性分级为1级，为合格。而其余各周的降解液对骨髓间充质干细胞的增殖生长未见有明显抑制作用。

综上所述，蚕丝/PLGA混合编织支架降解液的细胞毒性为0-1级，按毒性级别分级标准为合格，表现出良好的细胞相容性，基本符合生物体应用的要求，提示蚕丝/PLGA混合编织支架可望作为组织工程韧带/肌腱的候选支架材料。

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聚乳酸-羟基乙酸共聚物具有良好的生物相容性与拉伸强度，并且综合了聚羟基乙酸的高降解速度及聚乳酸的高强度，其降解速率可以通过改变聚乳酸与聚羟基乙酸的比例而得到调节控制，为组织工程韧带/肌腱较理想的支架材料。通过聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维与丝素纤维的混合编织，在新生韧带/肌腱形成之前，由于丝素纤维状蛋白的优异的机械性能，使得支架保持足够的机械强度；通过与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的复合，调节支架的降解率，既为修复后的韧带/肌腱提供足够的生物力学强度，又能通过逐步降解为细胞增殖及胶原合成提供空间，配合新生韧带/肌腱形成。聚乳酸-羟基乙酸共聚物不但可作为硬组织缺损的修复，而且在软组织缺损修复方面也发挥了重要作用。聚乳酸-羟基乙酸共聚物具有表面活性与机械性能良好等优点，能促进种子细胞的黏附、增殖和分化，在理想的期限内，可控的降解速率同步于组织形成速率，因而有利于组织的再生与修复。聚乳酸-羟基乙酸共聚物在体内降解时代谢产物无毒，且可通过排泄系统排出体外或能进一步参与新陈代谢循环。研究表明，聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维编织支架可用于重建组织工程韧带与肌腱，并取得较好的效果。聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架具有良好的细胞相容性，与高密度种子细胞共培养，可促进肌腱样组织的形成。因此聚乳酸-羟基乙酸共聚物为组织工程韧带/肌腱较理想的支架材料。在聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维与丝素纤维的混合编织中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物先于蚕丝降解，及时腾出空间，以达到聚乳酸-羟基乙酸共聚物对支架整体降解速度的调节作用。通过聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维与丝素纤维的混合编织，在新生韧带/肌腱形成之前，由于丝素纤维状蛋白的优异的机械性能，使得支架保持足够的机械强度；这样，既为修复后的韧带/肌腱提供足够的生物力学强度，又能通过逐步降解为细胞增殖及胶原合成提供空间，配合新生韧带/肌腱形成。尽量使材料的降解速度与新生韧带/肌腱组织的形成速度相匹配。由于聚乳酸-羟基乙酸共聚物存在降解产生的乳酸和羟基乙酸等酸性物质，会导致局部pH值急剧下降，引发周围组织的无菌性炎症反应。所以在构建工程化组织应给予考虑。

蚕丝/聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架降解液与骨髓间充质干细胞的增殖

Silk/poly(lactic-co-glycolic acid) scaffold degradation fluid and proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells

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