微胶珠化胰岛肌肉内移植治疗小鼠1型糖尿病

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.25.011

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (25): 4637-4643.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.25.011

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微胶珠化胰岛肌肉内移植治疗小鼠1型糖尿病

李慧，傅红兴，朱雁林，李校堃

温州医学院药学院，浙江省温州市 350025

收稿日期:2012-10-17 修回日期:2012-11-20 出版日期:2013-06-18 发布日期:2013-06-18
通讯作者: 李校堃，博士，教授，温州医学院，浙江省温州市 350025 xiaokunli@163.com
作者简介:李慧★，女，1987 年生，汉族，温州医学院在读硕士，主要从事胰岛移植方面的研究。 mingmingdebaobei@126.com
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81071277)；浙江省自然科学基金资助项目(Y2080915)；浙江省大学生科技创新活动资助项目(2011R413006)。

Intramuscular transplantation of macroencapsulated islets for type 1 diabetes mellitus in mice

Li Hui, Fu Hong-xing, Zhu Yan-lin, Li Xiao-kun

School of Pharmacy, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325035, Zhejiang Province, China

Received:2012-10-17 Revised:2012-11-20 Online:2013-06-18 Published:2013-06-18
Contact: Li Xiao-kun, Ph.D., Professor, School of Pharmacy, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325035, Zhejiang Province, China xiaokunli@163.com
About author:Li Hui★, Studying for master’s degree, School of Pharmacy, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325035, Zhejiang Province, China mingmingdebaobei@126.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81071277; Natural Science Foundation of Zhejiang Province, No. Y2080915; College Studen’s Science and Technology Innovation Foundation of Zhejiang Province, No. 2011R413006

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期实验证明海藻酸钡微胶珠具有免疫隔离作用，并且不会引起免疫排斥反应。
目的：观察包裹胰岛海藻酸钡微胶珠对1型糖尿病小鼠的治疗作用。
方法：分离纯化SD大鼠胰腺单个胰岛细胞团，并包裹于海藻酸钡微胶珠内。以腹腔注射链脲佐菌素诱导建立C57BL/6小鼠1型糖尿病模型，随机分组：实验组小鼠股二头肌内多点注射包裹胰岛的海藻酸钡微胶珠，对照组小鼠股二头肌内多点注射胰岛，糖尿病对照组及正常对照组小鼠股二头肌内多点注射生理盐水。术后观察小鼠血糖及胰岛微胶珠在肌肉内存在状况。
结果与结论：分离纯化后获得高纯度胰岛，每只供体可获得(905.4±34.5)个，并具有良好生物活性。实验组小鼠血糖降为正常的时间约为6.3 d，移植胰岛存活时间大于30 d，对照组小鼠血糖一直未降至正常，移植胰岛存活时间约为4 d。实验组降糖速率明显快于对照组和糖尿病对照组(P < 0.05)。表明包裹胰岛的海藻酸钡微胶珠镶嵌在肌肉组织中可良好存活，治疗小鼠1型糖尿病。

关键词: 生物材料, 生物材料与药物控释, 异种胰岛, 海藻酸钡, 微胶珠化, 移植, 1型糖尿病, 血糖, C57BL/6小鼠, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Alginate-barium chloride microbeads confer immune isolation and prevent graft rejection in preliminary experiments.
OBJECTIVE: To assess the role of alginate- barium chloride microbead encapsulation in the treatment of type 1 diabetes mellitus in mice.
METHODS: The single islet cell group was isolated from the pancreas of Sprague-Dawley rats and purified. And cells were encapsulated into alginate-barium chloride microbeads. Type 1 diabetes mellitus was induced with streptozotocin into C57BL/6 mice via intraperitoneal injection, and randomly divided into four groups. The pure islets encapsulated in alginate-barium chloride microbeads were transplanted into the biceps femoris in the mice with type 1 diabetes mellitus, as experimental group. The pure islets were transplanted into diabetic recipients at biceps femoris, as control group. Normal C57BL/6 mice were injected with saline into biceps femoris, as normal control group. Diabetic C57BL/6 mice were injected with saline into biceps femoris, as diabetes control group. Then the blood glucose levels and macroencapsulated islets at the transplantation site were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: After isolation and purification, (905.4±34.5) islets per mouse were obtained and possessed excellent activity. Duration of normal blood glucose after operation in experimental group was approximately 6.3 days. The islet graft survival duration was longer than 30 days. The blood glucose levels in control group were not recovered to normal, and the islet graft survival duration was 4 days. The glucose-lowering rate in experimental group was significantly faster than that in control group and diabetes control group (P < 0.05). Experimental findings indicate that, islets encapsulated in alginate-barium chloride microbeads could survive in the muscles and treat type 1 diabetes mellitus.

Key words: biomaterials, biomaterials and controlled drug release, islet xenograft, alginate-barium chloride, microbead, transplantation, type 1 diabetes mellitus, blood glucose, C57BL/6 mice, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

李慧，傅红兴，朱雁林，李校堃. 微胶珠化胰岛肌肉内移植治疗小鼠1型糖尿病[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(25): 4637-4643.

Li Hui, Fu Hong-xing, Zhu Yan-lin, Li Xiao-kun. Intramuscular transplantation of macroencapsulated islets for type 1 diabetes mellitus in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(25): 4637-4643.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 供体SD大鼠20只，随机挑选10只C57BL/6小鼠作为正常对照组，其余32只C57BL/6小鼠，由于实验动物个体差异，造模过程中有2只受体C57BL/6小鼠因血糖高于28.0 mmol/L，弃去，其他小鼠均建模成功，均分3组，每组10只。

2.2 分离纯化获得胰岛、双硫腙染色、AO-PI染色、微胶珠化胰岛及胰岛计数 SD大鼠分离纯化后获得胰岛量(905.4±34.5)个/只，直径 75-200 μm，纯度>90%，AO-PI染色显示90%以上胰岛发绿色荧光，提示分离的胰岛纯度及功能良好；胰岛微胶珠光滑圆整，AO-PI染色显示90%以上胰岛发绿色荧光，提示海藻酸钡微胶珠化的大鼠胰岛活性较好，见图1。

2.3 胰岛的扫描电镜观察结果 胰岛表面被膜完整，未被消化过程破坏，见图2。

2.4 移植后各组小鼠血糖变化结果 实验组大鼠血糖降为正常的时间约为6.3 d，移植胰岛存活时间大于30 d，对照组血糖一直未降至正常，移植胰岛存活时间约为4 d。移植前3组糖尿病小鼠血糖值比较差异无显著性意义 (P > 0.05)；移植后，实验组血糖值与糖尿病对照组和对照组相比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.5 光镜下观察肌肉组织中的胰岛移植物 微胶珠化胰岛镶嵌在肌肉组织中，见图3，图中黑色箭头所示；肌肉内血供丰富，镶嵌其中的微胶珠化胰岛由于供氧相对充足从而较易存活。微胶珠化胰岛AO/PI结果显示，胰岛活性较好，但活性明显低于移植前，可能肌肉内胰岛细胞部分因缺氧而凋亡，见图4。

2.6 各组口服糖耐量实验结果 糖尿病对照组、对照组和实验组的血糖全程高于正常小鼠，而实验组的降糖速率明显快于对照组和糖尿病对照组，见图5。

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引言

胰岛移植治疗1型糖尿病的有效性毋庸置疑，尤其在加拿大Alberta大学Shapiro教授公布了“Edmonton方案”之后^[1-2]。胰岛移植手术安全、简便，患者平均住院天数少(只要2 d)，低血糖评分和血糖脆性指数明显改善，且5年的移植物存活率如以血中C-肽的存在来评估，可高达82%^[3]。但同种胰岛移植由于供体紧张、手术费用昂贵、长期免疫抑制剂的使用及长期疗效不理想，因此推广应用受限^[4]。而且临床胰岛移植多采用经门静脉移植，但此部位并不是胰岛移植的最佳部位，移植后会有大量胰岛丢失，且伴有出血、血栓形成、门静脉高压症、经血液介导的炎症反应等并发症，从而显著降低移植效果，预后不佳^[5]。

目前，针对1型糖尿病的治疗方案主要有胰岛素注射、胰岛移植等，当糖尿病患者需要依靠注射胰岛素来控制血糖时，不仅生活质量不好，也常出现低血糖等危险状况^[6]。胰岛移植需要长期应用免疫抑制剂，胰岛移植常用的免疫抑制剂如他克莫司、西罗莫司等的不良反应主要有肾毒性、传染疾病的易感性增高、高血压、癌症等^[7]。海藻酸钡微胶珠由于从理论上不需要应用免疫抑制剂，同时可实现异种移植，解决了胰岛移植来源不足和免疫排斥反应两大难题。实验将大鼠胰岛包裹于海藻酸钡微胶珠内，避免了免疫抑制剂的使用，可显著提高糖尿病患者的生活质量^[8]。

1980年Lim等^[9]提出用海藻酸钠微囊包裹大鼠胰岛实现异体移植有效以来，微囊由于从理论上不需要应用免疫抑制剂，同时可实现异种移植，解决了胰岛移植来源不足和免疫排斥反应两大难题。全世界掀起了微囊化异种/异体细胞移植的热潮^[10]。但胰岛的微囊化过程较长，胰岛很容易在包囊过程中因缺氧而凋亡，从而影响移植效果，且微囊强度低、生物相容性不佳等因素成为限制其临床应用的重要原因。

实验采用生物相容性较好的海藻酸钡微胶珠，与微囊相比其具有制作过程简单、用时短、强度高等优点。海藻酸钡微胶珠可以阻挡移植免疫排斥反应的细胞免疫和体液免疫两大效应机制对微胶珠内细胞发生作用，从而起到有效免疫屏障作用。

肌肉内的血供比较丰富^[11]，植入细胞易于成活并发挥功能，且移植手术操作简单风险小，是较为理想的移植部位。所以实验选择C57BL/6小鼠股二头肌为移植部位。

材料方法

设计：对比观察动物实验。

时间及地点：实验于2010至2012年在温州医学院医药生物技术与天然活性药物中试基地及温州医学院动物中心完成。

材料：

实验动物：供体雄性SD大鼠20只，8-10周龄，体质量200-250 g；受体雄性C57BL/6小鼠42只，八九周龄，体质量18-20 g，SPF级，均购自温州医学院实验动物中心。

微胶珠化胰岛肌肉内移植治疗小鼠1型糖尿病实验的主要试剂及仪器：

Main experimental reagents and instruments:

实验方法：

糖尿病动物模型的建立：C57BL/6小鼠禁食12 h，腹腔内注入1%链脲佐菌素，剂量200 mg/kg^[12]，注药后 72 h测血糖，随机(非空腹)血糖连续2次超过 14.0 mmol/L，并稳定5 d者即可作为成功的1型糖尿病模型^[13]。随机分为实验组、对照组及糖尿病对照组，每组10只。另取10只C57BL/6小鼠作为正常对照。

胰岛的分离纯化及培养：取SD大鼠，水合氯醛麻醉，找到十二指肠，分离肝部位显露胆总管，在胆总管与十二指肠连接处用玻璃分针分离出胆总管入口，用止血钳夹住入口，快速倒转大鼠，用玻璃分针分出近肝部位胆总管，下置手术缝线，用套管针进行胆总管插管^[14]。成功后将塑料头向前滑行2-4 mm，用缝线绑定套管针，处死大鼠，逆行胰管灌注V型胶原酶溶液。灌注充盈的胰腺组织取下，放入同浓度V型胶原酶溶液中，消化约12 min^[15]，待胰腺组织大部分成泥沙状和乳糜状之间时，终止消化，离心，弃去上清液。加入Hank’s液振摇，过不锈钢筛网，离心，将沉淀转移至两支15 mL离心管中，加入RPMI 1640 液，混匀后常温离心。在每支15 mL离心管的底层胰腺组织中各加入5 mL Ficoll-Paque™ PLUS溶液，吹打混匀，在其液面上加入Hank's液5 mL，离心。吸取Hank's液和Ficoll-Paque™ PLUS溶液交界层液面的组织悬块，即为纯化的胰岛，用RPMI 1640液洗涤纯化的胰岛，离心洗涤3次，吸至细胞培养瓶中，加RPMI 1640液，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养48 h。

移植前胰岛活性的检测：将培养48 h的胰岛组织、微胶珠化后胰岛及30 d后肌肉内取出的微胶珠稀释到适宜浓度，与AO/PI溶液1∶1混合后室温下避光孵育 10 min，在荧光显微镜下用490 nm激发光滤光片， 510 nm光栅滤光片可同时见到绿色(AO)和红色(PI)荧光。

扫描电镜观察纯化后大鼠胰岛的外形及被膜情况：显微镜下观察到的胰岛用甲醛试剂洗涤到西林瓶中进行固化，再用吸管将西林瓶中的胰岛吸至3×6孔的瓷板孔中，并将液体吸干。生理盐水洗涤3次，每次静止5 min后吸干液体，再依次用体积分数70%，80%，90%的乙醇洗涤1次，体积分数100%乙醇洗涤2次，每次静止5 min后吸干液体，叔丁醇洗涤4次，每次静止7 min后吸干液体。洗涤好的胰岛放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，将冷冻干燥后的胰岛放到铜板上的胶带上，再将粘有胰岛的铜板放到镀金机中进行镀金，最后于扫描电镜下观察胰岛表面的外形。

胰岛计数：将纯化前后的胰腺组织消化液用Hank's液调整至适当浓度，用50 μL定量加样器在胰岛悬液中重复取样3次，各加入50 μL 双硫腙溶液，常温下染色 3 min，于显微镜下观察。呈猩红色团块状及为胰岛，并按以下公式进行计数：

胰岛微胶珠化：取培养后大鼠胰岛约500个，离心，弃去培养液，混合于1.8%纯化海藻酸钠溶液中，高压静电法滴入BaCl₂溶液中，形成海藻酸钡微胶珠，无菌无热源生理盐水洗涤2次。

大鼠胰岛肌肉内注射：①实验组：将微胶珠化的大鼠胰岛混悬于生理盐水中多点注射于糖尿病C57BL/6小鼠双侧股二头肌内，每只小鼠(506±5)个胰岛。②对照组：将培养后的胰岛离心，弃去培养液后，直接混悬于生理盐水中多点注射于糖尿病C57BL/6小鼠双侧股二头肌内，每只小鼠(506±5)个胰岛。③正常对照组：未经糖尿病造模C57BL/6小鼠双侧股二头肌内多点注射与实验组等量的生理盐水。④糖尿病对照组：糖尿病C57BL/6双侧股二头肌内多点注射与实验组等量的生理盐水。

移植后疗效评价及移植物观察：移植后1 d开始检测小鼠血糖，次日起隔天检测一次血糖。非空腹血糖持续≤14.0 mmol/L，作为移植胰岛功能存活的标准，非空腹血糖连续2 d > 14.0 mmol/L，作为移植胰岛功能丧失的标准^[16]。非空腹血糖持续≤11.0 mmol/L，作为移植胰岛降至正常血糖的标准。30 d后取出移植物，冰冻切片后，显微镜下观察移植物在肌肉组织中的情况。

口服糖耐量实验^[17]：C57BL/6小鼠胰岛移植后第5天，禁食(约12 h)过夜，将葡萄糖溶于蒸馏水中成质量浓度为300 g/L，灌胃剂量为3.0 mg/g，灌胃后于20，40，60，90，120 min测定血糖浓度，观察血糖的峰值和峰值持续时间。正常对照组、糖尿病对照组、对照组同法测定口服糖耐量实验作对照。

主要观察指标：①分离纯化获得胰岛、双硫腙染色、AO-PI染色、微胶珠化胰岛及胰岛计数。②移植后各组小鼠血糖变化结果。③光镜下观察肌肉组织中的胰岛移植物。④各组口服糖耐量实验结果。

统计学分析：所有数据以x(_)±s表示，采用SPSS 17.0 专业统计软件进行方法分析处理，采用检验t 进行显著性检查，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

胰岛移植是目前惟一能根治1型糖尿病的方法^[18]，临床上胰岛移植方法主要有全胰腺移植和分离纯化得到胰岛细胞团再经肝门静脉进行移植。全胰腺移植手术复杂难度大且风险较高，经门静脉胰岛肝内移植易发生门静脉栓塞、门静脉高压等并发症^[19]。最近一个案例表明，经自体胰岛肌肉内移植手术治疗一幼儿，随访2年未发生免疫排斥，胰岛活性良好^[20]。这个案例证明胰岛可以在肌肉内存活并发挥作用，肌肉内移植可作为胰岛移植的一个新途径。胰岛肌肉内移植手术具有操作简单、创伤小、风险低等优点，但异种移植所面临的最大问题就是免疫排斥导致胰岛细胞凋亡，常用的免疫抑制剂不良反应较严重，显著影响了患者生活质量。其他免疫抑制方案也因为比较复杂而难以实施。

肌肉注射简单、方便，微囊化胰岛细胞肌肉注射移植也显示了一定的血糖控制效果。张胜兰等^[21]采用氯化钡为交联剂，5例三角肌伞状注射，3例通过外科手术将胰岛细胞放置于腹腔网膜囊内，在未使用免疫抑制剂条件下于移植前及移植后1，6，12个月观察胰岛素减量、空腹血糖、糖基化血红蛋白、猪C-肽等指标，结果显示移植后胰岛素用量均有不同程度下降，肌内和网膜囊内移植的效果无明显差异，对移植前后CD4⁺、CD8⁺的观察也证明无急性排斥反应发生；其中还观察了3例患者移植前后血清可溶性白细胞介素2受体结果无变化，证明用此种方法制备的移植物无免疫原性，但治疗结果显示移植量需达到10个新生猪的胰岛才可获得显效。邱丽媛^[22]将微囊肌内注射1个月后取肌肉组织进行苏木精-伊红染色，结果发现微囊包膜完整，纤维组织增生不明显，但囊形有变，海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微囊(Ca²⁺)较海藻酸钡-聚赖氨酸-海藻酸钠微囊(Ba²⁺)变形严重，估计为肌肉运动导致微囊受到挤压和压迫而变形，微囊破损对移植物活性的影响还未做深入研究。2010年瑞典乌普沙拉大学Christoffersson等^[18]将未微囊化胰岛注射移植到小鼠横纹肌和人上臂肌肉，也证明了胰岛在小鼠和人体上有效，但该胰岛素起效机制为从外周静脉血开始，与胰岛素原位释放从肝脏起效途径有差异。

前期实验证明，相对分子质量40 000和70 000的分子可以通过海藻酸钡微胶珠，而相对分子质量大于 150 000的分子不能通过微胶珠，这也就说明胰岛存活需要的营养物质可以进入微胶珠，并且相对分子质量只有 56 000的胰岛素可以顺利分泌出微胶珠。而IgG是最小的免疫球蛋白分子，补体激活必需的C3成分相对分子质量为195 000。因此海藻酸钡微胶珠可以阻挡移植免疫排斥反应的细胞免疫和体液免疫两大效应机制对微胶珠内细胞发生作用，从而起到有效的免疫屏障作用^[23]。Dufrane等^[24-25]报道海藻酸钡微胶珠具有良好的生物相容性，并且微胶珠化异种胰岛移植到皮下可以在不使用免疫抑制剂的情况下活性维持6个月。众多学者做过海藻酸微囊的移植并取得一系列成果，作者所在实验室认为，微囊与微胶珠均能达到预期的免疫隔离效果，但微囊制作过程较为繁琐，时间较长。胰岛在经过长时间处理且乏氧的状态下会大量凋亡。而微胶珠制作过程极为简便，即能达到免疫隔离的目的，又显著较少了胰岛在胶珠化过程中的凋亡。

实验将SD大鼠胰岛微胶珠化后移植到C57BL/6小鼠肌肉内，在不使用任何免疫抑制剂的情况下，胰岛活性至少维持1个月的时间。研究发现，30 d后移植到肌肉内的微胶珠被肌肉包裹于其中。肌肉内有丰富的血管分布，为胰岛细胞的存活提供了充足的氧供和营养底物。口服糖耐量实验中糖尿病对照组、对照组和实验组的血糖在口服糖耐量全程均高于正常小鼠，且高血糖持续时间较正常小鼠长，说明小鼠注射链脲霉素后破坏了小鼠的正常胰岛素分泌调节功能。实验组小鼠的降糖速率比对照组及糖尿病对照组小鼠要快，可能与微胶珠化胰岛在肌肉中存活并分泌胰岛素，协助降糖有关。

微胶珠化胰岛移植可实现异种移植和无需终生服用免疫抑制剂两大优势，在实验中显示出了较为平稳控制血糖的效果，但微胶珠化胰岛移植长期效果不理想^[26]。作者分析长期效果不理想可能与胰岛细胞团缺氧有关，虽然胰岛只占胰腺体积的2%-3%，但其血供却占整个器官的15%。分离胰岛过程破坏了微血管的内皮细胞连接，从而影响到位于胰岛中心β细胞的血供，尽管肌肉内血供相对较丰富，但仍不能供给胰岛充足的氧。微胶珠化人工细胞的研究现状与人们的原本期望值还存在较大差距^[27]，其主要限制性因素在于微胶珠的制备及微包被细胞过程具有明显的不确定性及缺乏可重复性^[28]。微胶珠强度、生物相容性、免疫隔离效果和移植方法是微胶珠发展永恒的话题，但微胶珠技术还很难解决移植物内血管重建的问题，使移植物长期存活受到限制。

微胶珠化胰岛肌肉内移植治疗小鼠1型糖尿病

Intramuscular transplantation of macroencapsulated islets for type 1 diabetes mellitus in mice

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