新生大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的同时分离

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.24.007

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (24): 4414-4420.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.24.007

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新生大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的同时分离

施雨露¹，李晓辕²，曹美娜³，于姝媛³，王苹³

1吉林大学白求恩医学院病原免疫细胞遗传实验中心，吉林省长春市 130021
2吉林大学第一医院呼吸科，吉林省长春市 130021
3吉林大学第一医院耳鼻咽喉-头颈外科，吉林省长春市 130021

收稿日期:2012-10-21 修回日期:2012-12-01 出版日期:2013-06-11 发布日期:2013-06-11
通讯作者: 王苹，博士，副教授，吉林大学第一医院耳鼻咽喉-头颈外科，吉林省长春市 130021 wang_ping@jlu.edu.cn
作者简介:施雨露，1963年生，江苏省启东市人，汉族，1990年白求恩医科大学大学毕业，主管技师，主要从事免疫和遗传学方面的研究。 shiyl@jlu.edu.cn

Simultaneous isolation of myocardial cells and cardiac fibroblasts from neonatal rats

Shi Yu-lu¹, Li Xiao-yuan², Cao Mei-na³, Yu Shu-yuan³, Wang Ping³

1 Experimental Center of Pathogenobiology-Immunology-Cell Biology and Genetics, Bethune Medical College, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China
2 Department of Respiratory Medicine, First Hospital, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China
3 Department of Otolaryngology and Head & Neck Surgery, First Hospital, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China

Received:2012-10-21 Revised:2012-12-01 Online:2013-06-11 Published:2013-06-11
Contact: Wang Ping, M.D., Associate professor, Department of Otolaryngology and Head & Neck Surgery, First Hospital, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China wang_ping@jlu.edu.cn
About author:Shi Yu-lu, Technician-in-charge, Experimental Center of Pathogenobiology-Immunology-Cell Biology and Genetics, Bethune Medical College, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China shiyl@jlu.edu.cn

摘要/Abstract

摘要：

背景：利用心肌组织中不同细胞的黏附特性差异，通过优化心肌细胞的培养条件，一次分离同时获得心肌和心肌成纤维细胞。
目的：探讨新生大鼠心肌和心肌成纤维细胞同时分离的有效方法。
方法：采用低浓度胰蛋白酶冷消化结合胶原酶复合消化，差速分离心肌和心肌成纤维细胞。通过使用不同种类的血清改良心肌细胞培养条件，免疫荧光鉴定心肌细胞和心肌成纤维细胞纯度。
结果与结论：心肌培养48 h时Troponin T阳性细胞率为89.3%。第2代的心肌成纤维细胞培养波形蛋白阳性细胞率为93.6%。含马血清的培养基组心肌细胞阳性率明显高于牛血清培养组(P < 0.05)。实验应用的新生大鼠心肌细胞分离培养方法，心肌细胞和心肌成纤维细胞纯度高、活性好，且能同时获得心肌细胞和心肌成纤维细胞。

关键词: 组织构建, 心脏组织构建, 心肌细胞, 心肌成纤维细胞, 胰蛋白酶, 胶原酶, 复合消化, 细胞培养, 马血清, 牛血清, 增殖, 分化

Abstract:

BACKGROUND: Myocardial cells and cardiac fibroblasts are simultaneously isolated through optimizing the culture conditions of myocardial cells, by use of the variations of adhesion properties of myocardial cells.
OBJECTIVE: To explore the co-separation method for myocardial cells and cardiac fibroblasts in newborn rats.
METHODS: Myocardial tissue in newborn rats was digested with low concentration trypsin at cold conditions and with collagenase II at 37 ℃. The myocardial cells and cardiac fibroblasts were isolated with differential centrifugation method, and myocardial cell culture conditions were improved using different kinds of serum. Immunofluorescence staining was used to evaluate the purity of myocardial cells and cardiac fibroblasts.
RESULTS AND CONCLUSION: The myocardial Troponin T positive cell rate was 89.3% at culture 48 hours, and myocardial fibroblast vimentin positive cell rate was 93.6% at passage 2. The percentage of positive myocardial cells cultured with medium containing horse serum was obviously higher than that with bovine serum culture (P < 0.05). This isolation method of rat myocardial cells can gain myocardial cells and cardiac fibroblasts at the same time, with high purity and good activity.

Key words: tissue construction, heart tissue construction, myocardial cells, cardiac fibroblasts, trypsin, collagenase, combined digestion, cell culture, horse serum, bovine serum, proliferation, differentiation

中图分类号:

R318

施雨露，李晓辕，曹美娜，于姝媛，王苹. 新生大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的同时分离[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(24): 4414-4420.

Shi Yu-lu, Li Xiao-yuan, Cao Mei-na, Yu Shu-yuan, Wang Ping. Simultaneous isolation of myocardial cells and cardiac fibroblasts from neonatal rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(24): 4414-4420.

图/表（结果） 4

2.1 原代培养心肌细胞的形态特征 见图1。

心肌细胞接种 24 h后，光镜下可见大部分贴壁细胞和少量的悬浮细胞，可见零星波动的心肌细胞。用PBS洗去未贴壁的细胞，换新鲜含体积分数10%马血清的DMEM培养基，48 h发现大部分细胞伸展呈多角形，多个细胞连接成小细胞簇，细胞折光性好，有波动现象，见图2。72 h时，心肌细胞体积变大，细胞聚集成片，波动节律一致。

细胞差分得到的贴壁细胞培养24 h后，细胞散在呈长梭形、椭圆形，折光性好，见图3。48 h时细胞生长融合成单层细胞，见图4。0.25%的胰蛋白酶消化传代，传代后的心肌成纤维细胞增殖增快，计算细胞群体倍增时间，第3代心肌成纤维细胞为32.4 h。

2.3 心肌细胞和心肌成纤维细胞的纯度鉴定 采用免疫荧光的方法，使用心肌特异标记蛋白Troponin T鉴定心肌细胞，使用波形蛋白鉴定心肌成纤维细胞。Troponin T阳性的心肌培养细胞，Troponin T的阳性表达为绿色荧光，蓝色为Heochest 33342复染的细胞核，见图5。随机计数10个视野，心肌培养48 h时Troponin T阳性细胞率为89.3%。对第2代的心肌成纤维细胞进行波形蛋白荧光染色，波形蛋白阳性表达为绿色荧光，蓝色为复染的细胞核，计数显示成纤维细胞的阳性百分率为93.6%，见图6。

2.4 马血清对心肌培养中成纤维细胞增殖的影响 心肌细胞培养接种时分别添加不同类型的血清，在培养的不同时间点计数Troponin T的阳性细胞百分率，见图7。心肌细胞培养24 h时，两种血清培养的心肌细胞纯度没有明显差别，48 h时出现成纤维细胞增多，导致心肌细胞阳性率下降，但马血清组的心肌细胞纯度仍高于牛血清组，72-96 h持续培养，牛血清组成纤维细胞增殖高于马血清组，马血清组的心肌细胞阳性率明显高于牛血清培养组(P < 0.05)，差异有显著性意义。

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引言

心肌细胞体外培养能提供单一细胞的同源性集落，并且不受神经、体液因素影响，已成为研究心肌信号传导和药物筛选的基本方法之一。体外培养的心肌细胞中通常存在两大类：心肌细胞(myocardial cells)和心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CF)，还有少量的血管内皮细胞等。此外因其特殊的组织结构，心肌细胞在分离时极易受伤，心肌成纤维在几代后也出现老化。因此，如何快速分离得到纯化的心肌细胞和心肌成纤维细胞是实验成功的关键。自Haracy等^[1]首次分离乳鼠的心肌细胞进行培养以来，国内、外许多学者对心肌细胞原代培养方法进行了研究和改良，旨在提高心肌细胞的产量和活力。

心肌细胞的培养方法已有很多报道，但均存在细胞存活率低、纯度不高等问题。常见的心肌细胞分离有2种，组织块分离和酶消化法，其中组织块分离法目前很少应用，多采用酶消化法^[2-3]。常用的消化酶有胰蛋白酶、胶原酶以及Dispase和透明质酸酶^[4-8]。胰蛋白酶作用较强，可分解心肌组织间酪蛋白成分，有效解离心肌细胞，但对心肌细胞膜蛋白亦有较强的破坏作用，容易损伤心肌细胞。而胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤较小，目前被广泛采用。由于源于心肌组织的原代培养为混合细胞培养，如何分离相对纯净的心肌细胞，在实验周期中抑制非心肌细胞生长，是保证实验成功的关键步骤。汪长华和陈克研等^[9-11]在心肌培养液中加入10 μmol/L的阿胞糖苷，抑制有丝分裂速度快的非心肌细胞DNA合成，但阿胞糖苷对细胞有一定毒性。此外在心肌细胞分离时，利用心肌细胞贴壁较心肌成纤维细胞慢的特性，首次接种细胞采用差速贴壁的方法，分别培养也得到相对纯净的心肌细胞和心肌成纤维细胞^[12-14]。

实验介绍一种采用低浓度胰蛋白酶冷消化结合胶原酶复合消化，通过改良心肌细胞培养条件，差速贴壁分离心肌和心肌成纤维细胞的原代培养方法，为研究心脏疾病提供理想的体外实验体系。

材料方法

设计：动物实验，对比观察。

时间及地点：于2010年1月至2010年6月在吉林大学第一医院耳鼻咽喉头颈外科实验室完成。

材料：

实验动物：选择生后三四天的健康Wistar大鼠8-10只，雌雄不拘。由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK-(吉)2007-0003，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

新生大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞实验应用的主要试剂及仪器：

Main experimental reagents and instruments:

实验方法：

心肌细胞分离和培养：新生大鼠用体积分数70%乙醇消毒，剪开胸骨，立即取出心脏置于含有肝素钠的冷D-Hank’s溶液中，体视显微镜下去除残留的大血管和筋膜，缓冲液反复漂洗去除血液，用眼科剪剪成1.5- 2.0 mm³的组织块，用Hank’s液仔细漂洗。组织块转移至50 mL离心管中，加入0.25 g/L的胰酶-EDTA消化液 10 mL，心肌组织与消化液的比例约为1∶10，4 ℃缓慢摇动过夜。次日去除5 mL胰酶消化液，置于37 ℃水浴 10 min，立即加入5 mL含体积分数10%马血清的DMEM培养基终止胰酶反应，然后加入1 mL胶原酶Ⅱ(5 g/L)， 1 mL DNA 酶Ⅰ，37 ℃孵育10 min。孵育期间轻柔吹打几次，细胞悬液过滤，1 500 r/min离心5 min，重新用20 mL含马血清的DMEM培养基悬起细胞，分别接种于2个100 mm培养皿中，37 ℃培养45 min。将未贴壁的细胞转入另一培养皿中继续培养45 min，将2次培养未贴壁的细胞移入离心管中，锥虫蓝染色，调整细胞浓度为5×10⁸ L^-1，接种于35 mm培养皿中培养过夜，次日用无血清的预温的DMEM漂洗1次，加入含体积分数10%马血清的DMEM培养基1.5 mL，同时以体积分数10%胎牛血清DMEM培养基作为对照。二次差分的贴壁细胞加入含体积分数10%胎牛血清的培养基1.5 mL培养。

免疫荧光染色：培养于培养皿中的原代心肌细胞和传代培养的心肌成纤维细胞，弃去培养基，用PBS洗涤2次，加入40 g/L的多聚甲醛溶液固定30 min。PBS洗涤3×5 min，然后用0.1% Triton X-100处理15 min，加入体积分数5%的山羊血清封闭1 h，分别加入一抗(Troponin T，1∶100和Vimentin，1∶200)，4 ℃孵育过夜，次日用PBS洗涤3×15 min，加入Alexa Fluor 555标记的山羊抗小鼠IgG 的二抗(1∶400)，室温避光放置1 h，PBS洗涤3×15 min，最后样品均再用1 mg/L的Hoechest33342复染细胞核，室温温育5 min。甘油封固后，用Fluview 1000 激光扫描共聚焦显微镜观察。阴性对照实验中，用PBS代替第一抗体来排除非特异性的二抗结合。共聚焦显微镜观察采用单通道扫描，检测波长分别为408 nm和563 nm。200倍镜下随机取10个视野计数阳性细胞及细胞总数。

心肌成纤维细胞增殖活性鉴定：不同传代的心肌成纤维细胞以细胞浓度5×10⁷ L^-1接种于24孔培养板中， 24 h后，每日同一时间用胰蛋白酶消化3孔细胞，血球计数板进行计数，连续进行4 d，绘制细胞生长曲线，计算细胞群体倍增时间^[15]。

主要观察指标：通过免疫荧光染色观察新生大鼠分离培养的心肌细胞和心肌成纤维细胞纯度和生物学特性。

统计学分析：使用SPSS 17.0软件进行统计学分析，所有数据来自5次独立的实验，以x(_)±s表示，统计学处理由通讯作者完成，采用单因素方差分析，q检验，P < 0. 05为差异有显著性意义。

讨论

文献报道，心肌组织中60%的细胞为心肌细胞，其他为心肌成纤维细胞、内皮细胞等^[16]。心肌细胞增殖能力低，大多实验来源于心肌细胞的原代培养，因此原代培养的成功与否直接关系到实验的进程，而提高心肌细胞的产量和活力是心肌细胞培养成功的关键^[17-19]。心肌细胞培养作为一种体外实验研究模型，可以更方便地从细胞和分子水平研究心血管疾病的发病机制，成为心血管疾病研究的一项主要手段和基本技术。如何使心肌细胞培养的方法更为简单并且使分离的心肌细胞达到理想的存活率和纯度，是体外培养心肌细胞模型的关键问题^[20-21]。

由于成纤维细胞增殖迅速，培养3-5 d后在数目上可显著超过心肌细胞，占有很大的培养面积，对心肌细胞的生长及收缩功能有很大影响^[22]，而且心肌细胞是不可分化的终末细胞，很难增殖，且传代困难。如何快速、大量获得心肌细胞成了制约构建心肌纤维化模型的首要问题。许多学者根据心肌细胞和成纤维细胞在在培养器皿表面贴壁生长的速度不同而进行分离。贴壁时间各有不同，通常以60-90 min多用，此方法具有操作简便、用时短、对细胞影响小、分离纯度高等优点^[23-25]。作者在此基础上采用2次差速分离的方法，尽量去除心肌细胞中的成纤维细胞。纯化后培养的心肌细胞较混合培养的细胞搏动时间长，开始搏动的时间提前易形成同步，且收缩力增强。

分离心肌细胞通常用的生物酶有胰蛋白酶、胶原酶，胰蛋白酶常用的浓度为0.05%-0.25%，37 ℃水浴磁力搅拌器搅拌。有文献报道，用于消化心肌细胞的胶原蛋白酶类型有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型，其中Ⅱ型多为0.1%-0.12%，可分次消化，也可过夜消化。也有用胰蛋白酶(0.05%)加胶原酶(0.1%)共同消化^[26-28]。在这个实验中作者也采用胰酶-胶原酶复合消化的方法，首先采用低浓度的胰酶4 ℃消化过夜，到达松弛心肌组织的目的，第2天37 ℃消化10 min，严格控制胰酶消化时间，减少胰酶对心肌细胞的损伤。同时在消化液中添加DNA酶Ⅰ，用来消除损伤细胞释放出的DNA导致的细胞凝聚，减少细胞间的粘连。

体外培养的心肌细胞可保持结构及功能上的某些特点，并具有自发性节律搏动，且心肌细胞的培养具有简便、定量、重复性好以及不受神经体液因素的影响等特点。尽管采用差速分离的方法分离心肌细胞和心肌成纤维细胞，仍然有少量的成纤维细胞混在心肌细胞中。作者在实验中采用马血清代替常规培养中的胎牛血清取得了良好的效果。对比2种不同血清培养差速分离后的心肌细胞，在24 h时间点，心肌细胞的阳性百分率在马血清组与胎牛血清组没有明显差异；48 h时间点马血清组心肌细胞高于胎牛血清组5%；培养三四天后，马血清组的成纤维细胞明显少于胎牛血清组，差异有显著性意义。可见胎牛血清更适合心肌成纤维细胞生长，而马血清对心肌细胞的生长和存活有利。文献报道低浓度的马血清能够有效刺激C2C12成肌细胞向成熟细胞分化，肌小管形成^[23]，而胎牛血清不具有这种功能^[29-30]。实验推测马血清组的心肌细胞多于胎牛血清组的可能性，一方面是胎牛血清刺激成纤维细胞生长的能力高于马血清；一方面也可能由于马血清中可能含有某种有利

于启动肌前体细胞向成熟肌细胞分化的因子，具有刺激心肌前体细胞分化的作用，是否马血清能够抑制心肌成纤维细胞增殖有待于进一步研究^[31-32]。

获得相对纯净的心肌原代细胞对体外实验非常重要。在分离培养新生大鼠心肌细胞过程中，酶法分离是比较常见的实验方法，与很多其他酶原结合可得到高存活率和高纯度的心肌细胞，这样细胞的搏动率高、持续时间久^[33-35]。作者首先采用低浓度胰酶4 ℃过夜冷消化松弛心肌组织，再联合胶原酶消化，尽量避免心肌细胞因机械和胰酶消化导致的活性降低。2次差速分离心肌细胞和心肌成纤维细胞，培养阶段采用马血清替代胎牛血清，抑制成纤维细胞的快速增殖，得到的原代心肌细胞在培养的第4天仍能有80%的阳性细胞。但超过7 d的心肌细胞仍会有大量的成纤维细胞增殖，且心肌持续跳动导致部分细胞失黏附，因此应用原代细胞进行实验最好选在2-5 d。作者在实验中得到的心肌成纤维细胞，在经过增殖，传3代以后，波形蛋白免疫荧光染色鉴定，95%的细胞均为心肌成纤维细胞，可用于心肌纤维化等相关实验研究。

新生大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的同时分离

Simultaneous isolation of myocardial cells and cardiac fibroblasts from neonatal rats

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