磁性复合骨水泥的体外细胞毒性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.019

中国组织工程研究

• 材料生物相容性 material biocompatibility • 上一篇下一篇

磁性复合骨水泥的体外细胞毒性

唐正海¹，王晓文²，张友仁¹，潘琳³，唐劲天²，岳秉飞^{1, 4}

1北京中医药大学，北京市 100102
2清华大学玉泉医院脑神经疾病研究所，北京市 100049
3中日友好医院临床医学研究所，北京市 100029
4中国药品生物制品检定所，北京市 100050

收稿日期:2012-08-13 修回日期:2012-08-25 出版日期:2013-05-21 发布日期:2013-05-21
通讯作者: 岳秉飞，研究员，博士生导师，中国药品生物制品检定所，北京市 100050 yue-bingfei@nicpbp.org.cn
作者简介:唐正海★，男，1988年生，贵州省贵阳市人，汉族，北京中医药大学在读硕士，主要从事骨修复材料研究。 tangzhenghai@126.com
基金资助:
国家自然科学基金项目(81071885)

Cytotoxicity of the magnetic bone cement in vitro

Tang Zheng-hai¹, Wang Xiao-wen², Zhang You-ren¹, Pan Lin³, Tang Jin-tian², Yue Bing-fei^{1, 4}

1 Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China
2 Institute of Neurological Disorders, Yuquan Hospital, Tsinghua University, Beijing 100049, China
3 Institute of Clinical Medical Science, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China
4 National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China

Received:2012-08-13 Revised:2012-08-25 Online:2013-05-21 Published:2013-05-21
Contact: Yue Bing-fei, Investigator, Doctoral supervisor, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China; National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China yue-bingfei@nicpbp.org.cn
About author:Tang Zheng-hai★, Studying for master’s degree, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China tangzhenghai@126.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81071885

摘要/Abstract

摘要：

背景：磁性复合骨水泥作为一种新型骨转移治疗材料，不仅能对骨缺损进行修复，还能在交变磁场下升温杀死骨肿瘤。
目的：检测磁性复合骨水泥对小鼠L929成纤维细胞增殖活性的影响及细胞毒性反应。
方法：采用CCK-8法检测含0%(即磷酸钙骨水泥组)，10%，20% Fe3O4的磁性磷酸钙骨水泥浸提液及含0%(即聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥组)，10%，20%Fe3O4的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥浸提液对对数生长期小鼠L929成纤维细胞的毒性作用，每种浸提液又分为50%与100%两个浓度梯度；以正常培养基培养的小鼠L929成纤维细胞作为阴性对照组。
结果与结论：①在100%浓度梯度下：除含20%Fe3O4的磁性聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥组细胞数量较少、细胞形态异常外，其余磁性聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥组细胞生长状态良好；含10%Fe3O4的磁性磷酸钙骨水泥组培养24 h时表现出轻度细胞毒性，毒性2级；含20%Fe3O4的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥在24- 72 h为表现出轻、中度细胞毒性，毒性为2，3级。各磁性磷酸钙骨水泥组细胞数量及形态正常。②在50%浓度梯度下：各组细胞形态均正常，细胞毒性为0级或1级。表明磁性聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥具有轻、中度细胞毒性，磁性磷酸钙骨水泥细胞相容性良好，基本无细胞毒性。

关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 磁性骨水泥, 聚甲基丙烯酸甲酯, 磷酸钙, 生物相容性, 成纤维细胞, 细胞毒性, 增殖, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Magnetic bone cement has been used as a new kind of material for bone metastasis, and it can repair bone defects and cure bone tumors with temperature rising under an alternating magnetic field.
OBJECTIVE: To test the magnetic bone cement effects on cytotoxicity and cell proliferation of mouse L929 cells.
METHODS: The cytotoxicity of magnetic calcium phosphate cement and polymethylmethacrylate bone cement leaching liquors, respectively, containing 0, 10%, 20% Fe3O4, to L929 cells at logarithmic growth phase was detected using Cell Count Kit-8 assay. Two kinds of leaching liquors were prepared to two concentration gradients, 50% and 100%. Mouse L929 cells cultured in normal culture medium were considered as control group.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Under 100% concentration gradient: Cells grew well in polymethyl methacrylate bone cement groups containing 0, 10% Fe3O4 except for 20% Fe3O4. Magnetic calcium phosphate cement containing 10% Fe3O4 showed mild cell toxicity, graded as 2, after culture for 24 hours. During 24- 72 hours, polymethylmethacrylate bone cement containing 20% Fe3O4 exhibited mild or moderate cell toxicity and the toxicity was graded as 2 or 3. (2) Under 50 concentration gradient: Cells grew well in all groups. The cell toxicity was graded as 0 or 1. Magnetic polymethylmethacrylate bone cement has mild or moderate cell toxicity and magnetic calcium phosphate cement exhibits a good biocompatibility with no cell toxicity.

Key words: biomaterials, tissue-engineered bone materials, magnetic bone cement, polymethylmethacrylate, calcium phosphate, biocompatibility, fibroblasts, cytotoxicity, proliferation, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

唐正海，王晓文，张友仁，潘琳，唐劲天，岳秉飞. 磁性复合骨水泥的体外细胞毒性[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.019.

Tang Zheng-hai, Wang Xiao-wen, Zhang You-ren, Pan Lin, Tang Jin-tian, Yue Bing-fei. Cytotoxicity of the magnetic bone cement in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.019.

图/表（结果） 4

2.1 各组细胞形态观察结果
100%浸提液：在倒置显微镜下观察发现，24-72 h阴性对照组、PMMA组与磷酸钙骨水泥组的细胞数量都增加，见图1，2。

由图1可见，阴性对照组、PMMA组与含10%Fe3O4磁性复合PMMA组细胞随着培养时间的延长，细胞数量增加，72 h细胞长满培养瓶底部，生长状态良好，仅见到个别细胞皱缩、变圆。含20%Fe3O4磁性复合PMMA组24-72 h细胞数量明显低于阴性对照组，并见多数细胞变圆。

图2中各组细胞都随培养时间的延长，细胞数量明显增多，24-72 h细胞生长良好，形态规则，可见分裂细胞，各组细胞数量及形态未见明显差别。各组50%浸提液下细胞的表现与在100%浸提液下的表现相似。

2.2 各组细胞吸光度A值见表1，2。

A值大小可以通过调节细胞浓度，CCK-8用量及含有CCK-8培养基培养细胞的时间进行调节。由表1与表2可见，各组内72 h的A值明显低于48 h是通过对含有CCK-8培养基与细胞的培养时间进行调节所致。

100%浸提液中同一时间点下，PMMA骨水泥随着Fe3O4含量的增加，其A值降低，而磷酸钙骨水泥组间差异无显著性意义。50%浸提液组与100%浸提液组表现相似。

2.3 各组细胞体外细胞增殖度和细胞毒分级见表3，4。

根据细胞毒性分级评判标准，100%浸提液时，PMMA组、磷酸钙骨水泥组、含10%，20%Fe3O4的磷酸钙骨水泥组主要为1级，合格；含10% Fe3O4的PMMA组在24 h时为2级，表现出轻度细胞毒性，48 h和72 h分别为1和0级，合格；而含20% Fe3O4的PMMA组在24-72 h分别为2和3级，表现出轻、中度细胞毒性。50%浸提液时，各组受试样品在24-72 h为0或1级，合格，表现出良好的生物相容性。

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引言

材料方法

设计：体外细胞毒性实验，对比观察。
时间及地点：于2012-03-17/04-30在清华大学医疗新技术实验室完成。
材料：
磁性复合骨水泥体外细胞毒性实验的试剂与仪器：
Main reagents and instruments:

实验方法：
Fe3O4的制备：采用化学共沉淀法制备纳米Fe3O4颗粒[13-14]，将FeCl2•4H2O和FeCl3•6H2O 按摩尔比 1∶1.75分别精密称后溶于去离子水中，加入通有氮气保护的三颈烧瓶，再加入去离子水至110 mL。将三颈烧瓶固定于顶置式机械搅拌器上，同时使瓶腹没于90 ℃的恒温水浴锅中，调节搅拌桨转速为1 000 r/min，待 10 min后，加入约20 mL的25%氨水，调节反应体系pH值至9.3-9.7，搅拌反应30 min。反应完成后，静置并用强磁体分离出Fe3O4颗粒，再用蒸馏水和无水乙醇反复交替清洗至溶液呈中性，冷冻干燥48 h制成Fe3O4粉末备用。
磁性骨水泥的制备：在PMMA骨水泥中添加0%(单纯PMMA，对照)，10%和20%的Fe3O4粉末。按照临床要求，将2 g复合骨水泥粉末和1 mL MMA液体均匀混合，倒入不锈钢圆柱形磨具中(直径6 mm，高12 mm)，在温度为23 ℃，湿度大于40%条件下凝固，脱模。同法制备3组磁性复合磷酸钙骨水泥，分别含0%(单纯磷酸钙骨水泥，对照)，10%和20%的Fe3O4粉末。
磁性骨水泥浸提液的制备：根据ISO 10993.12-2009“医疗器械生物学评价标准第12部分：样品制备与参照样品”规定[15]，称取2 g磁性复合骨水泥，60Co照射灭菌后放入无菌试管中，加入RPMI 1640培养液使质量浓度达到0.2 g/mL，置于37 ℃培养箱浸提(72±2) h，用加样枪将材料浸提液吸入无菌试管，置4 ℃冰箱保存备用。
细胞培养：将小鼠L929成纤维细胞培养于含体积分数10%小牛血清的RPMI 1640培养基中，于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。
细胞毒性测定：取对数生长期的L929细胞，调整细胞浓度为108 L-1，按100 μL/孔加入96孔板，每个样品设4个复孔。待细胞贴壁后，吸去培养基，加入磁性复合骨水泥浸提液，设浓度梯度为50%和100%，置于培养箱中培养，分别于24，48，72 h吸去浸提液，加入含10% CCK-8的RPMI 1640培养液共培养2.5 h，检测450 nm波长下其吸光度值，记录结果。以RPMI 1640培养液培养的细胞作为阴性对照。
实验分12组：
Experimental grouping:

结果评价标准：①细胞的相对增殖率=(实验组吸光度均值/阴性对照组吸光度均值)×100%。按细胞的相对增殖率范围分为5级[16]，以阴性对照组的吸光度值作为100%的细胞增殖率。
根据细胞相对增殖率进行毒性分级：
Toxicity grading:

细胞形态学变化评价标准^[^17]：
Assessment criteria for cell morphology[17]:

主要观察指标：不同时间点各组细胞形态变化、相对增殖率及毒性分级。
统计学分析：采用SPSS 10.0软件完成统计处理，实验数据以

表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

生物材料需要长期与人体组织接触, 其组织相容性的优劣直接影响临床疗效[18-19]，在选用前必须按照相关安全性检验标准进行完整生物学评价^[20-21]。其中体外细胞毒性实验是评价材料生物相容性最基础、最重要的步骤^[22-23]。它可以快速、简便地了解细胞和受试材料接触后发生的生长抑制、死亡等其他毒性反应，在评价生物相容性方面得到广泛认同^[24]。

目前ISO对检测材料体外细胞毒性实验拟定3种方法：细胞与材料直接接触法，材料浸提液法，琼脂糖覆盖法^{[17, 25]}。实验采用受试材料浸提液法，按照GB 16886医疗器械生物学评价第12部分(样品制备与参照样品)将材料与培养基按照2 g材料中加入1mL培养基的比例制备浸提液。选用L929小鼠成纤维细胞系作为细胞毒性的实验对象，该细胞系具有传代稳定、培养条件低、可重复性强等优点^[26-27]，在细胞毒性实验中被常规地选用，也是ISO 10993-5推荐为细胞毒性实验标准中的标准细胞。

在浸提液实验中，将100%浸提液和含50%浸提液的培养基与L929细胞共培养，进行一系列连续的时间点监测，这样能更实际地反映浸提液浓度及时间的变化对细胞增殖度的影响。其中，100%浸提液中含10%Fe3O4的PMMA组在24 h表现出轻度细胞毒性，含20%Fe3O4的PMMA组在24-72 h表现为轻、中度细胞毒性，因同等质量的PMMA粉末中含20%Fe3O4的PMMA组所含MMA单体多于含10%Fe3O4的PMMA组，而MMA单体是造成细胞毒性的主要因素^[28-29]，所以含20%Fe3O4的PMMA组表现轻中度细胞毒性。而PMMA组严格按照临床要求进行制备，细胞毒性为0或1级，表现良好的细胞相容性。磷酸钙骨水泥实验各组均为0或1级，无细胞毒性。初步表明PMMA与磁性复合磷酸钙骨水泥具有较佳的生物相容性，符合生物医用材料的基本要求。尽管如此，纳米磁性复合骨水泥能否作为骨转移治疗的新型骨科材料，还需要进一步证实。

4 结论

将自制磁性纳米颗粒(Fe3O4)分别与PMMA、磷酸钙骨水泥混匀，制备磁性复合骨水泥，采用浸提液法，进行体外细胞毒性实验。结果表明，磁性复合磷酸钙骨水泥无细胞毒性，具有良好生物相容性，而磁性PMMA骨水泥表现出轻、中度细胞毒性。

磁性复合骨水泥的体外细胞毒性

Cytotoxicity of the magnetic bone cement in vitro

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