微弧氧化镁合金对巨噬细胞肿瘤坏死因子和白细胞介素6的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.011

中国组织工程研究

• 组织工程口腔材料 tissue-engineered oral materials • 上一篇下一篇

微弧氧化镁合金对巨噬细胞肿瘤坏死因子和白细胞介素6的影响

庄岩¹，吴锋²，孟改利^{2. 3}，李晓会²

1西安交通大学红十字会医院，陕西省西安市 710054
2西安交通大学医学院，陕西省西安市 710061
3陕西省妇幼保健医院，陕西省西安市 710003

收稿日期:2012-09-29 修回日期:2012-10-29 出版日期:2013-05-21 发布日期:2013-05-21
通讯作者: 吴锋，博士，高级实验师，西安交通大学医学院，陕西省西安市 710061 wufeng@mail.xjtu.edu.cn
作者简介:庄岩，男，1967年生，福建省惠安市人，汉族，1990年西安医科大学毕业，主任医师，主要从事创伤外科及内固定材料的研究。

Magnesium alloy modified by micro-arc oxidation can influence tumor necrosis factor-alpha and interleukin-6 production in macrophages

Zhuang Yan¹, Wu Feng², Meng Gai-li^{2, 3}, Li Xiao-hui²

1 Red-Cross Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710054, Shaanxi Province, China
2 Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China
3 Shanxi Provincial Maternal and Child Health Care Hospital, Xi’an 710003, Shaanxi Province, China

Received:2012-09-29 Revised:2012-10-29 Online:2013-05-21 Published:2013-05-21
Contact: Wu Feng, M.D., Experimentalist, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China wufeng@mail.xjtu.edu.cn
About author:Zhuang Yan, Chief physician, Red-Cross Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710054, Shaanxi Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：微弧氧化处理可提高镁合金的抗腐蚀性能，延缓其降解速率。
目的：观察微弧氧化处理镁合金对小鼠巨噬细胞肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的影响。
方法：在小鼠RAW264.7细胞中分别加入镁合金浸提液(对照组)、微弧氧化处理镁合金浸提液(实验组)及RPMI-1640(空白对照组)，1 h后加入脂多糖，作用24 h后，收集细胞上清液，检测肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平，MTT法测定脂多糖刺激前后的RAW264.7细胞活性。
结果与结论：①脂多糖刺激前的RAW264.7细胞活性：对照组>实验组>空白对照组(P均< 0.05)。②脂多糖刺激后的RAW264.7细胞活性：实验组与对照组高于刺激前，但差异无显著性意义；空白对照组明显高于刺激前(P < 0.01)。3组间RAW264.7细胞活性差异无显著性意义(P > 0.05)。③脂多糖刺激后RAW264.7细胞白细胞介素6与肿瘤坏死因子α的表达量：对照组白细胞介素6表达量明显高于实验组和空白对照组(P < 0.05)；3组肿瘤坏死因子α表达量两两之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。表明微弧氧化处理镁合金对小鼠巨噬细胞活性无明显影响，同时降低了炎性反应。

关键词: 生物材料, 组织工程口腔材料, 镁合金, 微弧处理, 巨噬细胞, 肿瘤坏死因子, 白细胞介素6, 脂多糖, 细胞活性

Abstract:

BACKGROUND: Micro-arc oxidation treatment can improve the corrosion resistance of the magnesium alloy and delay the degradation rate.
OBJECTIVE: To investigate the effects of magnesium alloy with micro-arc oxidation treatment on tumor necrosis factor-alpha and interleukin-6 expression in mouse macrophage RAW264.7 cells.
METHODS: Extracts of magnesium alloy, magnesium alloy with micro-arc oxidation treatment or RPMI-1640 medium were added to RAW24.7 cells at 1 hour prior to lipopolysaccharide treatment for 24 hours. Then culture supernatants were collected for measuring the concentrations of tumor necrosis factor-alpha and interleukin-6, and cell proliferation were analyzed by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide method.
RESULTS AND CONCLUSION: Lipopolysaccharide could significantly increase RAW264.7 cell viability. However, there was no significant difference in lipopolysaccharide-induced RAW264.7 cell viability among the three groups (P > 0.05). But the cell viability in the blank control group was significantly increased after lipopolysaccharide treatment (P < 0.01). The highest viability of RAW264.7 cells without lipopolysaccharide stimulation was determined by magnesium alloy treatment, followed by magnesium alloy modified by micro-arc oxidation treatment and RPMI-1640 medium treatment (P < 0.05). Interleukin-6 level of lipopolysaccharide-induced RAW264.7 cells with magnesium alloy treatment appeared to be increased compared to the other two groups (P < 0.05). Unlike interleukin-6 response in lipopolysaccharide-induced RAW264.7 cells, there was no significant difference in tumor necrosis factor-alpha levels among these three groups (P > 0.05). These data suggested magnesium alloy with micro-arc oxidation treatment has no significant effect on RAW264.7 cell viability, and at the same time, reduces the inflammatory reaction.

Key words: biomaterials, tissue-engineered oral materials, magnesium alloy, micro-arc oxidation, macrophages, tumor necrosis factor-alpha, interleukin-6, lipopolysaccharide, cell viability

中图分类号:

R318

庄岩，吴锋，孟改利，李晓会. 微弧氧化镁合金对巨噬细胞肿瘤坏死因子和白细胞介素6的影响[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.011.

Zhuang Yan, Wu Feng, Meng Gai-li, Li Xiao-hui. Magnesium alloy modified by micro-arc oxidation can influence tumor necrosis factor-alpha and interleukin-6 production in macrophages[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.011.

图/表（结果） 1

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引言

随着生物材料的发展，人们对材料的生物相容性要求越来越高，过去研究仅仅注重材料的组织、血液相容性。近年来，材料对人体免疫系统的作用日益受到关注。当材料作为一种异物，即免疫原性作用于机体，机体将会产生一系列防御反应，如炎症反应、抗体产生、补体活化及各种细胞因子的大量表达等。

细胞因子是调节免疫反应和炎症反应的重要物质，它是由细胞分泌的具有介导和调节免疫、参与炎症及造血的小分子蛋白质，种类繁多，生物学功能复杂。其中与炎症密切相关的细胞因子有巨噬细胞移动抑制因子、白细胞介素1p、白细胞介素6、白细胞介素8、干扰素及肿瘤坏死因子等。白细胞介素6、白细胞介素1p与肿瘤坏死因子等细胞因子具有协同作用，既能活化也能抑制某些免疫反应；其中白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α的增高促进炎症反应，而白细胞介素10抑制炎症反应。不同材料引起的机体免疫反应有所不同，与材料本身的化学结构、化学成分、聚合程度、所用添加剂及所含金属成分都有关系。

研究表明细胞因子分泌越多，生物材料相容性越差^[1-2]，因此生物材料对这些细胞因子表达的影响可以用来鉴定材料引起炎症反应的能力。李晓霞等[2]以细胞因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β为研究对象，对国产无机三氧化物聚合物(MTA)介导的炎症反应进行相关的免疫学评价。实验运用双抗夹心ELISA检测新材料国产无机三氧化物聚合物引起体外小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞肿瘤坏死因子a和白细胞介素1β的变化。结果显示，未经脂多糖诱导的RAW264.7细胞与阳性材料接触后，肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的表达均高于阴性材料，差异均有显著性意义(P < 0.05)；国产无机三氧化物聚合物组和进口无机三氧化物聚合物组肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的表达与阴性材料比较差异无显著性意义(P > 0.05)；经脂多糖诱导的RAW264.7细胞与阳性材料、国产无机三氧化物聚合物、进口无机三氧化物聚合物接触后，肿瘤坏死因子a和白细胞介素1β的表达均高于阴性材料，差异均有显著性意义(P < 0.01)，结果表明国产无机三氧化物聚合物具有良好的生物相容性。目前研究普遍认为生物材料可诱导巨噬细胞中白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等细胞因子的表达。

众多生物材料中，镁合金以生物可降解特性、生物安全性高、生物力学相容性好、成本低等优势成为新一代医用金属材料，日益受到人们的关注^[3-5]。这类新型材料利用其在人体易降解的特性，实现了金属植入物在体内逐渐降解直至最终消失，避免了医用金属材料植入体内后取出的二次手术，显著降低了医疗风险和医疗成本。然而镁合金植入体内后的腐蚀问题及降解速率制约了镁合金的广泛应用。近年来，通过微弧氧化处理可提高镁合金的抗腐蚀性能，延缓镁合金的降解速率[6]。

微弧氧化又称等离子微弧氧化、微等离子体氧化、等离子体增强电化学表面陶瓷化、等离子体电解氧化、微弧放电氧化、阳极火花沉积、火花放电阳极氧化或火花阳极氧化^[7]。其是利用瞬间高温作用直接在Al、Mg和Ti等金属表面原位生成陶瓷膜，从而提高材料耐蚀、耐磨、绝缘和抗高温氧化性能的一种表面处理技术^[8-9]。它采用钢板等作阴极，镁、铝、钛等轻金属作阳极，在电解液环境中通电，溶液中的水发生电解，析出氧原子，氧原子与阳极表面反应，生成一层非晶态绝缘膜。绝缘膜使试样表面电阻增大，电极电压逐渐升高，同时阳极材料表面发生一系列物理、化学及电化学反应并产生气体为等离子体创造了条件。在等离子体环境下，形成瞬间高温高压微区，氧化膜融化形成熔融物，熔融物在电解液的冷却作用下迅速凝固下来形成陶瓷膜层。陶瓷膜层的形成会使其他地方变得相对较薄，然后在最薄的地方再次被击穿，再长出新的陶瓷膜，整个成膜过程就是“成膜→击穿→熔化→烧结→再成膜……”多次循环，直到在基体表面形成均匀的陶瓷膜层^[10]。

章志友等[8]通过单因素试验讨论了镁合金微弧氧化电解液各组分对成膜的作用，得到电解液最佳配方为 10 g/L(NaPO3)6、5 g/L NH4F、6 g/L KOH、6 mL/L C3H8O3，用扫描电镜(SEM)、X射线衍射(XRD)和能谱(EDS)分析了陶瓷膜层的表面形貌，截面形貌、相组成及元素组成；采用点滴试验、交流阻抗和盐雾试验考察了陶瓷层的耐腐蚀性能。结果表明，膜层表面分布着大量均匀的放电微孔，孔径在1-3 μm之间，膜层截面内层与基体过渡部分呈犬牙交错状态，结合良好；膜层由大量非晶态相及少量MgO组成，耐蚀性能优良，P与F元素的存在，证明了电解液组分较好地参与了微弧氧化反应。与其他许多表面处理技术相比，微弧氧化处理技术能够显著提高金属的表面性能^[11]，如硬度、耐磨性、耐腐蚀性和结合力等，具有很广阔的应用前景。邓姝皓等[11]为获得所要求厚度的镁合金微弧氧化膜，研究了镁合金微弧氧化的表面制备工艺。采用正交设计法优化实验方案，运用综合平衡法对每个方案下制备的氧化膜的厚度和膜层的硬度进行了分析，确定了各因素对氧化膜的影响程度，并优化微弧氧化工艺配方，确定了最佳工艺条件，并对最佳工艺条件下制备的氧化膜的微观形貌、结构、硬度以及耐腐蚀性进行了研究。结果表明，最佳工艺配方是NaOH 100 g/L，铝盐 40 g/L，氧化电压为45 V，电解液温度35 ℃；氧化膜主要由致密的阻挡层和多孔的疏松层构成，其主要成分是MgAl2O4和少量的MgO、Al2O3，经微弧氧化后其硬度和耐腐蚀性较镁合金基体有很大提高。镁合金心血管支架已成功应用于动物实验[12]，并进入人体临床试验^[13-14]。

目前，对这种新型材料的研究主要集中于细胞黏附、增殖及细胞毒性方面^[15-19]，而免疫方面的研究甚少。黄震等[19]体外观察探讨新型口腔植入材料微弧氧化AZ91D镁合金对人成骨样MG63细胞早期黏附的影响，实验分为3组，微弧氧化AZ91D镁合金材料实验组、纯钛材料对照组B和细胞直接生长在培养板对照组，利用表面轮廓仪、接触角测量仪、扫描电镜(SEM)和能谱分析(EDS)分别测量研究试件表面粗糙度、表面能大小、形貌特点和元素成分；将MG63细胞培养于各组表面，分析比较成骨细胞的早期黏附率及形态学变化，对数据采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析。结果显示，实验组表面为一层粗糙多孔、起伏不平的薄膜，主要元素有Mg、O、Si，粗糙度及表面能均比纯钛材料对照组增加(P < 0.05)；0.5，1，2 h 3组细胞黏附率差异有显著性意义(P < 0.05)，实验组>纯钛材料对照组>培养板对照组；培养4 h时实验组、纯钛材料对照组两组材料表面成骨细胞形态良好，结果说明微弧氧化AZ91D镁合金具有良好的成骨细胞相容性，有利于细胞的早期黏附。实验通过测定镁合金浸提液及微弧氧化处理镁合金浸提液干预后小鼠RAW264.7细胞分泌细胞因子的水平，同时与空白对照组比较，评价镁合金微弧氧化处理前后引起炎症反应的能力。

材料方法

设计：前后对照，细胞学观察实验。
时间及地点：于2011年7月至2012年3月在西安交通大学医学院研究生教学实验中心完成。
材料：
微弧氧化镁合金对小鼠巨噬细胞肿瘤坏死因子和白细胞介素6影响实验的主要试剂及仪器：
Main reagents and instruments:

小鼠RAW264.7细胞由西安交通大学医学院孟烈素博士提供。
实验方法：
镁合金及微弧氧化：将基体直径为35 mm的镁合金(AZ91)圆片，依次经过200#，400#，600#，800#，1 200#，1 500#，2 000#的砂纸打磨，去离子水和丙酮超声清洗反复冲洗，80 ℃烘干备用。
微弧氧化电解液组成为：NaOH、(NaPO3)6、EDTA-Na2(乙二胺四乙酸钠)、Ca(H2PO2)2 (次磷酸钙)、C3H8O3(甘油)等。电解液pH值控制在10-12之间。
以镁合金圆片为阳极、同样形状大小的不锈钢圆片为阴极，采用65 kW脉冲-直流电源对镁合金圆片进行微弧氧化处理，处理电压为400 V，占空比20%，频率为600 Hz，电流密度控制在0.5 A以下，处理时间5 min。整个过程控制电解液温度在60 ℃以内。处理完毕后去离子水冲洗干净，高温烘干备用。
浸提液制备：参照ISO 10993-12标准，以RPMI-1640为介质，按5 mL/1 g比例，37 ℃、24 h制备镁合金及微弧氧化镁合金材料浸提液。
细胞培养：将RAW264.7细胞接种入25 cm2细胞培养瓶，加入含体积分数10%小牛血清的1640培养基(青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/L)4.0-5.0 mL，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养。每二三天换液1次。用2.5%胰蛋白酶消化传代培养。
MTT测定：将上述RAW264.7细胞浓度调至5× 107 L-1，于96孔板加入200 μL/孔，培养24 h后弃去上清，然后分别加入镁合金浸提液(对照组)、微弧氧化镁合金浸提液(实验组)及RPMI-1640(空白对照组)100 μL，每样分别加20孔。作用1 h后，于各组中分别加入1 mg/L脂多糖(脂多糖刺激组，10孔/组)及1640培养液(脂多糖未刺激组，10孔/组)100 μL，20 h后每孔加入MTT 10 μL/孔。再培养4 h，弃上清，加入200 μL DMSO，37 ℃振荡15 min后，测定A值。
细胞因子活性测定：将上述RAW264.7细胞浓度调至1×108 L-1，于24孔板加入400 μL/孔，2h贴壁后，弃去上清，分别加入400 μL/孔镁合金浸提液(对照组)、微弧氧化镁合金浸提液(实验组)及RPMI-1640(空白对照组)，每样分别加20孔。1 h后，于各组中分别加入1 mg/L脂多糖(脂多糖刺激组，10孔/组)及1640培养液(脂多糖未刺激组，10孔/组)400 μL，20 h后收集上清夜，ELASA法测定细胞因子水平。
主要观察指标：脂多糖刺激前后各组细胞活性及细胞因子水平的变化。
统计学分析：采用SPSS13.0统计软件对上述参数进行统计学处理，数据以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

Toll样受体(TLR)在许多种细胞中表达，尤其表达于免疫细胞表面，包括巨噬细胞和树突状细胞。脂多糖即内毒素，主要通过结合到CD4/TLR4/MD2的受体复合物，促进巨噬细胞分泌多种细胞因子，引起强烈免疫反应。脂多糖常被用作免疫刺激剂^[20-22]。脂多糖/ TLR4的信号转导包括MyD88依赖途径和MyD88非依赖途径，其中 MyD88依赖途径在巨噬细胞对脂多糖诱导的免疫反应过程中发挥关键作用。MyD88依赖途径依次可以活化TOLLIP、IRAK、TRAF6，而TRAF6再分别通过MKK6和TAK1激活MAPKS(ERK、P38)和核因子κB^[23]，目前认为MyD88依赖途径的激活是促进包括肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素10等炎症因子和共刺激分子基因表达所必需的^[24]，在TLR4信号转导过程中脂多糖通过巨噬细胞表面表达的TLR4受体，进而活化MAPKS(ERK、P38、JNK)途径和核因子κB途径，调节肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素10等相关细胞因子基因的转录表达。MAPKs是一类高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，主要包括ERK1/2、p38MAPK和JNK。MAPKs能被多种炎性刺激激活，并对炎症的发生、发展起重要调控作用^[25]。大量研究报道脂多糖可诱导巨噬细胞3种MAPKs激活，巨噬细胞也可通过不同的MAPKs途径调节炎症反应，其中ERK信号转导途径被认为是经典MAPK信号转导途径。白细胞介素6在机体是一种重要的细胞因子，主要由活化的巨噬细胞产生，具有很强的促进炎症发生作用。

镁合金表面的生物活性涂层能提高植入物的生物相容性及稳定性，提高组织细胞相容性，减轻局部炎症免疫反应^[26]；采用过微弧氧化和溶胶-凝胶技术在镁合金表面制备的复合防护层，可以通过阻断腐蚀离子与镁合金的接触来增强 AzgID镁合金的耐蚀性^[27]。尚伟等^[27]用微弧氧化和溶胶凝胶法在AZ91D镁合金表面制备复合膜层，用扫描电镜(SEM)、能谱分析(EDS)、X射线衍射(XRD)和电化学测试等分析手段表征其成分、相结构和截面形貌，研究了复合膜层的耐蚀性。结果表明，溶胶凝胶膜有效地封闭了镁合金表面微弧氧化膜的微孔，形成结合力好且较为致密的复合膜层。复合膜层的组成主要有MgO、MgAl2O4、SiO2和ZrO2，其耐蚀性能有显著提高。孙伟等^[28]观察钙磷涂层对镁合金植入体周围软组织中骨形成蛋白2表达的影响，实验将27只兔随机分成3组，分别在兔下颌骨内植入钙磷涂层镁合金螺钉、镁合金螺钉及钛合金，植入后1，2，3个月，采用反转录聚合酶链技术检测植入体周围软组织中骨形成蛋白2 mRNA的表达情况。结果显示，钙磷涂层镁合金螺钉组、镁合金螺钉组周围软组织中骨形成蛋白2 mRNA的表达，随时间的增加逐渐增高，钙磷涂层镁合金螺钉组内各时间点间骨形成蛋白2 mRNA的表达水平差异有显著性意义(P < 0.05)，且镁合金螺钉组植入后1，2个月周围软组织中骨形成蛋白2 mRNA的表达水平高于钙磷涂层镁合金螺钉组(P < 0.05)；显示钙磷涂层能够促进骨形成蛋白2 mRNA的表达，并抑制其过度表达，有利于早期成骨过程，表现出良好的生物活性。王树峰等[29]探讨微弧氧化处理AZ31镁合金的生物相容性，实验将体外扩增培养的兔第3代骨髓基质细胞接种到未处理 AZ31镁合金(镁合金+骨髓基质细胞组)和微弧氧化AZ31镁合金(微弧氧化镁合金+骨髓基质细胞组)材料上，另设骨髓基质细胞组做对照，培养1，3，5，7 d观察细胞形态，细胞生长状况，细胞黏附状况，材料表面状况。结果显示3组细胞形态一致，以梭形为主，镁合金+骨髓基质细胞组中细胞生长状况明显不如微弧氧化镁合金+骨髓基质细胞组和骨髓基质细胞组(P < 0.05)，微弧氧化镁合金+骨髓基质细胞组材料表面有大量的细胞附着，并且生长正常，镁合金+骨髓基质细胞组材料表面没有细胞附着，有明显的裂痕(P < 0.05)；结果证实，微弧氧化处理AZ31镁合金具有良好的生物相容性，有利于细胞的附着和正常生长。

近年来人们做了广泛尝试来延缓镁在体内的降解速率，提高镁材料的韧性等^[30]，使得镁作为生物医学材料成为可能，目前镁合金材料己在骨科、心血管科、牙科等得到了初步应用^[31-32]。镁合金材料植入后会随着时间材料会逐渐降解，无需再次手术取出，减少了再次手术的创伤^[33]。苗波等^[34]采用微弧氧化的方法对镁合金进行表面处理，得到两种不同涂层镁合金，分别为钙磷涂层镁合金及钙磷银涂层镁合金，进行兔下颌骨内植入试验，以评价微弧氧化所得不同涂层镁合金及未处理镁合金的生物相容性。实验采用微弧氧化得到的两种镁合金植入体及未处理镁合金在无菌手术条件下植入哈尔滨大白兔的下颌骨内，植入后4，8，12周分批处死后取材，主要通过对4，8，12周组的肝肾病理切片检测描述植入材料的生物相容性。结果显示所有实验动物均进入数据分析阶段，3种镁合金植入物均未对实验动物的肝、肾产生损害，提示植入材料具有良好的生物相容性，一定剂量银离子的加入是安全的，这为镁合金表面改性方面的研究特别是在骨修复及骨固定方面的应用提供了新的理论基础。

在炎症反应中，巨噬细胞起着重要作用，在受到外界刺激如脂多糖，可释放大量的炎症递质和促炎症因子，如一氧化氮和白细胞介素6、白细胞介素1α、肿瘤坏死因子α等，促炎症因子介导了炎症发生发展以及组织的损伤[18]。正常的巨噬细胞在体外未经脂多糖诱导一般不表达肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β，因此在脂多糖未诱导巨噬细胞的情况下，生物材料如果能引起细胞表达一定的肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β，说明这种生物材料具有一定的免疫原性；而在脂多糖诱导下，巨噬细胞表达肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β显著增高，也可反映生物材料引起免疫反应的程度。因此在实验中将体外培养的小鼠巨噬细胞分为脂多糖未刺激和脂多糖刺激两组，在免疫学方面对生物材料的相容性进行评价。

RAW264.7细胞是一种鼠源性的单核巨噬细胞系，在炎症反应中起着重要作用，当受到外界因素，如脂多糖刺激时能够合成并释放大量的炎症递质和炎症因子，如NO和白细胞介素6、白细胞介素1、肿瘤坏死因子α等，模拟体内炎症反应状态，作为一种炎症细胞模型而被广泛用于炎症研究^[35]。石榴等^[36]比较两株小鼠来源的巨噬细胞株RAW264.7和Ana-1经脂多糖诱导后在形态及细胞因子表达等方面的差异。实验以MTT法检测0.1，1，10，100 mg/L脂多糖作用后两株细胞的增殖活力，确定最佳作用浓度。选择1 mg/L 脂多糖刺激RAW264.7和Ana-1细胞，ELISA法分别于0，4，8，12，24 h检测两株细胞肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6和白细胞介素10的表达量。结果显示，脂多糖终质量浓度为1 mg/L时，两株细胞存活率分别为(162.05±28.14)%，(159.92±20.43)%，显著大于同细胞其他浓度组别(P < 0.01)；1 mg/L 脂多糖刺激后，两株细胞各细胞因子表达均为随时间呈先增多后减少趋势，RAW264.7细胞峰值出现时间早于Ana-1细胞；RAW264.7细胞4 h时肿瘤坏死因子α表达高于Ana-1细胞(P < 0.01)，8，12 h时肿瘤坏死因子α表达低于Ana-1细胞(P < 0.05)；RAW264.7细胞各时间点白细胞介素1β的表达均高于Ana-1细胞(P < 0.05)；RAW264.7细胞各时间点白细胞介素6的表达均低于Ana-1(P < 0.05)；RAW264.7细胞脂多糖刺激后4 h白细胞介素10的表达高于Ana-1细胞(P < 0.05)。结果表明当脂多糖质量浓度为1 mg/L时，Ana-1细胞与RAW264.7细胞存活率均最强；经脂多糖刺激后，RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β、白细胞介素10表达高峰早于Ana-1细胞，各细胞因子表达量各有侧重，研究者进行炎症相关实验时对Ana-1细胞和RAW264.7的选择需考虑两者之间的差异。RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的表达峰值时间为脂多糖(1 mg/L)刺激后4 h，此时RAW264.7细胞的吞噬功能更强，对炎症的敏感性也更高[33]。实验通过这一模型观察镁合金及微弧氧化处理镁合金浸提液对RAW264.7细胞活性及巨噬细胞炎症因子生成的影响。

MTT法可用于检测细胞活性及细胞增殖情况，镁合金材料植入体内后，由于易降解释放一定的镁离子，对细胞生长具有一定的促进作用。实验结果显示，镁合金浸提液对细胞的促增殖作用高于微弧氧化处理镁合金。而经过脂多糖刺激后，各组间细胞活性差异无显著性意义，有可能因为脂多糖刺激细胞增殖的作用大于镁离子的作用，掩盖了镁离子的作用。

白细胞介素6、肿瘤坏死因子α是一种具有多重免疫调节功能的细胞因子，在多种细胞的分化、增殖、免疫球蛋白的产生、炎症反应和急性期反应中都发挥着重要作用。生物材料与机体接触后引起炎性反应，导致细胞因子高度表达，实验结果显示，对照组脂多糖刺激RAW264.7细胞24 h后的白细胞介素6水平明显高于空白对照组与实验组(P < 0.01)，实验组与空白对照组白细胞介素6水平组间比较差异无显著性意义。实验组与对照组肿瘤坏死因子α水平稍高于空白对照组，但差异无显著性意义(P > 0.05)，实验组与对照组肿瘤坏死因子α水平组间比较差异无显著性意义。以上结果显示，白细胞介素6较肿瘤坏死因子α更能够反映医用材料的炎性反应程度。同时表明，微弧氧化处理镁合金材料组白细胞介素6水平明显低于对照组，这可能与微弧氧化处理后镁合金的降解速度明显降低有关，导致炎症反应程度进一步减弱。

微弧氧化镁合金对巨噬细胞肿瘤坏死因子和白细胞介素6的影响

Magnesium alloy modified by micro-arc oxidation can influence tumor necrosis factor-alpha and interleukin-6 production in macrophages

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