生长因子缓释系统复合纳米支架材料修复犬下颌骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.003

中国组织工程研究

• 组织工程骨及软骨材料 tissue-engineered bone and cartilage materials • 上一篇下一篇

生长因子缓释系统复合纳米支架材料修复犬下颌骨缺损

周庆梅，孙健，李亚莉，陈立强，许尧祥

青岛大学医学院附属医院口腔颌面外科，山东省青岛市 266003

收稿日期:2012-09-28 修回日期:2012-10-30 出版日期:2013-05-21 发布日期:2013-05-21
通讯作者: 孙健，博士，教授，主任医师，硕士生导师，青岛大学医学院附属医院口腔颌面外科，山东省青岛市 266003 sunjianqy@126.com
作者简介:周庆梅★，女，1983年生，山东省滨州市人，汉族，青岛大学医学院在读硕士，主要从事口腔颌面外科学专业。 bzzhou.163.com@163.com
基金资助:
青岛市科技局重点科研项目(08-2-1-5-NSH-5)

Growth factor delivery system with nanoscaffold materials repairs canine mandibular defects

Zhou Qing-mei, Sun Jian, Li Ya-li, Chen Li-qiang, Xu Yao-xiang

Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical School, Qingdao 266003, Shandong Province, China

Received:2012-09-28 Revised:2012-10-30 Online:2013-05-21 Published:2013-05-21
Contact: Sun Jian, M.D., Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical School, Qingdao 266003, Shandong Province, China sunjianqy@126.com
About author:Zhou Qing-mei★, Studying for master’s degree, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical School, Qingdao 266003, Shandong Province, China bzzhou.163.com@163.com
Supported by:
the Major Scientific Research Project of Qingdao Municipal Science and Technology Bureau, No. 08-2-1-5-NSH-5

摘要/Abstract

摘要：

背景：支架材料联合细胞因子构建组织工程骨不受血管化和细胞培养因素的限制，这种构建模式可能诱导出较大体积的实用型组织工程骨。
目的：观察壳聚糖纳米微球/纳米羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸复合生长因子缓释支架修复犬下颌骨临界骨缺损的能力。
方法：取杂种犬12条，制作双侧下颌骨临界骨缺损模型，一侧植入复合生长因子骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1及血管内皮生长因子165的壳聚糖纳米微球/纳米羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸缓释支架(实验组)，另一侧植入壳聚糖纳米微球/纳米羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸缓释支架(对照组)，术后4，8，12周取下颌骨标本行X 射线、组织学及免疫组织化学检查。
结果与结论：实验组术后不同时间点X射线灰度值及骨钙素积分吸光度值均高于对照组(P < 0.05)，表明复合生长因子的支架材料修复骨缺损的成骨能力优于未复合生长因子的支架材料。组织学观察结果显示，实验组术后不同时间点成骨时间及效果均优于对照组，表明复合生长因子骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1及血管内皮生长因子165的壳聚糖纳米微球/纳米羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸缓释支架可更快更有效地促进骨缺损修复。

关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 生长因子, 骨形态发生蛋白2, 壳聚糖, 羟基磷灰石, 聚乳酸-羟基乙酸, 骨支架材料, 下颌骨缺损, 成骨, 骨钙素, 其他基金

Abstract:

BACKGROUND: Scaffold materials are combined with cytokines to construct tissue-engineered bone, which cannot be limited by vascularization and cell culture. This reconstruction mode is able to induce a large-scale practical tissue-engineered bone.
OBJECTIVE: To observe the ability of chitosan microsphere/nano-hydroxyapatite/poly(lactic-co-glycolic acid) scaffold with slow-released growth factors to repair critical mandibular defects in a dog.
METHODS: Animal models of bilateral critical mandibular bone defects were established in 12 hybrid dogs. One side was implanted a chitosan microsphere/nano-hydroxyapatite/poly(lactic-co-glycolic acid) scaffold with bone morphogenetic protein 2, transforming growth factor-β1 and vascular endothelial growth factor 165 (experimental group); and the other side was implanted a chitosan microsphere/nano-hydroxyapatite/poly(lactic-co-glycolic acid). Manbidular specimens were harvested at postoperative weeks 4, 8 and 12 to carry out X-ray, histological and immunohistochemical examinations.
RESULTS AND CONCLUSION: After surgery, the X-ray gray value and osteocalcin integral absorbance value in the experimental group were higher than those in the control group at different time points (P < 0.05), showing that the osteogenic ability of the compound growth factor scaffold is superior to the scaffold without growth factor in the repair of bone defects. Histological observation results showed that the ossification time and effect in the experimental group were better than those in the control group at different time point after surgery, indicating that the chitosan microsphere/nano-hydroxyapatite/poly(lactic-co-glycolic acid) scaffold with bone morphogenetic protein 2, transforming growth factor-β1 and vascular endothelial growth factor 165 can be faster and more effective to promote bone defect repair.

Key words: biomaterials, tissue-engineered bone materials, growth factor, bone morphogenetic protein 2, chitosan, hydroxyapatite, poly(lactic-co-glycolic acid), bone scaffold materials, mandibular bone defects, ossification, osteocalcin, other grants-supported paper

中图分类号:

R318

周庆梅，孙健，李亚莉，陈立强，许尧祥. 生长因子缓释系统复合纳米支架材料修复犬下颌骨缺损[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.003.

Zhou Qing-mei, Sun Jian, Li Ya-li, Chen Li-qiang, Xu Yao-xiang. Growth factor delivery system with nanoscaffold materials repairs canine mandibular defects [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.003.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 12条犬均进入结果分析。

2.2 一般情况观察术后前3 d各实验犬术区稍肿胀，无明显渗血渗液，术后7 d切口一期愈合，术后各时间点实验犬均未见排斥反应。

2.3 术后不同时间点实验组与对照组下颌骨标本影像学灰度值检测结果
实验组：术后4周时骨缺损区影像呈云雾状，术后8周时骨缺损区骨密度增高，明显可见成骨缺损区的桥接，术后12周时骨缺损区被新生骨组织充满，见图1A。

对照组：术后4周时骨缺损区未见明显变化，术后8周时骨缺损区呈云雾状改变，术后12周时骨缺损区骨密度增高，可见部分桥接形成，见图1B。

实验组术后不同时间点的灰度值高于对照组(P < 0.05)，说明相同时间内实验组较对照组成骨多；随着时间的推移实验组支架逐渐降解，新生骨组织量不断增加，实验组组内不同时间点灰度值比较差异有显著性意义(P < 0.05)；随着时间的推移对照组支架逐渐降解，新生骨组织不断增加，对照组组内不同时间点灰度值比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.4 术后不同时间点实验组与对照组下颌骨标本组织学观察结果
实验组：术后4周时骨缺损区见新生类骨质形成，少量成骨细胞，少量血管，支架材料开始吸收；术后8周时缺损区见骨小梁形成，较多成骨细胞，较多血管，支架材料明显吸收；术后12周时骨缺损区骨小梁排列规则，成骨细胞密集，血管丰富，支架完全吸收，见图2A。

对照组：术后4周时骨缺损区见新生血管形成，支架材料部分开始吸收；术后8周时见骨缺损区少量骨样组织，少量成骨细胞，少量血管，支架材料部分吸收；术后12周时骨缺损区见不规则的骨小梁形成，成骨细胞较丰富，血管较多，支架材料大部分被吸收，见图2B。

2.5 术后不同时间点实验组与对照组下颌骨标本免疫组织化学检测结果见图3。

实验组：术后4周时骨缺损区可见少量骨钙素被染成棕褐色，术后8周时可见较多骨钙素被染成棕褐色，术后12周时可见大量骨钙素被染成棕褐色，见图3A。

对照组：术后4周时骨缺损区基本未见被染成棕褐色的骨钙素，术后8周时可见少量骨钙素被染成棕褐色，术后12周时较多骨钙素被染成棕褐色，见图3B。

实验组术后不同时间点骨钙素积分吸光度值高于对照组(P < 0.05)，说明相同时间内实验组较对照组成骨多；随着时间的推移，实验组支架逐渐降解，新生骨组织量不断增加，实验组组内不同时间点骨钙素积分吸光度值比较差异有显著性意义(P < 0.05)；随着时间的推移，对照组支架逐渐降解，新生骨组织量不断增加，对照组组内不同时间点骨钙素积分吸光度值比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

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引言

对于先天畸形、牙周病、感染、创伤及肿瘤等原因造成的颌骨缺损，目前临床上采取的修复手段主要有自体骨移植、异体或异种骨移植、植入骨代用品和人工材料。其中自体骨移植来源有限且有植入骨的异常吸收，同时会造成供区的创伤、畸形和瘢痕等多种并发症；异体或异种骨移植则有免疫排斥反应和传播疾病的可能性；骨代用品，如人工合成材料和人工材料(如金属骨支架)植入后会引起排斥反应和感染，无法取得良好的重建效果。随着“骨诱导理论”的提出，对成骨相关种子细胞、细胞因子和支架材料研究的深入，探索采用组织工程骨构建手段修复重建各种类型的颌骨缺损、畸形可能是解决骨供给来源的最佳方法。

目前骨组织工程构建采用较多的方式是支架材料+成骨细胞+细胞因子，这种方式构建组织工程骨的瓶颈是如何进行血管化，如果不能血管化，所构建组织工程骨的体积大小就受到了内部组织营养供应障碍的限制，目前还没有一种成熟的方法能够解决较大体积组织工程骨构建中血管化的难点，而且成骨细胞的培养和细胞永生化技术支持还没有取得令人满意的进展。支架材料联合细胞因子构建组织工程骨不受血管化因素和细胞培养因素的限制，如果能解决细胞因子的运送手段和时效、量效关系控制的技术难点，这种组织工程骨构建模式可能诱导出较大体积的实用型组织工程骨。

实验旨在研究在没有种子细胞的情况下，复合生长因子的壳聚糖纳米微球/纳米羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸缓释支架修复犬下颌骨临界骨缺损的能力，为临床骨缺损修复的应用提供理论依据。Schmitz等[1]提出了临界骨缺损的概念，即指在动物的生长周期内，特定动物的特定骨上不能自行愈合的最小骨缺损。一般认为在长骨缺损大于长骨直径1.5倍时的大段骨缺损，机体自身无法修复，需外界干预。Hollinger等[2]认为犬的下颌骨缺损为45 mm，所以实验参照相关文献资料制作了犬下颌骨临界骨缺损模型。

材料方法

设计：自身对比动物实验。
时间及地点：于2011年10月至2012年3月在青岛大学医学院附属医院中心实验室、病理科完成。
材料：
支架材料：壳聚糖纳米微球/纳米羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸缓释支架，壳聚糖纳米微球/纳米羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸缓释支架/骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)/转化生长因子β1(transforming growth factor-beta1，TGF-β1)/血管内皮生长因子165 (vascular endothelial growth factor 165，VEGF165)支架系统均为作者所在实验组制作，以牛血清蛋白为模型药物，以来自凝胶法制备壳聚糖微球[3]，将微球与纳米羟基磷灰石和聚乳酸-羟基乙酸按一定比例混合，以冰粒子为致孔剂，采用粒子沥滤-冷冻干燥复合工艺制备壳聚糖纳米微球/纳米羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸缓释支架复合缓释支架^[4-5]。通过一系列实验证明其符合一般骨组织工程支架系统的要求[6]，每个支架约30 mm×10 mm× 5 mm大小，平均每个支架含有生长因子rhBMP-2 1.15 μg，VEGF165 0.57 μg，TGF-β1 0.28 μg[4]。
生长因子缓释系统复合纳米羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸支架修复犬下颌骨缺损实验的主要试剂及仪器：rhBMP- 2、TGF-β1、VEGF165 (美国PEPROTECH公司)；兔抗犬骨钙素(北京博奥森公司)；山羊抗兔IgG/HRP (北京中杉)；LEICA RM2235手动轮转切片机(中国，上海)；olympus显微镜BX41 (日本)；菲利普DR (美国)。
实验动物及分组：1岁龄杂种犬12条，由青岛大学医学院附属医院实验动物中心提供，雌雄不拘，体质量 20 kg左右，于双侧下颌骨下缘制造出30 mm×10 mm× 5 mm临界骨缺损，随机选取一侧下颌骨临界骨缺损区植入复合生长因子rhBMP-2、TGF-β1及VEGF165的壳聚糖纳米微球/纳米羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸缓释支架(实验组)，另一侧下颌骨临界骨缺损区植入壳聚糖纳米微球/纳米羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸缓释支架(对照组)，实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求[7]。
实验方法：
建立下颌骨缺损动物模型：于犬下肢静脉注射30 g/L戊巴比妥钠0.03 g/kg行全身麻醉，常规备皮、消毒、铺单，于下颌角前沿下颌骨下缘走行作3.0 cm长弧形切口，切开下颌骨下缘皮肤、皮下组织、肌肉、骨膜，分离显露下颌骨体部，于下颌角前、下颌体部下缘用齿科低速慢钻磨出30 mm×10 mm×5 mm的全层骨缺损，术中生理盐水降温，保留涉及的部分牙根及下牙槽血管神经束。
植入支架材料：生理盐水冲洗术野后，实验组植入复合生长因子rhBMP-2、TGF-β1及VEGF165的壳聚糖纳米微球/纳米羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸缓释支架，对照组植入壳聚糖纳米微球/纳米羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸缓释支架，1号丝线分层缝合骨膜、肌肉、皮下组织及皮肤关闭切口，并分笼饲养。术后3 d肌注庆大霉素，4 ×104 U/次， 2次/d，手术伤口不需要拆线，任其自行脱落。
一般情况观察：术后观察动物进食、活动和切口愈合等一般情况。
影像学灰度值检测：于术后4，8，12周，分别从实验犬中随机抽取4条处死，于骨缺损区以外4 mm范围内取标本，分别拍摄标本的X射线片，以了解骨缺损的修复，用软件Image-pro plus 6.0测量标本处X射线的灰度值(即物体X射线的透光度)。
组织学观察：在流动水冷却条件下，于骨缺损区以外4 mm范围内取标本，置入体积分数10%甲醛溶液固定48 h，常规脱钙、石蜡包埋，切片(纵切厚度3μm)，苏木精-伊红染色，每个标本随机选取2张切片，每张切片随机选择10个视野，100倍光学显微镜下观察两组成骨细胞、血管、新生骨组织生长情况。
免疫组织化学染色检查：按下述步骤进行免疫组织化学染色：石蜡切片脱蜡至水，孵育，抗原修复，山羊血清封闭加一抗兔抗犬骨钙素，加二抗山羊抗兔IgG/HRP，DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封固、镜检。检测两组中骨钙素形成情况，以有色(棕色)颗粒代表阳性信号，每张切片随机选取5个视野，用专业图像分析软件Image-pro plus 6.0在同一光强度下阳性信号吸光度(A)，取3次平均值。
主要观察指标：术后不同时间点两组下颌骨标本X射线、组织学及免疫组织化学观察结果。
统计学分析：数据以x(_)±s表示，用SPSS 8.0软件，同一时间点，实验组与对照组间行配对资料的t 检验；
相同区组不同时间点间行单因素方差分析，并行两两比较的LSD-t 检验。

讨论

实验以壳聚糖纳米微球为载体，复合生长因子rhBMP-2、TGF-β1及VEGF165于纳米羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸支架材料上，以期支架材料植入宿主体内后生长因子能高效稳定的释放，促进骨缺损区成骨细胞的生长、增殖及分化，找到一种安全、方便、廉价、成骨能力强的骨移植材料。

利用纳米技术制备生物材料为发展新型生物材料提供了新途径和思路。壳聚糖具有生物可降解性、生物相容性，是自然界天然高分子载体材料[8-9]，应用壳聚糖微球包封药物，具有控制药物释放、延长药物疗效的作用[10]，可提高药物稳定性，降低其不良反应[11]。实验采用离子凝胶法制得的纳米微球形态良好，呈规则球形和类球形，分散度好，无粘连，粒径分布较集中，在220-770 nm之间，以380-650 nm最多[5]。纳米骨组织工程支架材料有利于蛋白吸附，细胞黏附、伸展、迁移及细胞的增殖和分化[12]，Gou等[13]通过放电等离子技术制备平均晶粒尺度为113 nm的致密羟基磷灰石陶瓷，相比于常规陶瓷，其表面黏附的细胞数量明显增加，且在第7天显著促进了成骨细胞增殖。同时羟基磷灰石具有生物相容性好、硬度大的优点，也有脆性大、无法塑形、难降解等的不足。聚乳酸-羟基乙酸是聚乳酸与羟基乙酸的共聚物，具有良好的生物相容性、可塑性和生物降解性，但机械强度不足[14]。实验采用冷冻干燥方法，以125-355 μm的冰粒子作为致孔剂，成功制作出适合孔径且孔隙率大于80%的复合支架纳米羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸，其同时具有纳米羟基磷灰石和聚乳酸-羟基乙酸的优点，可以起到加强壳聚糖对牛血清蛋白的缓释作用，保证生长因子在机体局部有较高的浓度和较长的持续时间[5]。

骨形态发生蛋白参与骨骼的生长、发育及创伤修复，主要表现为骨形态发生蛋白的诱导骨形成作用，骨形态发生蛋白9主要存在于肝脏，成骨作用最强，rhBMP-2、骨形态发生蛋白7次之[15]。目前对骨形态发生蛋白研究较多的是rhBMP-2，其广泛分布于骨基质中，能在体内外诱导血管周围游走的间充质细胞或骨髓基质细胞转化为软骨细胞或骨细胞，促进骨组织修复[16]。rhBMP-2与聚乳酸、明胶海绵、珊瑚等载体制备的缓释系统，能持续发挥骨诱导作用，用于骨缺损的修复效果更明显[17]。TGF-β能促进成骨细胞增殖和分化，促进成纤维细胞分泌纤黏素和胶原并能抑制破骨细胞的活性，对骨细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用[18-19]。实验发现TGF-β1可促进成骨细胞合成Ⅰ型胶原、骨黏结素和骨桥蛋白，同时促进骨钙素合成[20]，TGF-β1还可抑制骨髓培养中破骨细胞的形成及其活性，从而抑制骨吸收[21]。VEGF是一种具特异性促进血管内皮生长和血管形成的生长因子[22-23]，具有诱导干细胞分化成骨的能力[24]，在骨损伤修复中具有重要作用。研究发现骨形态发生蛋白与VEGF在骨折愈合中对成骨有相互依赖调控的作用，骨形态发生蛋白可使成骨样细胞VEGF高表达，从而刺激血管的生成，并且VEGF的产生与局部微环境中骨形态发生蛋白的浓度呈正相关，VEGF同时促进成骨细胞分化[25]。骨钙素也称为骨依赖性维生素K蛋白，是由分化成熟成骨细胞分泌的一种非胶原骨基质蛋白，在基质矿化期开始分泌，合成后大部分沉积于骨基质中，是骨形成的决定因素，是成骨细胞的惟一特异性生化指标，它只反映骨形成的活性，而不是骨的矿化，是代表骨代谢瞬间变化的一个灵敏、特异的生化指标[26]。骨钙素在新骨形成过程中并不是无止境增加的，其表达随成骨细胞的不断分化而逐渐增加，并随成熟骨细胞的增多而下降[27]。

实验制备的纳米羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸复合支架，可起到加强壳聚糖对牛血清蛋白的缓释作用，从而保证生长因子在机体局部有较高浓度和较长的维持时间，使其成为高效的三维多空缓释系统。研究结果表明，支架材料在复合生长因子rhBMP-2、TGF-β1及VEGF165而没有种子细胞的情况下，可以修复骨缺损，对比实验证实，复合生长因子的支架材料成骨能力明显优于单纯植入的支架材料，实验证实，复合生长因子rhBMP-2、TGF-β1及VEGF165的壳聚糖纳米微球/纳米羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸缓释支架能更快更有效地促进骨缺损愈合，同时也证实rhBMP-2、TGF-β1及VEGF165对骨形成的促进作用。

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骨形态发生蛋白参与骨骼的生长、发育及创伤修复，主要表现为骨形态发生蛋白的诱导骨形成作用，骨形态发生蛋白9主要存在于肝脏，成骨作用最强，rhBMP-2、骨形态发生蛋白7次之。目前对骨形态发生蛋白研究较多的是rhBMP-2，其广泛分布于骨基质中，能在体内外诱导血管周围游走的间充质细胞或骨髓基质细胞转化为软骨细胞或骨细胞，促进骨组织修复。rhBMP-2与聚乳酸、明胶海绵、珊瑚等载体制备的缓释系统，能持续发挥骨诱导作用，用于骨缺损的修复效果更明显。TGF-β能促进成骨细胞增殖和分化，促进成纤维细胞分泌纤黏素和胶原并能抑制破骨细胞的活性，对骨细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用。实验发现TGF-β1 可促进成骨细胞合成Ⅰ型胶原、骨黏结素和骨桥蛋白，同时促进骨钙素的合成，TGF-β1 还可抑制骨髓培养中破骨细胞的形成及其活性，从而抑制骨吸收。VEGF是一种具有特异性促进血管内皮生长和血管形成的生长因子，具有诱导干细胞分化成骨的能力，在骨损伤修复中具有重要作用。研究发现骨形态发生蛋白与VEGF在骨折愈合中对成骨有相互依赖调控的作用，骨形态发生蛋白可使成骨样细胞VEGF高表达，从而刺激血管的生成，并且VEGF的产生与局部微环境中骨形态发生蛋白的浓度呈正相关，VEGF同时促进成骨细胞分化。骨钙素也称为骨依赖性维生素K蛋白，是由分化成熟成骨细胞分泌的一种非胶原骨基质蛋白，在基质矿化期开始分泌，合成后大部分沉积于骨基质中，是骨形成的决定因素，是成骨细胞的惟一特异性生化指标，它只反映骨形成的活性，而不是骨的矿化，是代表骨代谢瞬间变化的一个灵敏、特异的生化指标。骨钙素在新骨形成过程中并不是无止境增加的，其表达随成骨细胞的不断分化而逐渐增加，并随成熟骨细胞的增多而下降。

生长因子缓释系统复合纳米支架材料修复犬下颌骨缺损

Growth factor delivery system with nanoscaffold materials repairs canine mandibular defects

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