纳米羟基磷灰石复合基因转染生长因子修复牙槽骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.002

中国组织工程研究

• 纳米生物材料 nanobiomaterials • 上一篇下一篇

纳米羟基磷灰石复合基因转染生长因子修复牙槽骨缺损

朱建华¹，袁旭¹，魏佳佳¹，刘继光²

1佳木斯大学附属口腔医院牙周黏膜科，黑龙江省佳木斯市 154007
2佳木斯大学口腔医学院，黑龙江省佳木斯市 154007

收稿日期:2012-09-20 修回日期:2012-10-16 出版日期:2013-05-21 发布日期:2013-05-21
通讯作者: 刘继光，博士，教授，佳木斯大学，黑龙江省佳木斯市154007 liujg5550@163.com
作者简介:朱建华，女，1959年生，黑龙江省佳木斯市人，汉族，教授，主要从事牙周黏膜病方面的研究。 Zhu8622877@yahoo.com.cn
基金资助:
黑龙江省自然科学基金(D201016)

Growth factor genetic modification and nano-hydroxyapatite composite for repair of alveolar bone defects

Zhu Jian-hua¹, Yuan Xu_¹, Wei Jia-jia¹, Liu Ji-guang²

1 Department of Periodontal Mucosa, Affiliated Stomatological Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China
2 Stomatological School of Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China

Received:2012-09-20 Revised:2012-10-16 Online:2013-05-21 Published:2013-05-21
Contact: Liu Ji-guang, M.D., Professor, Stomatological School of Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China liujg5550@163.com
About author:Zhu Jian-hua, Professor, Department of Periodontal Mucosa, Affiliated Stomatological Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China Zhu8622877@yahoo.com.cn
Supported by:
the Natural Science Foundation of Heilongjiang Province, No. D201016

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究发现成骨细胞可促进牙槽骨的形成，而血小板衍生生长因子A因子转染成骨细胞对于牙槽骨形成的作用尚不清楚。
目的：将基因转染的血小板衍生生长因子A重组质粒与纳米羟基磷灰石复合移植到骨缺损处，观察其对骨缺损修复的影响。
方法：将24只新西兰大白兔随机分成实验组与对照组，制作双侧下颌下缘10 mm×6 mm×4 mm骨质缺损，实验组植入血小板衍生生长因子A转染成骨细胞与纳米羟基磷灰石的复合材料，对照组单纯植入纳米羟基磷灰石。术后4，8，12周取材行大体标本、锥形束CT、组织学观察及扫描电镜观察。
结果与结论：术后不同时间点，实验组缺损处新骨生成，成骨细胞、骨小梁、骨陷窝及新生血管修复情况，以及材料与牙槽骨连接处的骨结合均明显优于对照组(P < 0.05)。表明血小板衍生生长因子A转染成骨细胞与纳米羟基磷灰石复合生成的新型材料，有较好的生物相容性，可加速骨组织再生，促进骨组织缺损修复。

关键词: 生物材料, 纳米生物材料, 牙槽骨, 下颌骨缺损, 血小板衍生生长因子A因子转染成骨细胞, 复合材料, 纳米羟基磷灰石, 牙周炎, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that the osteoblasts can promote the formation of the alveolar bone, and platelet-derived growth factor A genetic modification effect on osteoblasts to promote alveolar bone
formation is still unclear.
OBJECTIVE: To implant platelet-derived growth factor A recombinant plasmid and nano-hydroxyapatite composite into bone defects, and then to observe the effects on bone defect repair.
METHODS: Twenty-four New Zealand white rabbits were randomized into experimental and control groups. Bilateral mandibular defects of 10 mm×6 mm×4 mm were prepared. Platelet-derived growth factor A-transfected osteoblasts and nano-hydroxyapatite composite material was implanted into the experimental group, while nano-hydroxyapatite was implanted into the control group. Gross observation, cone beam CT, histological observation and scanning electron microscope observation were performed at postoperative 4, 8, and 12 weeks.
RESULTS AND CONCLUSION: At different time points after implantation, new bone formed at defect sites. Experimental group was superior to the control group in the following aspects: osteoblasts, trabecular bone, lacunae, neovascularization repair, as well as osseointegration between implant material and alveolar bone (P < 0.05). These findings indicate that platelet-derived growth factor A transfected osteoblasts and nano-hydroxyapatite composite can generate a new material with better biocompatibility, which can accelerate the regeneration of bone tissue and promote bone defect repair.

Key words: biomaterials, nanobimaterials, alveolar bone, mandibular defects, platelet-derived growth factor A-transfected osteoblasts, composite materials, nano-hydroxyapatite, periodontitis, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

朱建华，袁旭，魏佳佳，刘继光. 纳米羟基磷灰石复合基因转染生长因子修复牙槽骨缺损[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.002.

Zhu Jian-hua, Yuan Xu, Wei Jia-jia, Liu Ji-guang. Growth factor genetic modification and nano-hydroxyapatite composite for repair of alveolar bone defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.002.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 24只兔均进入结果分析。

2.2 实验组与对照组下颌骨标本大体观察结果各期每组标本大体解剖观察均未见纳米羟基磷灰石复合材料移植物周围的软组织坏死等病变。术后4周，质软、半透明，材料在骨缺损表面附着稳定可靠；术后8周包裹材料外表面的骨膜增厚，其上附着肌肉组织牢固，不易剥脱，材料轮廓较4周时不明显；术后12周，材料外观与原骨质色泽、质地相近。

2.3 实验组与对照组下颌骨标本锥形束CT观察结果术后4周，对照组缺损断端模糊，无明显阻射影；实验组呈现低密度阻射影；两组骨缺损界限均清晰可见。术后8周，对照组呈现低密度阻射影，骨缺损间隙仍较清晰；实验组可见斑片状阻射影，骨缺损界限不清晰。术后12周，对照组骨密度不均匀，呈斑片状密度增高影，骨缺损间隙模糊可见；实验组骨缺损呈骨性连接，骨缺损间隙模糊，为连续性高密度阻射影，见图1，2。

2.4 实验组与对照组下颌骨标本组织学观察结果见图3，4。

术后4周，对照组缺损区由纤维结缔组织构成，边缘可见散在新骨；实验组可见大量骨样组织长入复合材料，有小的骨岛形成，可见少量新生血管。术后8周，对照组可见新生血管量增多，边缘见散在新生骨向中央延伸，材料内骨样组织较4周时增多，但仍较为疏松且为新生组织，材料残留仍较多，降解缓慢；实验组骨样组织显著增多，而且更加成熟，有骨小梁、大量骨细胞和成骨细胞，材料部分降解。术后12周，对照组骨缺损被不完全修复，边缘成骨细胞较活跃；实验组材料基本完全降解，被新骨组织所代替。

2.5 实验组与对照组下颌骨标本扫描电镜观察结果术后4周，对照组中材料与骨结合不紧密，界面处有明显缝隙，可见纤维结缔组织；实验组中复合材料与骨结合紧密，界面处无明显分界，材料区有骨样组织长入。以上结果表明复合材料的生物相容性明显优于单纯材料，可促进新生组织的快速长入。术后8周，对照组中仍可看到材料与缺损端的分界，缺损区有大量材料残留，有少量骨样组织沿材料空隙长入材料；实验组中可以看到缺损中近界面区新生组织致密，形貌与正常骨相似，有少量材料残留。植入复合材料的缺损内有大量新骨形成，而植入单纯材料的缺损愈合缓慢。术后12周，对照组中缺损端与缺损内新生骨组织融合相对较差，缺损内结构疏松，有较多孔隙。材料仅部分降解，有大量残留，特别是缺损中心区仅有少量组织长入尚未降解的材料内；实验组中可以看到缺损端与缺损内新生骨组织融合良好，缺损边界和中心均为致密的骨样组织。材料大部分已降解，只有少量复合材料包裹在新生骨组织之间。这些结果证明了复合材料具有更好的骨诱导性，可有效促进骨缺损愈合，见图5，6。

2.6 实验组与对照组下颌骨标本新生骨骨密度比较结果各个时期内实验组新骨生成速率高于对照组，新生骨骨密度均值高于对照组(P均< 0.05)。

通过图像采集系统(Leica DM LS2型双目显微镜及Leica DFC320型 CCD)传入计算机，应用图像分析软件Image-ProPlus v5.1进行成骨细胞计数分析，比较两种材料对成骨细胞的生长促进作用，见表1。

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引言

材料方法

设计：对比观察动物实验。
时间及地点：于2011年10月至2012年5月在佳木斯大学完成。
材料：
实验动物及分组：3月龄健康雄性新西兰大白兔24只，由佳木斯大学动物中心提供，体质量2.0-2.5 kg，牙列完整，无龋坏及牙周病，分笼饲养。随机分为实验组与对照组，每组12只。
血小板衍生生长因子A基因修饰MC3T3细胞治疗牙槽骨缺损实验的主要试剂与仪器：
Main reagents and instruments:

实验方法：
复合材料的制备：
纳米羟基磷灰石预处理：将纳米羟基磷灰石切割成直径2.0-3.0 mm的颗粒状材料，灭菌消毒备用。
血小板衍生生长因子A重组质粒与纳米羟基磷灰石的复合：取2-4代血小板衍生生长因子A基因转染的MC3T3(成骨细胞细胞株)，用0.25%胰蛋白酶消化， 1 000 r/min离心5 min收集细胞，用无血清培养液洗2遍后，将细胞浓度调整至5×109 L-1，然后分别接种到纳米羟基磷灰石上，并负压抽吸使细胞悬液充分进入材料的多孔间隙中。2 h内无菌条件下将细胞-材料复合物植入到动物体内。
实验动物骨缺损制作及分组干预方法：10%乌拉坦 (10 mL/kg)耳缘静脉注射麻醉，以每只大白兔的双侧下颌骨下缘为实验区，常规备皮、固定、消毒、铺巾后，用机械性去骨的方法在双侧下颌骨下缘下颌角前方 1.5 cm，下颌骨体颊侧中下2/3处制备成10 mm×6 mm × 4 mm的人工牙槽骨缺损。按分组，对照组植入纳米羟基磷灰石，实验组植入血小板衍生生长因子A因子转染成骨细胞与纳米羟基磷灰石的复合物。充填完毕，依次缝合骨膜、肌肉层和皮肤层，碘伏再次消毒创口。术后单笼饲养，术后连续肌注盐酸庆大霉素3 d，流食喂养。术后第4，8，12周末以耳缘静脉空气栓塞的方式分别处死动物，每个时间点4只，分离下颌骨体，去除软组织，暴露骨缺损区，取兔完整的下颌骨标本，分别进行大体观察、锥形束CT观察、组织学观察及扫描电镜观察。
大体标本观察：观察术后动物一般情况，处死动物后，取下颌骨标本，大体观察骨缺损区内修复材料对骨组织的促进生长情况。
锥形束CT观察：检测骨缺损区密度、新骨形成情况、材料变化及其与周围组织结合状况。
组织学观察：苏木精-伊红染色，光学显微镜观察新骨生成情况。标本置于40 g/L中性多聚甲醛(pH=7.2)固定72 h，沿唇舌向将牙槽骨全层锯成3 mm厚的薄片，流水冲洗10 min。50%甲酸加7%氯化铝进行样品脱钙 5 d，40 ℃恒温磁力搅拌器搅拌脱钙，水洗12 h，梯度乙醇脱水(体积分数60%，70%，80%，90%，95%各3.0-4.0 h，体积分数100% 2.0-3.0 h)，正丁醇脱水12 h，二甲苯浸泡40 min，石蜡包埋，用LEICA-1600切片机将硬组织制成3-5 μm连续性切片，体积分数40%乙醇伸展片刻，置于温水中展平。70 ℃烤箱考片数小时，进行苏木精-伊红染色，脱水，透明，用光学树脂封固，在光学显微镜下进行成骨细胞，骨小梁，骨馅窝及新生血管修复情况观察。
扫描电镜观察：使用S-3000N扫描电子显微镜观察植入材料与原骨连接界面超微结构及材料降解情况。取材后以4%戊二醛固定72 h，PBS冲洗3次，15 min/次，梯度乙醇脱水(体积分数60%乙醇1 h，体积分数70%乙醇 1 h，体积分数80%乙醇1 h，体积分数90%乙醇1 h，体积分数95%乙醇1 h，体积分数100%乙醇1 h)，醋酸异戊酯置换3次，15 min/次。LEICA-1600型硬组织切片机切片处理，冷冻干燥后，用JSM-6360LV 扫描电镜检测比较两种材料与牙槽骨连接处的骨结合状况，加速电压20 kV，电流15 mA。
主要观察指标：两组下颌骨标本大体、锥形束CT、组织学及扫描电镜观察结果。
统计学分析：应用SPSS软件14.0 版本进行方差分析，所有实验数据用

表示。组间均数比较用t 检验。P < 0.05 时差异有显著性意义。

讨论

牙周炎是牙周支持组织的慢性疾病，在中国成年人群中70.87%-92.43%的个体患有不同程度的牙周疾患^[15]，随年龄增加，附着丧失增加，牙周疾病的严重性及危险增加，从而对患者健康和生活质量造成极大影响^[16]。重建牙槽骨是促进牙周组织再生的关键^[17-19]，移植材料应用于缺损是目前临床最常用的方法^[20-21]。牙周组织再生是牙周病学研究领域中的重要课题^[22]，目前热点之一是利用生长因子来促进、增强牙周前体细胞的活性，使其迁移并占据病损部位，增殖、分化，从而形成新的牙周组织，促进牙骨质再生。Park等^[23-24]用血小板衍生生长因子方法治疗犬根分叉病变，发现血小板衍生生长因子治疗方法中有骨组织再生。生长因子在组织修复过程中调节一系列关键的细胞活动，大量研究显示，生长因子能刺激牙周缺损区细胞再聚集，从而明显促进牙周组织的再生和修复。

实验通过CT片、组织学观察、扫描电镜观察以及成骨细胞计数等检测手段，验证了复合支架材料对骨组织不同程度的修复作用^[25]。研究结果表明，将血小板衍生生长因子A基因转染成骨细胞与纳米羟基磷灰石复合后，植入缺损部位，血小板衍生生长因子基因片段可与牙周组织细胞的DNA组合，从而不断合成血小板衍生生长因子。使用转染后的成骨细胞与纳米羟基磷灰石复合支架材料^[26]，克服了直接使用血小板衍生生长因子的一些缺点，使得产生半衰期延长，蛋白酶不易失活，载体生物相容性良好等优点。这主要是因为基因转染可以达到较为长期、高效、局部的效果，避免了直接应用生长因子时可能发生的过量反应和全身性不良反应。采用这一方法不仅可以获取具有旺盛生理功能的种子细胞，而且还能使种子细胞大量表达需要的目的蛋白利于组织构建。此外，Ad/PDGF-A基因转染，至少在96 h内可持续使酪氨酸激酶磷酸化^[27]，同时持续下调特异性生长抑制因子的产物血小板衍生生长因子αR[28]。有学者利用Ad/PDGF-A、PDGF/B基因转染人牙龈成纤维细胞在体外修复胶原三维晶体，检测表明血小板衍生生长因子基因转染有潜在促进牙周软组织修复的能力[29]。有研究在鼠体内直接腺病毒转染/血小板衍生生长因子B基因转染发现，血小板衍生生长因子不仅可以促进牙槽骨新生、牙周韧带形成，还可以增进新牙骨质形成。
综上所述，实验结果表明血小板衍生生长因子A与纳米羟基磷灰石复合成的新型材料，是一种理想的骨组织工程材料。

纳米羟基磷灰石复合基因转染生长因子修复牙槽骨缺损

Growth factor genetic modification and nano-hydroxyapatite composite for repair of alveolar bone defects

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