脂肪间充质干细胞复合血小板凝胶修复兔椎间盘退变

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.001

中国组织工程研究

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脂肪间充质干细胞复合血小板凝胶修复兔椎间盘退变

孟繁星^{1, 2}，李放^{1, 2}，叶超群²，阴彦斌²，高阳²

1解放军军医进修学院，北京市 102205
2解放军北京军区总医院全军创伤骨科研究所，北京市 100700

收稿日期:2013-02-07 修回日期:2013-04-18 出版日期:2013-05-21 发布日期:2013-05-21
通讯作者: 李放，博士，主任医师，硕士生导师，解放军北京军区总医院全军创伤骨科研究所，北京市 100700 fangl6722@vip.sina.com
作者简介:孟繁星★，男，1984年生，解放军军医进修学院在读硕士，主要从事脊柱外科方面的研究。 mengfanxing@sohu.com

Adipose-derived mesenchymal stem cells combined with platelet gel for repair of intervertebral disc degeneration in rats

Meng Fan-xing^{1, 2}, Li Fang^{1, 2}, Ye Chao-qun², Yin Yan-bin2, Gao Yang²

1 Chinese PLA Postgraduate Medical School, Beijing 100853, China
2 Department of Orthopedics, General Hospital of Beijing Military Area Command, Beijing 100700, China

Received:2013-02-07 Revised:2013-04-18 Online:2013-05-21 Published:2013-05-21
Contact: Li Fang, M.D., Chief physician, Master’s supervisor, Chinese PLA Postgraduate Medical School, Beijing 100853, China; Department of Orthopedics, General Hospital of Beijing Military Area Command, Beijing 100700, China fangl6722@vip.sina.com
About author:Meng Fan-xing★, Studying for master’s degree, Chinese PLA Postgraduate Medical School, Beijing 100853, China; Department of Orthopedics, General Hospital of Beijing Military Area Command, Beijing 100700, China mengfanxing@sohu.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：富含血小板的血浆凝胶作为三维支架使其中干细胞可以呈立体生长，同时富含血小板的血浆凝胶又释放大量生长因子，促进脂肪间充质干细胞增殖及分化。
目的：探讨脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体注入兔椎间盘退变模型后的修复作用。
方法：取兔动脉血采用二次离心法制备自体富血小板血浆，取兔肩胛间区脂肪分离培养脂肪间充质干细胞，制备脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体。新西兰大白兔随机分为对照组、模型组、富含血小板的血浆凝胶组和脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体组，后3组以穿刺法制备椎间盘退变模型，退变模型制备完成2周后，富含血小板的血浆凝胶组和脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体组分别对退变间盘中注射相应材料。
结果与结论：兔椎间盘退变后，间隙明显降低，髓核信号明显降低，髓核内基质高，密度染色较深；而经富含血小板的血浆凝胶和脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体治疗后，上述症状明显改善，且脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体的治疗效果更好。提示对退变椎间盘内注射富含血小板的血浆凝胶支架及脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体均有利于减少退变对椎间盘的影响，其中脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体注射效果更为突出。

关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 椎间盘退行性变, 富血小板血浆, 脂肪间充质干细胞, 组织工程, 髓核细胞, 影像学观察

Abstract:

BACKGROUND: Platelet-rich plasma gel serves as a three-dimensional scaffold in which stem cells can exhibit a three-dimensional growth. Meanwhile, platelet-rich plasma gel can release large amounts of growth factors to promote the proliferation and differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To explore the repair effect of injection of autologous platelet rich plasma-adipose derived mesenchymal stem cells complex on rabbit intervertebral disc degeneration.
METHODS: Rabbit arterial blood was extracted to prepare autologous platelet-rich plasma using secondary centrifugal method, and adipose-derived mesenchymal stem cells were isolated from the fat tissue of rabbit scapular area. Then, adipose-derived mesenchymal stem cells-platelet-rich plasma gel complex was prepared. New Zealand white rabbits were randomized into control group, model group, platelet-rich plasma gel group and complex group (adipose-derived mesenchymal stem cells-platelet-rich plasma gel complex). Intervertebral disc degeneration model was made in the latter three groups using puncture method. At 2 weeks after modeling, corresponding materials were injected into the disc in the four groups, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: After intervertebral disc degeneration in rabbits, the intervertebral gap was significantly reduced, the nucleus pulposus signal was obviously decreased, nucleus pulposus matrix appeared to have a high density and to be deeply stained. The symptoms above mentioned were improved significantly after intervention with the platelet-rich plasma gel or the complex of adipose-derived mesenchymal stem cells-platelet-rich plasma gel, while the latter was better in curative effects. Injection of platelet-rich plasma gel and adipose-derived mesenchymal stem cells-platelet-rich plasma gel complex can reduce the influence of disc degeneration, and the effect of adipose-derived mesenchymal stem cells-platelet-rich plasma gel complex is more outstanding.

Key words: biomaterials, tissue-engineered bone materials, disc degeneration, platelet-rich plasma, adipose-derived mesenchymal stem cells, tissue engineering, nucleus pulposus cells, imaging observation

中图分类号:

R318

孟繁星，李放，叶超群，阴彦斌，高阳. 脂肪间充质干细胞复合血小板凝胶修复兔椎间盘退变[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.001.

Meng Fan-xing, Li Fang, Ye Chao-qun, Yin Yan-bin, Gao Yang. Adipose-derived mesenchymal stem cells combined with platelet gel for repair of intervertebral disc degeneration in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.001.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析富含血小板的血浆凝胶支架组兔由于麻醉死亡1只，其余兔均进入结果分析。

2.2 培养脂肪间充质干细胞的形态兔脂肪间充质干细胞传至第3代时，采用细胞荧光染色DAPI染色液对贴壁细胞进行染色，分别用光学显微镜及荧光显微镜进行观察，可见脂肪间充质干细胞呈梭形，贴壁生长，见图2。

2.3 脂肪间充质干细胞复合血小板凝胶修复兔椎间盘退变对椎间盘高度的影响腰椎侧位X射线观察发现，造模前兔椎间盘间隙正常，造模后退变间盘间隙明显降低，与模型组相比，富含血小板的血浆凝胶组兔退变间盘高度有所恢复(P < 0.05)，而脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体组兔退变椎间盘高度较模型组及富含血小板的血浆凝胶组均明显增加(P < 0.05)，见图3，表1。

2.4 脂肪间充质干细胞复合血小板凝胶支架修复兔椎间盘退变对椎间盘退变的影响 MRI观察可见造模前兔各髓核内呈高信号，造模后退变间盘髓核信号明显降低，呈“黑间盘”，富含血小板的血浆凝胶组退变髓核中心部位T2相信号较模型组增高，脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体组退变髓核中心部位T2相信号较模型组明显增高，且信号高于富含血小板的血浆凝胶组，见图4。

2.5 脂肪间充质干细胞复合血小板凝胶支架修复兔椎间盘退变对椎间盘组织形态的影响苏木精-伊红染色可见造模前兔各髓核内基质高，密度染色较深，髓核细胞呈核深染胞浆淡染；造模后退变间盘内未见髓核细胞，基质密度低染色浅；富含血小板的血浆凝胶组基质染色较浅，可见少量髓核细胞；脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体组髓核内基质高，密度染色深；其内既包括胞浆淡染的髓核细胞，也包括胞浆染色较髓核细胞深的细胞(考虑为脂肪间充质干细胞分化而来)，见图5。

2.6 脂肪间充质干细胞复合血小板凝胶支架修复兔椎间盘退变对椎间盘显微结构的影响扫描电镜观察可见脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体组兔椎间盘髓核内基质饱满，其中含有较大的椭圆形细胞及髓核细胞，较小的圆形细胞即注射入的脂肪间充质干细胞，见图6。

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引言

由腰椎间盘退变引起的下腰痛是人类面临的重大健康问题之一，下腰痛给患者和社会带来了沉重的负担。目前针对椎间盘退变，常采用手术或保守治疗，虽然能够取得一定的治疗效果，但这些方法主要针对患者症状，不能够阻止椎间盘的退变^[1-2]，无法终止或逆转椎间盘退变及其引起的生物学功能丢失，而手术治疗甚至可加速临近节段的椎间盘退变。

椎间盘退变起始于髓核，髓核中分布有髓核细胞，其主要功能是：产生细胞外基质并维持其成分的稳定，在退变椎间盘中，髓核细胞明显减少，聚集蛋白多糖及Ⅱ型胶原蛋白含量明显降低。如何促进髓核细胞增殖及增强其活性，最终恢复退变髓核内细胞外基质中的蛋白多糖及胶原蛋白含量是治疗椎间盘退变的关键。

富含血小板的血浆凝胶具有形态双向性、三维纤维蛋白网状结构、激活后释放大量多种生长因子、无免疫原性，制备简单等优点^[3-8]。已先后应用于心血管外科、口腔外科、整形外科、骨科等领域。

随着近年来有关人体干细胞的研究开展，因脂肪间充质干细胞具有取材简便、多种分化潜能的优点，在生长动力学、细胞老化、基因转染和细胞的黏附特性等方面与骨髓间充质干细胞没有明显的差别等特点，被应用于感染性疾病、缺血性疾病、组织再生等各个领域。

目前脂肪间充质干细胞注入退变间盘^[9-12]，富含血小板的血浆凝胶修复退变椎间盘^[13-14]，脂肪间充质干细胞结合富含血小板的血浆凝胶离体培养均已取得较好的实验效果^[15-16]。但脂
肪间充质干细胞结合富含血小板的血浆凝胶注入退变动物模型的研究尚未开展。因此，实验拟采用兔腰椎间盘退变模型，通过植入脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体后，观察脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体对基质合成和降解代谢的影响，了解植入椎间盘的干细胞支架复合体内细胞增殖分化情况。

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2012年3月至12月在解放军北京军区总医院全军创伤骨科研究所完成。
材料：4月龄SPF级雌性新西兰大白兔30只，体质量2.0-2.5 kg，由军事医学科学院动物中心提供。采用实验室规范饲养，实验符合动物伦理学要求。
方法：
动物分组：新西兰大白兔随机分为对照组(n=5)、模型组(n=5)、富含血小板的血浆凝胶组(n=10)和脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体组(n=10)。
富含血小板的血浆凝胶的制备：抽取新西兰大白兔耳中央动脉血10 mL移入EDTA抗凝管中[1]。分别采用2次离心法对兔血进行离心：使用离心机以2 400 r/min离心 10 min，超净台内枪头吸取全部上清液、白膜层及以下2 mm的红细胞层，置入另一EDTA抗凝管中，以 3 600 r/min离心15 min，弃掉约3/4上清液，剩余液体约1.0 mL，吹打使下层物质重新悬浮后即为富含血小板的血浆凝胶。对富含血小板的血浆凝胶中血小板含量进行检测，测得全血中血小板浓度为(231.8±25.0)× 109 L-1，所制备富含血小板的血浆凝胶中血小板浓度为 (1 270.5±213.3)×109 L-1，为全血浓度的5.5倍，向富含血小板的血浆凝胶中加入1.0 mL DMEM培养液，冷藏待用^[17]。
兔脂肪间充质干细胞分离培养：兔麻醉后，无菌条件下取肩胛间区皮下脂肪，剔除血管、筋膜后，剪成糜状加入胶原酶．于37 ℃振荡消化60 min，加入体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，以200目筛网过滤后，将滤过的液体转移至离心管．离心弃去上清液．加入DMEM/F12培养基重悬细胞后移入培养瓶，置37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。 2 d后换液，以后每3 d换液1次，至细胞长满90%左右时，用胰酶消化并传代培养。细胞传至第3代时，采用细胞荧光染色DAPI染色液(美国Sigma公司)对贴壁的细胞进行染色，PBS冲洗去除未结合的荧光染色剂，使用荧光显微镜(日本Olympus公司)进行观察[16]。
椎间盘退变动物模型的制备：富含血小板的血浆凝胶组和脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体组兔以穿刺法制造退变兔椎间盘模型。将兔于造模前6 h禁食水，戊巴比妥钠麻醉后右侧腹部备皮，逐层切开皮肤、及皮下组织，钝性分离腰大肌及腹膜，达椎体侧前方，暴露L3/4，L4/5，L5/6椎间盘，见图1，以髂前上棘定位节段，1 mL注射器针头平行终板方向刺入，有落空感后回抽无血液抽出即确定穿刺成功，术后给予兔静电抗生素及补液治疗，定期换药防止实验动物死亡^[18]。

干细胞支架复合体制备及注射：于实验动物造模完成14 d后进行富含血小板的血浆凝胶及脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体注射，超净台内分别抽取富含血小板的血浆凝胶与脂肪间充质干细胞悬液(细胞浓度为1×1010 L-1)注入96孔板混匀，然后按2∶1比例进行混合，使用微量注射器注入实验2组退变椎间盘，手术方法同模型建立，微量注射器可穿入其内并伴随有落空感，可向其内注入微量液体，约为0.2 mL，注入后内部压力升高，可见微量注射器芯杆有轻度回弹,稍停留约1 min后缓慢拔出，并向退变椎间盘中注入 200 μL富含血小板的血浆凝胶激活剂(1 mL 10%CaCl2及60 U牛凝血酶)以激活富含血小板的血浆凝胶。
X射线观察椎间盘高度变化：于造模前及注射后8周分别取各组实验动物，拍摄腰椎侧位X射线片，由同一位放射技师测量实验节段椎间隙高度及其下位椎体高度，并以椎间盘高度指数及椎间盘高度指数作为衡量椎间隙高度变化的参考值。

MRI检查间盘退变情况：于造模前及注射后8周分别取各组实验动物，行连续MRI检查，获得腰椎T2加权像。观察各退变节段T2WI信号强度变化。
组织学及微观结构观察：对各组动物于注射后8周后采用戊巴比妥过量麻醉法处死，切取退变间盘，以多聚甲醛固定3 d后，脱钙处理，脱水后石蜡包埋，切片。行苏木精-伊红染色，观察组织学变化。各组中随机抽取3只行扫描电镜(日本日立公司)观察。
主要观察指标：脂肪间充质干细胞复合血小板凝胶支架修复兔椎间盘的效果。
统计学分析：使用SPSS 16.0统计软件(美国IBM公司)进行数据分析。组间比较采用t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

一个经典的组织工程系统一般由3个要素构成，即：种子细胞、生长因子和三维支架材料^[19]。种子细胞中，脂肪间充质干细胞是成体间充质干细胞的一种，具有自我更新和多向分化潜能，在生长动力学、细胞老化、基因转染和细胞的黏附特性等方面与骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞没有明显的差别。具有取材方便、来源广泛、获得的细胞多和供区损伤较小的特点，脂肪间充质干细胞已成为目前组织工程髓核较为理想的种子细胞。

富含血小板的血浆凝胶是全血经过离心获得的血小板浓缩物，具有如下特点^[20-21]：①形态双向性，便于注射，激活后可提供支撑力。②内部结构为纤维蛋白立体网状结构^[22]。③富含血小板，血小板被促凝剂激活后释放大量多种生长因子^[23-24]。④无免疫原性；以上特点为移植细胞的生长、稳定分化及基质合成提供良好的微环境。同时富含血小板的血浆凝胶制备简单，制作原料仅需抽取血液即可获得，相较其他支架材料在推广应用中具有有显著优势，目前被广泛应用以实现骨、软骨、韧带、脂肪组织的再生^[25]。

实验设计的脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体是一个完整的组织工程系统，其中脂肪间充质干细胞作为种子细胞，富含血小板的血浆凝胶作为三维支架使其中干细胞可以呈立体生长，同时富含血小板的血浆凝胶又释放大量生长因子，同时担当了支架材料及生长因子两种作用。富含血小板的血浆凝胶-脂肪间充质干细胞复合体中既含有可向髓核细胞转化的种子细胞，又有可以促进原有髓核细胞及新植入脂肪间充质干细胞的富含血小板的血浆凝胶支架支架，是目前人工髓核构建的理想材料。

实验发现，脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体组在注射8周后，使得退变后椎间隙高度由正常间盘的46.7%提高到86.6%，增高近1倍，恢复情况也较富含血小板的血浆凝胶组具有优势。

在注射8周后对各组进行MRI比较中，富含血小板的血浆凝胶-脂肪间充质干细胞复合体组较模型组髓核内T2像信号明显增高，说明其在减轻椎间盘退变上效果
明显。而单纯注射富含血小板的血浆凝胶组与模型组相比较，MRI检查髓核内T2信号增高，椎间隙出现一定程度增高。

通过病理检测发现，脂肪间充质干细胞复合体注入退变椎间盘后其中的脂肪间充质干细胞可存活增殖并向髓核内细胞进一步分化，而其中原有髓核细胞也较模型组多，观察基质染色较模型组深，证明脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体的注射可显著增高基质内容物含量，证明其中的髓核细胞及脂肪间充质干细胞具有较强生物学活性。扫描电镜观察可见注射入的脂肪间充质干细胞与原有髓核细胞形态有所不同，但都具有一定的数量，同时细胞外基质饱满，进一步证明了其中的髓核细胞及脂肪间充质干细胞具有较强生物学活性。

综上所述，文章分别将脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体、富含血小板的血浆凝胶分别注入兔退变椎间盘模型内，并与单纯退变组进行比较，得出了较为满意的结果。通过本实验论证，为该技术下一步应用于临床提供了依据。

由于本实验是动物实验，爬行与直立行走对脊柱生物力学的影响差别较大，是否对恢复间盘退变的效果产生影响，尚有待进一步研究；其次由于实验是在造模后2周即退变早期就对退变椎间盘加以干预，这与临床实际工作中就诊患者多为椎间盘退变发生时间较长的情况不符，脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体能否在在注入退变发生时间较长的椎间盘后取得良好效果，仍待进一步研究。

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延伸阅读

1脂肪来源干细胞组织工程及临床方面的应用：
脂肪来源的干细胞在组织工程及临床上的应用有以下几方面：①细胞治疗：直接将脂肪来源的间充质干细胞移植入体内，修复缺损组织、器官，或体外培养再生组织和器官，这将是医学史上的又一次革命。②作为基因治疗载体：联合基因转染技术，携带靶基因或生长因子基因，治疗遗传性疾病。③种子细胞的最佳选择，以其多项独特优势，成为组织工程的种子库来源，同时与可降解支架材料联合培养，体外构建有生命的种植体，修复组织缺损或替代器官的部分功能，治疗难治性疾病。④未来可筹建干细胞库，用于免疫缺陷性疾病，或将来自体病损组织和器官的修复，也可配型成功后，用于同种异体移植治疗。

2阻碍脂肪来源的干细胞在组织工程发展和临床应用的主要因素：
阻碍脂肪来源的干细胞在组织工程发展和临床应用的主要因素至少包括以下几点：①作为种子细胞修复骨、软骨组织时，细胞内分子学特性尚未完全清楚，且体外环境易诱导分化成脂肪细胞，形成的骨组织、软骨组织力学性能差，容易退化。②不同种属之间，不同组织部位来源的脂肪间充质干细胞分化潜能存在差异，究竟采用哪些组织部位来源脂肪间充质干细胞效果较好?③细胞外基质—聚合物支架的炎性反应、免疫原性和致癌性，支架材料的生物力学性能，植入体内的降解率无法达到临床应用标准，转基因细胞生物表达的调控及安全性。④脂肪来源的间充质干细胞与骨髓来源的间充质干细胞的各种生物学特性区别及作为种子细胞的安全性、可靠性等。相信未来，伴随着分子生物学、生物材料学、生物力学、计算机及纳米生物技术等相关学科技术的发展，脂肪来源的间充质干细胞在组织工程、细胞治疗、基因治疗中将具有广阔的应用前景。

脂肪间充质干细胞复合血小板凝胶修复兔椎间盘退变

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